Nanodeeltjesafgifte van artesunaat verbetert de antitumorefficiëntie door mitochondria-gemedieerde celapoptose te activeren

Abstract

Van artemisinine en zijn derivaten werd aangenomen dat ze een breed spectrum van antikankeractiviteiten uitoefenen, en ze veroorzaakten significante antikankereffecten in tumorcellen. Artemisinine en zijn derivaten konden snel worden geabsorbeerd, en ze werden wijd verspreid, waardoor tumorcellen selectief werden gedood. Aangezien lage concentraties van artesunaat voornamelijk afhankelijk waren van oncose om celdood in tumorcellen te induceren, waren de antitumoreffecten ervan ongewenst en beperkt. Om betere antitumoreffecten te verkrijgen, hebben we in deze studie gebruik gemaakt van een nieuwe nanotechnologie om nieuwe artesunaat-geladen runderserumalbumine-nanodeeltjes te ontwerpen om de mitochondriale accumulatie van artesunaat te bereiken en mitochondriaal-gemedieerde apoptose te induceren. De resultaten toonden aan dat in vergelijking met de afhankelijkheid van vrij artesunaat van oncotische dood, artesunaat-geladen runderserumalbumine-nanodeeltjes een hogere cytotoxiciteit vertoonden en hun significante apoptotische effecten werden geïnduceerd door de distributie van artesunaat in de mitochondriën. Deze bevinding gaf aan dat met artesunaat geladen runderserumalbumine-nanodeeltjes de mitochondriale integriteit beschadigden en mitochondriaal-gemedieerde celapoptose activeerden door apoptose-gerelateerde eiwitten op te reguleren en de snelle afgifte van cytochroom C te vergemakkelijken.

Achtergrond

Artemisinine en zijn derivaten zijn op grote schaal gebruikt bij de behandeling van malaria vanwege hun hoge antimalaria-activiteit en lage toxiciteit. Onderzoekers ontdekten ook dat artemisinine en zijn derivaten significante anti-tumoractiviteit vertoonden vanwege hun weinige toxische bijwerkingen en grotere tolerantie door patiënten [1]. Er werd gemeld dat artesunaat (Ats) zeker de groei van tumorcellen remde en verder significante antikankereffecten in tumorcellen induceerde [2,3,4]. Sommige experimenten gaven aan dat Ats na 48 uur verschillende graden van apoptose en oncose in tumorcellen veroorzaakte, en dat de graden van apoptose en oncose afhankelijk waren van de dosis Ats. Bij lage concentraties induceerde Ats geen duidelijke apoptose in tumorcellen en door Ats geïnduceerde celdood ging gepaard met oncose-achtige dood [5,6,7,8]. Om grotere antitumoreffecten te verkrijgen, werd een hogere dosering van Ats toegepast, maar dit bevestigde verder de ernstige toxiciteit en beenmergsuppressie. Daarom is het noodzakelijk om een effectieve behandeling te vinden om de effectieve dosering van Ats te verminderen om de anti-tumor efficiëntie te verbeteren [9,10,11]. Het bleek dat de mitochondriën een belangrijke rol speelden bij het reguleren van de apoptotische en oncotische effecten van Ats. De mitochondriën waren ook betrokken bij het reguleren van het transductieproces van een breed scala aan apoptotische signalen [12,13,14,15,16,17]. Toen de mitochondriën werden aangevallen door medicijnen, was de permeabiliteit ervan verbeterd en was het membraanpotentieel verminderd, wat leidde tot endometriale zwelling van het mitochondriale membraan en de snelle afgifte van cytochroom C uit de mitochondriën in het cytoplasma [18,19,20]. Bovendien werden enkele eiwitten uit de caspase-familie geactiveerd en werd de cascadereactie van celapoptose geïnduceerd.

Om de antitumoreffecten van Ats te versterken, werden veel nieuwe technieken geprobeerd om de distributie van het medicijn in tumorcellen te vergroten of om de gerichte afgifte van medicijnen in celorganellen te verbeteren om celdood te induceren [21,22,23]. Nanodeeltjes (NP's) als een belangrijk hulpmiddel bij gerichte kankerbehandeling zijn uitgebreid onderzocht en hebben een veelbelovend potentieel laten zien. Omdat NP's een kleinere deeltjesgrootte en een groot oppervlak hadden, konden ze de bloedcirculatie binnendringen via de haarvaten en door de endotheelcelopening gaan en naar de tumorplaats migreren, waardoor een geneesmiddelgerichte distributie werd bereikt en de biologische beschikbaarheid van het geneesmiddel werd verbeterd. . Bovendien zouden NP's de afgifte van het medicijn kunnen regelen door de afbraak van biomateriaal in een lang en soepel patroon, waardoor uiteindelijk de eliminatiehalfwaardetijd wordt verlengd, de effectieve bloedconcentratie wordt verbeterd en de doseringsfrequentie wordt verlaagd. Bovenal kunnen met medicijnen beladen NP's op specifieke locaties in de cellen worden afgeleverd, waardoor de werkzaamheid van de behandeling wordt verbeterd [24,25,26].

Om de antitumoreffecten van Ats bij lage concentraties te versterken, hebben we geprobeerd nieuwe Ats-geladen runderserumalbumine (BSA) NP's te ontwerpen. Vanwege de lage pH in de tumorcellen, de accumulatie van een groot aantal waterstofprotonen aanwezig op het buitenste mitochondriale membraan of in de intermembraanruimte, is het intermitochondriale membraan daarentegen rijk aan negatieve lading vanwege zijn chemische samenstelling en mitochondriamatrix secretie, die een elektropositieve buitenkant en een negatieve binnenkant transmembraanpotentiaal maakt, wat een gunstige afgifte van BSA kan veroorzaken. Dan zou de massale accumulatie van Ats in mitochondriën effectief mitochondria-gemedieerde apoptose kunnen veroorzaken. De resultaten toonden aan dat in vergelijking met de typische oncotische dood veroorzaakt door vrije Ats, Ats specifiek werd overgebracht naar de mitochondriën met de bemiddeling van BSA NP's en de mitochondriën-gemedieerde activering van apoptose-gerelateerde caspase-eiwitten bevorderde. Dit veroorzaakte significante celapoptose, waardoor de hogere cytotoxiciteit werd benadrukt.

Methoden

Materialen

BSA werd gekocht van Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, VS) en Ats werd gekocht van de Guilin Pharmaceutical Corporation (Guilin, Volksrepubliek China). SMMC-7721-cellen en Plc-cellen werden gekocht bij het Instituut voor Biochemie en Celbiologie van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, Volksrepubliek China). Alle andere gekochte chemicaliën waren van analytische kwaliteit; ze werden verkregen van verschillende leveranciers.

Voorbereiding en karakterisering van ATS-geladen BSA NP's

Volgens de eerder gerapporteerde literatuur [27] werden Ats-geladen BSA NP's bereid via een desolvatiemethode. In het kort werden met Ats geladen BSA-NP's bereid door snel 1,0 ml watervrije alcohol met een bepaalde hoeveelheid Ats bij 37 ° C in 0,5 ml BSA-oplossing te laten vallen tot opalescentie. Met de verwijdering van ethanol door roterende verdamping, werden met Ats geladen BSA NP's verder uit het medium geprecipiteerd en vervolgens werd 8% glutaaraldehyde in water (0,5 μL / mg BSA) toegevoegd om deeltjesverknoping te induceren onder roeren van de suspensie gedurende een periode van 24 uur. Ten slotte werden NP's verzameld en driemaal gewassen met gedeïoniseerd water om hun fysieke karakteriseringen, inclusief hun hydrodynamische diameter, polydispersiteitsindex (PDI), zeta-potentiaal en morfologie verder te analyseren met behulp van een Brookhaven Zetasizer (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, VS) en een transmissie-elektronenmicroscoop (JEM-1200EX; JEOL, Tokyo, Japan). Bepaling van de inkapselingsefficiëntie van Ats in BSA NP's werd geschat met behulp van een eerder gerapporteerde methode [27].

MTT-assay

Twee soorten tumorcellijnen, SMMC-7721-cellen en Plc-cellen, werden afzonderlijk geïncubeerd met 20% foetaal runderserum (FBS). De celgroeidichtheid werd aangepast tot l × l0⁶ cellen/ml door celtelling, en vervolgens werden de celsuspensies verdund tot l × l0⁵ cellen/ml. De verdunde suspensies werden verder afzonderlijk toegevoegd aan een plaat met 96 putjes (100 μL per putje, ongeveer 1 × 10⁴ cellen/putje) voor continue incubatie gedurende 24 uur bij 37 °C onder omstandigheden van 5% CO₂ en 95% O₂ . Het medium werd vervangen door serumvrij medium in aanwezigheid van vrije Ats of Ats-geladen BSA NP's met verschillende concentraties Ats, en het werd vervolgens 24 uur geïncubeerd. Een totaal van 50 μL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) (5 mg/ml) werd aan elk putje toegevoegd en gedurende 4 uur geïncubeerd voor beëindiging van de kweek. Toen de tetrazoliumkleurstof MTT werd gereduceerd tot zijn onoplosbare formazan, werden platen met 96 putjes gedurende 5 minuten bij 1000 tpm gecentrifugeerd en werd het supernatant van elk putje gedecanteerd, gevolgd door de toevoeging van 150 μL dimethylsulfoxide (DMSO), dat volledig loste de kristallen op. De absorptie van de oplossing werd gemeten met een microplaatlezer (Syneray-2; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, VS) bij 490 nm.

Intracellulaire distributie van de BSA NP-groep in cellen

SMMC-7721-cellen en Plc-cellen in de logaritmische fase werden geselecteerd en behandeld met digestie met trypsine; de celconcentratie werd aangepast tot l × l0⁶ cellen/ml. Vervolgens werden de gekweekte cellen toegevoegd aan een celkweekplaat met 6 putjes voor hechting, en het kweekmedium werd verwijderd, gevolgd door de toevoeging van rhodamine B-gelabelde BSA NP's. De kern werd gekleurd met Hoechst (blauw) gedurende 15 minuten bij 37 ° C en de mitochondriën werden gekleurd met Mitotracker Green FM. De locatie van BSA NP's in cellen werd gevolgd in de cellen met behulp van confocale laser scanning microscopie (FluoView FV10i; Olympus Corporation, Tokyo, Japan).

Mitochondriaal membraan potentiële verandering

JC-1 kan worden gebruikt om veranderingen in het mitochondriale membraanpotentiaal te bepalen. Toen het mitochondriale membraanpotentieel hoog was, kon JC-1 vrij door het celmembraan gaan en aggregaten vormen in de mitochondriën, die een rode fluorescentie vertoonden (excitatiegolflengte, 525 nm; emissiegolflengte, 590 nm); toen het mitochondriale membraanpotentieel was verlaagd, werd JC-1 overgebracht van de mitochondriale matrix naar het celcytoplasma om een groen fluorescerend monomeer te vormen (excitatiegolflengte, 490 nm; emissiegolflengte, 530 nm). SMMC-7721-cellen en Plc-cellen werden respectievelijk uitgezaaid in confocale schaaltjes om een dichtheid van l × l0⁶ te bereiken. cellen/ml voor continue incubatie gedurende 12 uur. Vervolgens werd het kweekmedium weggegooid en werd serumvrij kweekmedium met de dispersie van Ats of Ats-geladen BSA NP's aan de schaal toegevoegd. Na 9 uur werd het medium weggegooid en werden de cellen tweemaal gewassen met PBS, gevolgd door de toevoeging van 2 ml JC-1 in een concentratie van 2 μmol/L; de cellen werden vervolgens 30 minuten bij 37 ° C onder donkere omstandigheden geïncubeerd. Een laser scanning confocale microscoop (FluoView FV10i; Olympus Corporation) werd gebruikt om de beeldvormingsveranderingen in het mitochondriale membraan te observeren.

ROS-productiemeting en kleuring van het endoplasmatisch reticulum (ER)

Cellen werden geïncubeerd met 20% FBS en de celgroeidichtheid werd aangepast tot l × l0⁶ cellen/ml op celgetal; en vervolgens werden de celsuspensies verdund tot l × l0⁵ cellen/ml. De verdunde suspensies werden verder toegevoegd aan platen met 96 putjes (100 μL per putje, ongeveer 1 × 10⁴ cellen/putje) voor continue incubatie gedurende 24 uur bij 37 °C onder 5% CO₂ en 95% O₂ . Ten tweede werden vrije Ats en Ats-geladen BSA NP's gedurende 6, 12 en 24 uur met de cellen geïncubeerd, gevolgd door continue incubatie met 10 μM 2,7-dichloorfluoresceïnediacetaat (DCFH-DA; Sigma-Aldrich Co.) voor ongeveer 30 min. IJskoude PBS-buffer werd gebruikt om de cellen drie keer te wassen om de niet-geïnternaliseerde NP's te verwijderen. De intracellulaire DCF-fluorescentie-intensiteit, die wordt opgewekt bij 485 nm en uitgezonden bij 530 nm, werd gedetecteerd met behulp van een microplaatlezer (Synergy-2; BioTek Instruments) om de mate van oxidatieve stress te onderzoeken. De testgroepen werden 24 uur behandeld met SMMC-7721-cellen en Plc-cellen en de ER-Tracker Blue-White DPX-sonde (Molecular Probes, Eugene, OR, VS) werd aan de cellen toegevoegd voor incubatie gedurende 30 minuten. Na het weggooien van de laadoplossing en het wassen van de cellen met PBS, werd de morfologieverandering van de ER waargenomen door confocale laserscanningmicroscopie.

Evaluatie van celoncose en apoptose door flowcytometrie

Volgens het protocol van onze vorige studie [28] werd een annexine V-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) / propidiumjodide (PI) -kleuringstest gebruikt om de celoncose en apoptose te evalueren die wordt veroorzaakt door vrije Ats en Ats-geladen BSA NP's. Cellen werden gelyseerd met typsine en uitgezaaid in platen met zes putjes in een concentratie van l × l0⁶ cellen/ml gedurende 24 uur continue incubatie. Vervolgens werd het kweekmedium verwijderd en werd serumvrij medium met vrije Ats en Ats-geladen BSA NP's aan de putjes toegevoegd. Na behandeling werden de cellen verzameld en gesuspendeerd in Nicoletti-buffer (Beijing 4A Biotech Co., Ltd., Beijing, Volksrepubliek China) die PI- en FITC-gelabeld annexine V (AV-FITC) bevatte. De morfologische verandering van de cellen werd waargenomen door confocale laser scanning microscopie. Om de celapoptose en oncosis-snelheden te verifiëren die worden geïnduceerd door de met Ats geladen NP's, werden de percentages vroege apoptotische (Q4), oncotische (Q2), necrotische (Q1) en levende cellen (Q3) gekwantificeerd door flowcytometrie.

Western Blot-analyse van apoptose-gerelateerde eiwitten en cytochroom C in cellen

Een western-blot-assay werd uitgevoerd om de niveaus van relatieve eiwitten te bepalen wanneer vrije Ats of Ats-geladen NP's 24 uur werden geïncubeerd met SMMC-7721-cellen. Cellen werden gelyseerd met ijskoude radioimmunoprecipitatietest (RIPA) -buffer die een proteaseremmercocktail en fosfataseremmers bevatte (Roche, Basel, Zwitserland). Eiwitconcentraties werden bepaald met behulp van een gemodificeerde BSA-assaykit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) en genormaliseerd voordat ze werden geladen op 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) -polyacrylamidegelelektroforese (PAGE). De niveaus van de beoogde eiwitten werden gefotografeerd en geanalyseerd met behulp van een UVP-gelanalysesysteem (iBox Scientia 600; UVP, LLC., Upland, CA, VS).

Resultaten

Kenmerken van Ats-Loaded BSA NP's en onderzoek naar cellulaire levensvatbaarheid

In Fig. 1a, b werd waargenomen dat met Ats geladen BSA NP's een bolvorm vertoonden en dat ze homogeen gedispergeerd waren met een lagere PDI van 0,016. De gemiddelde deeltjesgrootte van met Ats geladen BSA NP's was ongeveer 99,9 ±-2,3 nm en de zeta-potentiaal was negatief en werd geschat op ongeveer –25,6 ±-4,3 mV. Het afgifteprofiel vertoonde een soepele en aanhoudende afgifte die werd getoond in figuur 1c. Vergeleken met de snelle afgifte van vrije Ats in medium in vitro, werd Ats gevangen in de kern van BSA NP's langzaam verspreid vanuit het binnenste van NP's in het medium en vertoonde een soepel en langdurig afgiftepatroon, dankzij de continue afbraak van BSA. Meer dan 85% van de vrije Ats werd binnen de eerste 6 uur volledig vrijgegeven, terwijl de totale cumulatieve hoeveelheid geneesmiddel die binnen een periode van 48 uur door de NP's in de media werd vrijgegeven 78,9% was. Dit gaf aan dat NP's de afgifte van het medicijn via de afbraak van biomaterialen in een lang en soepel patroon kunnen regelen, waardoor de eliminatiehalfwaardetijd wordt verlengd, de effectieve bloedconcentratie wordt verbeterd en de doseringsfrequentie wordt verlaagd.

Karakterisering van met Ats geladen BSA NP's. een TEM-afbeelding van met Ats geladen BSA NP's. b Dynamische lichtverstrooiing (DLS) analyse van de verkregen Ats-geladen BSA NP's. c Het in vitro afgifteprofiel van met Ats geladen BSA NP's in fosfaatgebufferde zoutoplossing met een pH van 7,4 bij 37 ° C gedurende 48 uur. Levensvatbaarheid van SMMC-7721-cellen (d ) en Plc-cellen (e ) na incubatie met verschillende hoeveelheden vrije Ats en Ats-geladen BSA NP's gedurende 24 uur. De gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SD (n = 3). ^# P < 0.05 versus de bijbehorende gratis Ats

MTT werd gebruikt om de remmende effecten van vrije Ats en Ats-geladen BSA NP's in SMMC-7721-cellen en Plc-cellen op verschillende tijdsintervallen te onderzoeken. De resultaten (Fig. 1d, e) toonden aan dat de cytotoxiciteit van vrije Ats toenam met de toename van de geneesmiddelconcentratie, en Ats-geladen BSA NP's vertoonden de geleidelijk verhoogde cytotoxiciteit. Dit bewees dat Ats en Ats-geladen BSA NP's de groei van tumorcellen remden en dat de remmingsverhouding afhankelijk was van de dosis Ats. Vergeleken met vrije Ats vertoonden Ats-geladen BSA NP's hogere cytotoxiciteit en hogere gevoeligheid in beide cellen, en ze resulteerden in grotere celremming. Zoals getoond in Fig. 1d, e, veroorzaakte behandeling van beide cellen met Ats-geladen BSA NP's een significante afname van de levensvatbaarheid van de cellen na 24 uur in vergelijking met die van vrije Ats. De 50% maximale remmende concentratie (IC50)-waarden voor de SMMC-7721-cellen en Plc-cellen behandeld met Ats-geladen BSA NP's waren respectievelijk 50,1 en 44,9 μg/ml na 24 uur, wat wordt vergeleken met de verkregen waarden van 69,2 en 74,9. μg/ml na 24 uur in cellen die zijn behandeld met vrije Ats. Dit gaf aan dat wanneer Ats werd geladen in BSA NP's, het zijn intracellulaire locatie zou kunnen veranderen, zoals gemedieerd door de NP's, en uiteindelijk meer cellen zou doden.

In vitro cellulaire opname van BSA NP's

De intracellulaire distributie en locatie van BSA NP's in beide soorten tumorcellen werden waargenomen door confocale laser scanning microscopie, zoals weergegeven in Fig. 2. Nadat rhodamine B-gelabelde NP's gedurende 3 uur samen met cellen waren gekweekt, was rode fluorescentie duidelijk te zien in het cytoplasma; met het verstrijken van de tijd werden de meeste BSA-NP's intracellulair geïnternaliseerd en verspreid in het cytoplasma, waarbij ze verbeterde tijdafhankelijke rode fluorescentie vertoonden. Er werd ook waargenomen dat BSA NP's die zich in het cytoplasma bevonden zich op dezelfde plaats bevonden als de mitochondriën, zoals blijkt uit het verschijnen van gele fluorescentie, wat erop wees dat de inherente rode fluorescentie van rhodamine B-gelabelde NP's en de groene fluorescentie uitgezonden door de mitochondriale indicator MitoTracker® green FM was samengevoegd. Dit bewees dat de geïnternaliseerde BSA-NP's specifiek konden worden geaccumuleerd in de mitochondriën, wat de mogelijkheid benadrukt dat Ats aan de mitochondriën kan worden afgeleverd met behulp van BSA-NP's.

De in vitro cellulaire distributie van BSA NP's na te zijn geïncubeerd met verschillende tumorcellen. Fluorescerend beeld van SMMC-7721-cellen (a ) en Plc-cellen (b ). Schaalbalk , 100 μm

Mitochondriale membraanpotentiaalanalyse

Om te verduidelijken of Ats-geladen BSA NP's interfereerden met de mitochondriale functie na de levering van Ats in de mitochondriën, werden veranderingen in het mitochondriale membraanpotentieel bepaald. Figuur 3 toonde aan dat na JC-1-kleuring het merendeel van de mitochondriën in tumorcellen die met vrije Ats waren behandeld, sterke rode fluorescentie en zwakke groene fluorescentie-intensiteit vertoonden. Dit suggereerde dat de meerderheid van JC-1 in een geaggregeerde staat bestond, wat de integriteit van het mitochondriale membraan en een hoger potentieel versterkte. Integendeel, toen JC-1 de met Ats geladen BSA NP's-behandelde cellen kleurde, vertoonden de mitochondriën in beide tumorcellen een sterkere groene fluorescentie, wat aangeeft dat het mitochondriale membraan ernstig beschadigd was en het potentieel ervan aanzienlijk was verminderd. Alles bij elkaar genomen bewees het dat Ats met succes werd afgeleverd in de mitochondriën met de bemiddeling van BSA NP's, wat resulteerde in mitochondriale membraandepolarisatie.

Beeldvorming van verandering van het mitochondriale membraanpotentieel na incubatie van vrije Ats en Ats-geladen BSA NP's met SMMC-7721-cellen en Plc-cellen. Schaalbalk , 100 μm

ROS-productiemeting en kleuring van de ER

Er werd algemeen bevestigd dat het genereren van een groot aantal ROS fosfolipideperoxidatie in het binnenste mitochondriale membraan kan veroorzaken en dat het ook een afname van het mitochondriale membraanpotentieel kan veroorzaken, wat resulteert in de snelle afgifte van cytochroom C. We gebruikten DCFH- DA als een fluorescerende sonde om de verandering van ROS te detecteren. DCFH-DA ging vrij door het celmembraan de cel binnen en werd door esterasehydrolyse in DCFH getransformeerd. Het gegenereerde DCFH kan niet door het celmembraan gaan en kan gemakkelijk in de cellen worden geladen. Intracellulaire ROS oxideerde niet-fluorescerende DCFH tot DCF met een groene fluorescerende kleur. Daarom kan DCF-fluorescentiedetectie het niveau van intracellulaire ROS aangeven.

Toen beide cellen gedurende een bepaalde periode werden behandeld met vrije Ats en Ats-geladen BSA NP's, was de hoeveelheid intracellulaire ROS ook verhoogd, wat een tijdsafhankelijke relatie aantoont. Vergeleken met vrije Ats was de generatie van ROS in SMMC-7721-cellen en Plc-cellen behandeld met Ats-geladen BSA NP's significant verbeterd. Figuren 4a toonden aan dat de ROS-niveaus in SMMC-7721-cellen en Plc-cellen die 48 uur waren blootgesteld aan Ats-geladen BSA NP's waren verhoogd tot respectievelijk 1,53-voudig en 1,28-voudig in vergelijking met SMMC-7721-cellen en Plc-cellen behandeld met gratis Ats. Dit ondersteunde het idee dat de NP's de productie van intracellulaire ROS versnelden. Vergeleken met de controlegroep en vrije Ats, en na behandeling met Ats-geladen BSA NP's, was de fluorescentiekleuringsintensiteit van de ER-Tracker Blue-White DPX als een ER-specifieke kleurstof significant verhoogd, wat suggereert dat ER-stress ook werd geactiveerd in de met Ats geladen met NP's behandelde cellen met een overeenkomstige toename van het ROS-niveau. Deze bevinding benadrukte dat Ats zich specifiek in de mitochondriën bevond, zoals gemedieerd door BSA NP's; dit leidde tot een significante toename van het niveau van zuurstofvrije radicalen in de cellen, waardoor de inductie van ER-stress werd geactiveerd en de mitochondriale route werd geactiveerd om caspase-afhankelijke cellulaire apoptose te induceren.

Kwantificering van ROS-generatie in cellen die op verschillende tijdstippen zijn behandeld met vrije Ats en Ats-geladen BSA NP's (a ). ER-kleuring met de ER-Tracker Blue–White DPX-sonde (b ). Schaalbalk , 100 μm. De gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SD (n = 3). ⁺ P < 0,05 versus de controlegroep om 12 u, *P < 0,05 versus de controlegroep om 24 u, ^# P < 0,05 versus de controlegroep om 24 uur

Evaluatie van celapoptose en necrose

Cellen werden behandeld met een annexine V-FITC/PI-kleuringstest. Levende cellen bonden niet aan Annexine V-FITC/PI, dus verscheen er geen fluorescentie. Apoptotische cellen bonden niet aan PI, maar ze werden gekleurd met Annexine V-FITC, wat groene fluorescentie opleverde. Integendeel, voor de oncotische cellen waren hun celmembranen tot op zekere hoogte beschadigd en werden de celkernen verwijd om in stukjes af te breken, waardoor ze zowel groene als rode fluorescentie vertoonden. Zoals getoond in Fig. 5a, werd, vergeleken met de controlegroep, wanneer vrije Ats en Ats-geladen NP's 24 uur met cellen werden geïncubeerd, sterke groene en rode fluorescentie in de cellen waargenomen, wat aangeeft dat vrije Ats en Ats-geladen BSA NP's geïnduceerde tumorceloncose en apoptose. Vooral na behandeling met Ats-geladen BSA NP's, waren de kleuringsfluorescentie-intensiteiten verkregen uit Annexin V-FITC en PI significant verhoogd, wat suggereert dat de mate van oncose en apoptose significant verhoogd waren in de met Ats geladen NP's behandelde cellen.

Morfologie van de ultrastructurele veranderingen van cellen die zijn behandeld met vrije Ats en Ats-geladen BSA NP's met behulp van Annexin V-FITC/PI-kleuringstest (a ). Schaalbalk , 100 μm. Flowcytometeranalyse van de cellulaire apoptose en oncose na 24 uur incubatie met respectievelijk de vrije Ats en Ats-geladen BSA NP's (b )

De percentages vroege apoptotische (Q4), oncotische (Q2), necrotische (Q1) en levende cellen (Q3) werden getoond in Fig. 5b. Deze bevinding toonde aan dat wanneer cellen werden behandeld met vrije Ats, de oncotische snelheden geleidelijk werden verhoogd tot 24,4 en 4,6%, en de apoptotische snelheid bleef op 4,9 en 7,1% in respectievelijk SMMC-7721-cellen en Plc-cellen, wat suggereert dat vrije Ats veroorzaakte het optreden van oncose en apoptose om tot celdood te leiden. Integendeel, Ats-geladen BSA NP's verbeterden de snelheid van celapoptose en oncose aanzienlijk. De apoptotische verhoudingen waren significant verhoogd tot 10,9% in SMMC-7721-cellen en tot 11,5% in Plc-cellen. De oncotische verhoudingen waren verhoogd tot 29,0% in SMMC-7721-cellen en tot 21,6% in Plc-cellen. Dit gaf aan dat de mitochondriale afgifte van Ats met de bemiddeling van BSA NP's de dood van tumorcellen versnelde door de oncotische en apoptotische effecten te versterken. Ats-geladen BSA NP's activeerden het apoptotische signaaltransductieproces en bevorderden de mitochondriaal-gemedieerde cascadereactie van cellulaire apoptose.

Western Blot-analyse

Om de afhankelijkheid van celdood van de apoptose geïnduceerd door vrije Ats en Ats-geladen NP's te onderzoeken, werd een western blot-assay uitgevoerd om de expressie van apoptose-eiwitten te detecteren. Er werd gevonden dat in met Ats beladen met NP's behandelde SMMC-7721-cellen het intracellulaire expressieniveau van het Bax-eiwit significant was verhoogd (figuur 6). Deze bevinding suggereerde dat met behulp van BSA NP's Ats zich ophoopte in de mitochondriën en mitochondriale disfunctie veroorzaakte. Het cytoplasmatische Bax-monomeereiwit werd overgebracht naar het buitenmembraan van de mitochondriën en onderging oligomerisatie, waardoor een eiwitkanaal in het buitenmembraan van de mitochondriën werd gevormd, wat verder leidde tot een toename van de membraanpermeabiliteit. Het expressieniveau van cytochroom C in het cytoplasma was ook bijzonder en significant verhoogd, en de expressies van caspase-3 en caspase-9 bleken een opwaartse trend te vertonen. Daarom, als gevolg van de hogere membraanpermeabiliteit van de mitochondriën, werd cytochroom C snel afgegeven in het cytoplasma, waardoor celdood-signalerende eiwitten (caspases) werden geactiveerd en de cascadereactie van cellulaire apoptose werd bevorderd. Daarentegen had vrij Ats geen significant verschil in de expressie van apoptose-gerelateerde eiwitten en cytochroom C, wat suggereert dat vrij Ats geen mitochondria-gemedieerde celapoptose veroorzaakte en het voornamelijk vertrouwde op oncose om tot celdood te leiden. BSA NP's versterkten de accumulatie van het medicijn in de mitochondriën en activeerden mitochondriaal-gemedieerde apoptotische effecten, wat leidde tot significante apoptose en verhoogde expressie van de primaire apoptose-relevante eiwitten, zoals aangetoond in onze western blot-analyses.

Western-blot-analyses van de expressieniveaus van gesplitst caspase-3, caspase-9, Bax en cytochroom C in SMMC-7721-cellen. *P <-0,05 versus de Bax-eiwitexpressie van de controlegroep; ^# P <-0,05 versus de gesplitste caspase-3-expressie van de controlegroep; ⁺ P <-0,05 versus de caspase-9-eiwitexpressie van de controlegroep; ^x P < 0,05 versus de cytochroom C-eiwitexpressie van de controlegroep. Gegevens werden gepresenteerd als de gemiddelde ± SD (n = 3)

Discussie

Oncose en apoptose vertegenwoordigen de twee verschillende manieren waarop cellen de dood ondergaan. Apoptose is een actief proces van geprogrammeerde celdood dat optreedt in meercellige organismen. Oncose daarentegen beschrijft een caspase-onafhankelijke celdood die wordt gekenmerkt door zwelling, verhoogde permeabiliteit en membraanbreuk, wat vaak necrose wordt genoemd. Deze vorm van celdood wordt verondersteld per ongeluk en ongecontroleerd te zijn. Op basis van ons onderzoek ontdekten we dat Ats de groei van tumorcellen remde en dat de remmingsverhouding afhankelijk was van de dosis Ats. Ats hing voornamelijk af van de mate van oncose en leidde tot celdood; het activeerde ook caspase-onafhankelijke celdood in de vorm van oncose. Omgekeerd, en los van het optreden van duidelijke oncose-achtige dood, wanneer tumorcellen werden behandeld met Ats-geladen BSA NP's, werden Ats-geladen BSA NP's geïnternaliseerd in het cytoplasma en snel gelokaliseerd in de mitochondriën om Ats vrij te maken, zoals gemedieerd door de NP's. Ats in de mitochondriën genereerde ROS en veroorzaakte ER-stress; het activeerde verder de mitochondria-gemedieerde caspase-afhankelijke celapoptotische route door het mitochondriale membraanpotentieel te verminderen, cytochroom C vrij te geven en de eiwitexpressies van Bax, gesplitst caspase 3 en caspase 9 te bevorderen. Alles bij elkaar genomen verhoogden Ats-geladen BSA NP's de mitochondriale afgifte van Ats en verhoogde de mate van oncose en apoptose om celdood te induceren, waardoor de cytotoxiciteit van het medicijn werd verhoogd en significante celdood werd veroorzaakt.

Conclusies

In het kort hebben we verduidelijkt dat vrij Ats in de tumorcellen sterk afhankelijk was van de mate van oncose om de proliferatie van tumorcellen in de vorm van een oncose-achtige dood te remmen; thus, the cytotoxicity of the drug was limited and undesirable. In contrast, Ats-loaded BSA NPs activated the mitochondrial apoptotic pathway and simultaneously triggered oncotic effects; together, they enhanced the synergistic anti-tumor efficacy of Ats. The results of this study highlighted the significance of Ats-loaded BSA NPs in the enhancement of the cytotoxic and apoptotic effects of Ats, and they further signify the role of BSA NPs in diversifying the pathways of cell death induced by Ats. Compared with free Ats, Ats-loaded BSA NPs induced greater cytotoxicity and significant cell apoptosis effects in tumor cells.

Glijdende snelheidsafhankelijke tribochemische slijtage van oxidevrij silicium Tm3+ gemodificeerd optisch temperatuurgedrag van transparant, met Er3+ gedoteerd zeshoekig NaGdF4-glaskeramiek

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal