Analyse van actine en focale adhesieorganisatie in U2OS-cellen op polymeernanostructuren

Resultaten

Met behulp van eerder vastgestelde protocollen hebben we glazen dekglaasjes gefabriceerd die zijn versierd met nauwkeurig gedefinieerde arrays van verticaal georiënteerde SU-8-nanopilaren (NP) met variabele scheiding en gedefinieerde geometrie [63]. Oppervlakken met NP-oppervlaktedichtheden van 456, 205, 115 en 29 NP's/100 μm ² (overeenkomend met pitches van 500 nm, 750 nm, 1000 nm en 2000 nm) werden gebruikt. Eerst onderzoeken we algemene trends in celmorfologie, structuur van actine-cytoskelet en cel-substraat interacties. We volgen dit door kwantitatieve vergelijking van cel- en FA's-morfologie op verschillende nanogestructureerde substraten en vlakglascontroles. We combineren microscopie met hoge resolutie met fabricage met hoge doorvoer om kwalitatieve analyses uit te voeren van ten minste \({\circa 100}\) cellen voor elk oppervlaktype, met beeldvorming na 24 uur en 48 uur. In totaal analyseren we> 400 afbeeldingen met hoge resolutie en 20 3D-datasets.

Figuur 7 toont een schematische weergave van de NP-arrays (A, B) en elektronenmicroscopiebeelden van gefabriceerde substraten (C, D). Glasplaatjes met nano-gefabriceerde structuren werden gemonteerd met behulp van paraffine onder een holle bodem, 35 mm-cultuur met de structuren naar boven gericht. Top-down en getiteld zijaanzicht elektronenmicroscopiebeelden getoond, in Fig. 1C,D tonen nano-pijlerarrays met een toonhoogte en hoogte van 1000 nm. Tabel 1 toont geometrische parameters van arrays die in dit werk zijn gebruikt, hun classificatie, evenals de overeenkomstige dichtheid van het NP-gebied. We classificeren NP-arrays in dicht en dun, afhankelijk van het waargenomen celadhesiegedrag (zie hieronder).

Figuur 1 toont representatieve U2OS-cellen die 24 uur op glas (A) en nanogestructureerd oppervlak (B-F) zijn gekweekt. De cellen zijn gecotransfecteerd met pCMV-LifeAct-GFP en pTAG-RFP-Vinculin, wat de visualisatie van F-Actin en vinculine mogelijk maakt door de productie van respectievelijk fluorescerende LifeAct-TagGFP2 (hierna:LifeActGFP) en TagRFP-vinculine-fusie-eiwitten. F-actinenetwerk en vinculinerijke gebieden in FA's worden duidelijk gedetecteerd. Aan de celperiferie bevindt het LifeActGFP-signaal zich dicht bij het membraan en daarom gebruiken we dit signaal om de celmorfologie te visualiseren. Signaal van SU-8 NP's wordt in blauw weergegeven (zie het gedeelte 'Experimenteel').

U2OS die fluorescerende LifeActGFP (groen) en TagRFP-vinculine (rood) uitdrukt op verschillende oppervlaktetypes. Gele kleuring geeft overlappende signalen van LifeActGFP- en TagRFP-vinculinekanalen aan. Onder elke microfoto wordt een schematisch zijaanzicht van de corresponderende NP-array getoond, samen met de geschatte positie van het acquisitievlak. Cellen afgebeeld op A niet-gestructureerd vlak glasoppervlak en op pilaararrays met verschillende array-pitch en structuurhoogten:B 500 nm pitch en 500 nm hoogte, C 1000 nm pitch en 500 nm hoogte, D 750 nm pitch en 1000 nm hoogte, E 1000 nm pitch en 1000 nm hoogte, en F 2000 nm pitch en 1000 nm hoogte. Alle gepresenteerde afbeeldingen zijn van representatieve cellen. Schaalbalk 25 m. Merk op dat C heeft een andere schaal dan de andere afbeeldingen

Voorlopige tests met getransfecteerde cellen toonden aan dat cellen die op zowel glazen als gestructureerde oppervlakken waren gezaaid, na ongeveer 6 uur volledig verspreid leken te zijn. Er werden geen duidelijke verschillen in celspreiding tussen de verschillende oppervlakken waargenomen, en visuele inspectie onthulde geen tekenen van verminderde levensvatbaarheid van de cellen als gevolg van de pijlerarrays op dit punt of in latere experimenten. In de volgende experimenten werden cellen 6 uur na het zaaien getransfecteerd en vervolgens 24 uur, 48 uur na transfectie afgebeeld, wat overeenkomt met transfectie 30 uur, 54 uur na het zaaien. In het volgende zullen deze twee tijdstippen worden aangeduid door de observatietijd na het zaaien, dat wil zeggen 24 uur, 48 uur.

Cellen werden gezaaid op NP-arrays met een hoogte van 500 nm, 1000 nm en een pitch van 750 nm, 1000 nm, 2000 nm. Na de aanvankelijke verspreiding werd waargenomen dat de cellen rond of langwerpig waren, vergelijkbaar met de situatie op vlakke oppervlakken. Deze algemene morfologie bleek consistent te zijn over meerdere experimenten. Cellen die op schaarse NP-arrays waren gezaaid, hadden over het algemeen een vorm die vergelijkbaar was met de cellen op het glasoppervlak, zie figuur 1F die een representatieve cel afbeeldt op een array van 2000 nm. F-actinevezels waren ook aanwezig aan de basis van de NP's en in de buurt van het glasoppervlak, wat aangeeft dat de cellen toegang hadden tot het gebied dicht bij het substraat. Zoals eerder waargenomen [45, 62, 64], leken cellen op dichte arrays typisch op de NP's te hangen (Fig. 1B, D, E). Cellen op dichte arrays lijken minder prominent F-actine dicht bij het glasoppervlak te hebben, wat aangeeft dat de actinevezels niet werden gevormd tussen pilaren in de buurt van het substraat. De relatie tussen NP-hoogte en scheiding bepaalde of de cellen aan het substraat hechtten of aan de bovenkant van de NP-array waren opgehangen. Dit wordt bijvoorbeeld geïllustreerd in Fig. 1C, waar kortere NP's ertoe leiden dat de cel in contact komt met het substraat, terwijl langere NP's contact belemmerden, Fig. 1E. Deze waarnemingen van actinevezels werden verder bevestigd door z-stacks uitgevoerd voor sommige van de oppervlakken, zoals weergegeven in figuur 2.

Om een ​​meer gedetailleerd begrip te krijgen van hoe cellen zich hechten aan het gestructureerde en niet-gestructureerde oppervlak, hebben we de distributie van FA's geëvalueerd, zoals gevisualiseerd door de aanwezigheid van TagRFP-vinculine-fusie-eiwit. Cellen op vlakke oppervlakken vormden typisch langwerpige FA's die onder het hele cellichaam waren verdeeld, zoals weergegeven in figuur 1A.

Op schaarse arrays was U2OS in staat om contact te maken met het glasoppervlak tussen NP's en op dezelfde manier te hechten aan cellen op glas, getoond in Fig. 1C, F. Voor deze NP-arrays vormden FA's op glas tussen NP's en het F-actine-signaal werd ook gedetecteerd in het beeld dat dicht bij de basis van de NP's was verkregen. Dit gaf aan dat de cellen het membraan om de nanostructuren konden buigen. Cellen op dichtere arrays, zoals 750 nm, 1000 nm scheiding en 1000 nm hoogte, werden echter duidelijk belemmerd om zich aan het substraat tussen de nanostructuren te hechten, zoals weergegeven in afbeeldingen Fig. 1D, E die dicht bij de basis van de NP's. Rond de periferie waren de cellen echter meestal in staat om zich te hechten aan het substraat tussen de nanostructuren die FA's vormden, vaak gestuurd door de symmetrie van de onderliggende pijlerarray.

Cellen die zich verspreidden op NP-arrays met een kortere lengte en met een inter-pijlerafstand van 1000 nm vormden verklevingen zowel naar de periferie als onder het cellichaam. De oriëntatie van de F-actinevezel werd bepaald door de symmetrie van de onderliggende array, zoals weergegeven in figuur 1C. De locatie en oriëntatie van vinculine-bevattende FA's vertoonden echter geen duidelijk patroon, waarbij FA zich tussen NP's vormde.

U2OS-cellen op pilaren van 500 nm met een afstand tussen de pilaren van 500 nm vormden over het algemeen minder en kleinere verklevingen in vergelijking met het vlakke oppervlak zoals weergegeven in figuur 1B. Voor cellen die op deze array waren gezaaid, werden actinevezels voornamelijk waargenomen in de nabijheid van het glasoppervlak op posities waar ze eindigden in FA's. Nogmaals, dit is een teken dat het actinenetwerk werd verhinderd om contact te maken met het oppervlak, en daarom werd aangenomen dat de cellen bovenop de array waren opgehangen. Cellen leken echter meer intact F-actine-netwerk te hebben dat zich boven de pilaren vormde. Delen van het actinenetwerk dat tussen de pijlers werd waargenomen, leken uit te lijnen met structuren in de onderliggende NP-array. Dit is te zien in figuur 1B, aangezien F-actinevezels en FA's zich voornamelijk vormen langs een van de roosterrichtingen, d.w.z. evenwijdig aan open "lijnen", van de pilaararray.

Op zowel dichte als schaarse arrays hebben we "ringachtige" F-actine-structuren waargenomen die zich rond NP vormden en naar boven uitsteekt in het cellichaam. De F-actine-ringstructuur leek prominenter te zijn op dunne arrays, zoals weergegeven in Fig. 1E, F.

A Beelden van U2OS-cellen op verschillende oppervlakken werden verkregen op drie aangegeven brandpuntsvlakken. Beelden werden dichtbij de pilaarbasis verkregen, ongeveer op halve pilaarhoogte, en dicht bij de pilaartop. De beeldvormingsvlakken bevonden zich 0,0 m, 0,4 m, 0,8 m van het vlakke glasoppervlak. B –D ) Samengevoegde fluorescentiebeelden die U2OS tonen die fluorescerende LifeActGFP (groen) en TagRFP-vinculine (rood) tot expressie brengen op verschillende oppervlaktetypes, gele kleur is indicatief voor overlappende LifeActGFP en TagRFP-vinculine. Afgebeelde oppervlakken waren B niet-gestructureerd glazen oppervlak, C 1000 nm pitched column-array, D 2000 nm pitched pijlerarray. Gepresenteerde afbeeldingen zijn representatief voor cellen op elk oppervlaktype. De verticale afstand tussen brandvlakken voor elk type oppervlak is ongeveer 400 nm. Schaalbalken 25 μm

Op basis van de hierboven gepresenteerde resultaten hebben we drie oppervlakken geselecteerd voor een meer gedetailleerde en kwantitatieve beschrijving van celmorfologie en FA's. We bestuderen cellen op dichte arrays (pitch 1000 nm, lengte 1000 nm), dunne arrays (pitch 2000 nm, lengte 1000 nm) en vergelijken de resultaten met cellen op vlakke glazen oppervlakken die als controle worden gebruikt.

Door de Airyscan-detector te gebruiken in combinatie met de speciale nabewerking van het beeld, waren we in staat om beeldvorming uit te voeren met een xy-resolutie van ongeveer 140 nm en een z-resolutie van ongeveer 400 nm [65]. Figuur 2 toont afbeeldingen van cellen op de drie oppervlakken, met beeldvlakken die ongeveer 400 nm van elkaar zijn gescheiden. Het onderzoek van F-actinebundels op verschillende z . Cellen op een plat oppervlak hadden een duidelijk zichtbaar F-actine-netwerk in hetzelfde brandpuntsvlak of recht boven de FA's (zie figuur 2-B2). Voor cellen op dichte arrays werd het F-actine-netwerk gevonden op een hoger brandpuntsvlak in de cel in vergelijking met het FA-vlak, dat in contact stond met de glazen steun (Fig. 2-C1 en C2/C3). Voor cellen op dunne arrays was de situatie vergelijkbaar met de cel op glazen controles en actinenetwerk en FA's werden op dezelfde hoogte gedetecteerd (Fig. 2-D2). Deze gegevens ondersteunen de eerste waarneming dat cellen op dunne arrays het oppervlak tussen de structuren bevestigden, terwijl cellen op dichte arrays zich voornamelijk konden hechten aan het oppervlak rond de celperiferie.

Om de verschillen in FA's en celmorfologie voor de drie geselecteerde oppervlakken te analyseren en te kwantificeren, werd een op Python gebaseerd beeldanalysescript gebruikt (zie "Experimenteel"). Voor de kwantitatieve analyse werden meer dan 300 afbeeldingen met een hoge resolutie geanalyseerd. In deze afbeeldingen werden> 400 cellen en> 7700 FA's geïdentificeerd, tabel 2 geeft het aantal gedetecteerde cellen en FA's weer voor de drie oppervlaktetypen die in de analyse zijn opgenomen. Voor alle oppervlakken werden cellen zowel 24 uur als 48 uur na transfectie afgebeeld. In de volgende analyse worden geometrische parameters zoals oppervlakte, circulariteit en aspectverhouding voor cellen op 3 oppervlaktetypes en na 24 uur, 48 uur vergeleken. Aanvullende analyse is te vinden in de aanvullende informatie. Oppervlakte, circulariteit en aspectverhouding voor cellen worden getoond in Fig. 3 en voor aantal FA's, gecombineerd FA-gebied per cel en fractie van FA-gebied tot cel in Fig. 4. De geometrische parameters werden gedefinieerd zoals beschreven in de "Experimentele" sectie.

Berekend celoppervlak, celcirculariteit en cel-aspectverhouding voor U2OS-cellen die fluorescerende LifeActGFP- en TagRFP-vinculine-fusie-eiwitten tot expressie brengen op verschillende oppervlakken, afgebeeld 24 uur en 48 uur na transfectie. De beelddetectie werd uitgevoerd op basis van de intensiteit van het LifeActGFP-signaal. Elk grijs punt komt overeen met één cel en de boxplots tonen mediaanwaarden (Q 2) evenals de eerste (Q 1) en derde kwartiel (Q 3). Statistische verschillen tussen de verdelingen werden beoordeeld met behulp van de Mann-Whitney niet-parametrische test

Figuur 3 geeft een overzicht van de verzamelde gegevens voor zowel vlakke als gestructureerde oppervlakken. Zoals getoond in Fig. 3A, werden significante verschillen in het celgebied waargenomen na 24 uur celkweek. Na 48 uur was er echter geen significant verschil tussen het gemiddelde celoppervlak op bestudeerde oppervlakken. Bij het beschouwen van celcirculariteit (Fig. 3B), werden geen significante verschillen gedetecteerd tussen verschillende oppervlakken, behalve tussen cellen die waren gezaaid op dichte en dunne pilaren die na 24 uur werden afgebeeld. Cellen op alle drie de oppervlakken hadden dezelfde gemiddelde beeldverhoudingen, zoals weergegeven in Fig. 3C.

Aantal FA's, gecombineerd FA-gebied per cel en fractie van FA-gebied tot celgebied voor cellen afgebeeld op drie verschillende oppervlaktetypes (platte en pilaararrays met pitches van 1000 nm en 2000 nm). Elk grijs punt komt overeen met een waarneming uit één cel. Statistische significantie tussen de verdelingen werd bepaald met behulp van Mann-Whitneys niet-parametrische test

Figuur 4 toont de verdeling van het aantal gedetecteerde FA's per cel, het totale oppervlak van FA's in elke cel en de verhouding van het FA-gebied tot het celoppervlak. Na 24 uur was het aantal FA's gevormd door cellen op de drie verschillende oppervlakken significant verschillend. Zoals getoond in Fig. 4B, was het totale FA-oppervlak per cel verschillend voor cellen die waren gezaaid op vlakke en gestructureerde oppervlakken. Hetzelfde kan worden gezien bij het vergelijken van de relatieve hoeveelheid FA's (het totale gebied van gedetecteerde FA's gedeeld door het totale celoppervlak) voor de verschillende oppervlakken, zoals weergegeven in Fig. 4C.

Na 48 uur kweken werden echter geen significante verschillen tussen celpopulaties meer waargenomen. Bij het beschouwen van het aantal FA's per cel, gecombineerd FA-gebied per cel of FA-oppervlaktefractie, werden geen verschillen tussen de drie oppervlakken gevonden.

Voorbeeldcel op zuilarray van 2000 nm die A . uitdrukt LifeActGFP (groen) en B TagRFP-vinculine (rood). Op beide figuren wordt de gedetecteerde celrand gesuperponeerd die is bepaald met behulp van het signaal van de expressie van LifeActGFP (zoals weergegeven in A ). C Toont een afstandskaart vanaf de gedetecteerde celrand en gedetecteerde FA's. De kortste afstand (aangeduid met d in figuur) van elke gesegmenteerde vinculine-vlek (witte gebieden) tot de celperiferie (aangegeven met een ononderbroken witte lijn) werd berekend voor alle FA's in de afbeeldingen

Om te begrijpen of de aanwezigheid van NP's de lokalisatie van FA's in de cel beïnvloedt, hebben we verdere analyse uitgevoerd met behulp van de locatie van de FA's. Microscopiegegevens gaven aan dat FA's in cellen op dichte NP-arrays zich dichter bij de celperiferie bevonden, zoals aangegeven door Fig. 1 en 2. Om deze trend te kwantificeren, hebben we de kortste afstand van elke FA tot de celrand berekend. Dit werd uitgevoerd zoals geïllustreerd in Fig. 5. F-actine werd gebruikt om de locatie van de periferie te bepalen en door afstandskaarten te construeren, werd de afstand tussen elk centrum van een gedetecteerde FA tot de celperiferie berekend. Om rekening te houden met verschillen in celgroottes, hebben we de afstanden tussen de gedetecteerde celrand en FA genormaliseerd met de maximale afstand van de rand tot het geometrische midden voor elke cel (een afstand die gelijk is aan de straal voor cellen met een cirkelvorm). Gegevens genormaliseerd door de maximale afstand worden weergegeven in Fig. 6 en Tabel 3. Voor cellen op vlakke oppervlakken zijn de FA's meer naar het midden van de cel verdeeld, terwijl op zowel dunne 2000 nm-arrays als dichte 1000 nm-arrays de FA's bevinden zich dichter bij de celperiferie. Dit effect is het meest opvallend voor dichte arrays met een pitch van 1000 nm. Resultaten van een alternatieve normalisatiebenadering, waarbij de FA-locaties werden genormaliseerd op celoppervlak, zijn opgenomen in aanvullende informatie. Deze gegevens tonen dezelfde kwalitatieve trends als de gegevens genormaliseerd door de maximale afstand tot de rand in elke cel weergegeven in Fig. 6.

Verdeling van FA's-posities in relatie tot de dichtstbijzijnde celrand genormaliseerd door de maximale afstand van het geometrische midden van de cel tot de rand. Afstanden werden verkregen door de afstand te berekenen van elke waargenomen FA tot de celrand gedefinieerd door het LifeActGFP-signaal en uitgezet voor de drie oppervlaktetypes na 24 uur en 48 uur. Grijze punten vertegenwoordigen individuele waarnemingen van FA's en hun distributies zijn samengevat in de boxplots. Om de waarschijnlijkheid te testen dat de FA's van de verschillende oppervlakken en tijdstippen van dezelfde distributie waren, werden Mann-Whitney-tests uitgevoerd op alle distributies met significantieniveaus aangegeven in de figuur

Discussie

De organisatie van het actine-cytoskelet en de vorming van verklevingen zijn processen die uitgebreid worden bestudeerd op vlakke oppervlakken. De huidige studie was bedoeld om veranderingen in de organisatie van het actine-cytoskelet en focale verklevingen op nanopillar-arrays te onderzoeken en te kwantificeren. In deze studie hebben we niet onderzocht hoe nanopillar-arrays celmigratie beïnvloeden. We verwachten echter dat cellen op de dichte reeksen een hogere beweeglijkheid kunnen hebben, zoals eerder waargenomen op dezelfde pijlerreeksen voor embryonale muisfibroblasten [45].

Doordat de cellen zich gedurende een langere periode kunnen verspreiden en aan het oppervlak kunnen hechten, is het mogelijk om de actine-cytoskeletorganisatie en de aanwezigheid van volledig gerijpte FA's te observeren. 24 uur na het zaaien zien we significante verschillen in celoppervlak, circulariteit en aspectverhouding voor cellen die op de oppervlakken zijn gezaaid. Er werden echter geen significante verschillen gedetecteerd na 48 uur, wat aangeeft dat de cellen na 24 uur nog niet volledig aan de oppervlakken hebben gehecht en dat de nanostructuren vooral de FA-organisatie beïnvloeden voordat ze volledig zijn gerijpt. Noch na 24 uur, noch na 48 uur wordt enige FA-formatie boven of aan de zijkanten van de NP's waargenomen.

Veranderingen in de actine-cytoskeletorganisatie hangen ook samen met de interactie van een cel met de omgeving. Zowel stressvezels als FA's groeien bijvoorbeeld wanneer ze worden uitgerekt en lijken functioneel onderling afhankelijk te zijn [66]. Anderen hebben gemeld dat rondere cellen en FA-lokalisatie rond randen vaak worden waargenomen voor cellen die zijn gezaaid op zachte of meegevende oppervlakken [67]. In onze resultaten zien we een vergelijkbare trend. Cellen op dichte arrays hebben de neiging om vezels rond de celrand te vertonen, zoals getoond in Fig. 1E of 2B. FA's lijken zich voor deze cellen dicht bij de celrand te vormen. We speculeren dat wanneer cellen geen plat oppervlak hebben, zoals wanneer de cellen bovenop de pilaren zijn opgehangen, de FA's-verdeling lijkt op FA's op zachte substraten, zoals gebruikt door Prager-Khoutorsky en collega's [67].

Uit onze resultaten zien we dat cellen die bovenop de pilaren zijn opgehangen een ontwikkeld actinenetwerk boven de pilaren lijken te hebben, maar zonder dat zich op de pilaren zelf FA's vormen. Voor cellen op dunne arrays lijken cellen echter minder te worden beïnvloed door de NP's en lijken zowel het actinenetwerk als de FA's meer "plat oppervlak".

De interactie tussen FA's en actine-cytoskelet is complex en nog niet volledig gekarakteriseerd. Van FA's die het actine-cytoskelet met de ECM verbinden, is bekend dat ze fungeren als tractiepunten en de vorming van stressvezels in de cellen bevorderen. Omgekeerd beïnvloeden actinevezels opnieuw de organisatie en rijping van FA's. Talrijke studies beschrijven hoe cellen de neiging hebben om bovenop dichte NP-arrays te hangen [61, 62, 68] en hoe celmembranen interageren met enkele NP's [69,70,71]. Deze waarnemingen worden bevestigd door theoretische studies [64] en het cellulaire gedrag op pilaren is redelijk goed begrepen.

Het mechanisme achter de vorming van FA's en hechting aan het substraat rond de celrand op dichte arrays blijft onduidelijk. In dit opzicht is vooral de vergelijking met cellen op een zacht substraat interessant. Voor zachte substraten zijn actinevezels georganiseerd in een ringachtige manier dicht bij de celrand en vormen FA's rond de celperiferie [67]. Op de nanopillar-arrays wordt een vergelijkbaar type architectuur waargenomen, maar de actinevezels zijn meestal korter. Similar qualitative trends in terms of actin organisation and FA formation were observed by Li et al. for cells seeded on random nanowire arrays made from gallium phosphide [61].

In our studies we also observed formation of F-actin rings around NPs. The formation of F-actin rings around NP has previously been described for fibroblasts on similar surfaces [45] and for U2OS cells on nanostructures with a range of structure sizes [58].

Contrasting our results to other studies highlight an important aspect of studies on cellular response to NP arrays:cellular response may vary considerably depending on cell type, NP material, NP geometry and as well as other parameters. For example, Buch-Månson et al. studied fibroblasts and investigations of FAs showed that cells suspended on arrays with intermediate NP density had the highest number of FAs. In our results we do not see a similar trend. However, these studies cannot be directly compared as Buch-Månson et al. studied another cell line using a system with different array geometry, surface porosity and NPs length [62].

There are also studies describing the effect FAs placement has on cells [41]. By modelling cells on planar substrates Stolarska et al. suggest that the cells can control intra-cellular stresses by three mechanisms:FA position, FA size and attachment strength. FAs around the periphery allows the cells to be more sensitive to changes in the micro-environment. This could also be an underlying mechanisms for cells on NPs. Yet, it is not obvious that the results for the planar substrate are directly transferable to NP decorated surfaces.

Cell-interactions with the surrounding environment, for flat substrate, NPs arrays or in vivo ECM, are regulated by a complex set of relations between actin organisation, membrane mechanics, cell dynamics and contact with FAs. To further explore these relations, applying flat surfaces structured with NPs could be one promising approach. Such surfaces may also aid in exploring discrepancies in the cellular response to environmental cues between different cell lines.

Conclusions

In order to create more physiologically relevant systems for cellular studies, a plethora of 3D and 2.5D approaches have been proposed. One approach is to use flat-surfaces decorated with vertically aligned nanostructures as a simple model system. High resolution live cell imaging of co-transfected U2OS cells expressing pCMV-LifeAct-GFP and pTAGRFP-Vinculin have been used to study the influence of nanopillar arrays on actin cytoskeleton focal adhesion organisation. Our present results indicate that the U2OS cells spreading on surfaces decorated with nanopillars can be categorised into three different regimes by how they respond to the nano-structures. These observed changes are quantified by analysing more than 400 high-resolution images, and indicate that tuning geometrical properties of the nanostructured surface can be used to direct cell behaviour.

More specifically, the U2OS cells were found to either contact the substrate, attach preferably around the cell edge, or be fully suspended on top of the vertical NP arrays. In the latter case, we hypothesise that the resulting reorganisation of FA and cytoskeleton is an effect analogous to what is seen for softer substrates.

Increased understanding of how cells behave on nano-structured surfaces, such as pillar arrays, could help us discover more details about complex cellular processes. For example, it is still poorly understood how changes in the actin cytoskeleton and its architecture influence cell signalling. By studying the cell response on nanostructured surfaces in a systematic way, the potential connection between actin cytoskeleton, cell adhesions and a plethora of biochemical signalling pathways could be further explored. We therefore envision that further development of the presented platform and analysis could have implications for advanced in vitro applications or for development of smarter in vivo biointerfaces.

Methods

Fabrication of Nanostructures and Sample Mounting

SU-8 nanostructures were fabricated as previously explained [63]. Briefly, 24 mm by 24 mm glass cover slips (#1.5, Menzel-Gläser, thickness 170 μm) were cleaned by immersion in acetone, isopropyl alcohol, rinsed in de-ionised water and dried. The cover slips were then oxygen plasma treated for 2 min (Diener Femto plasma cleaner, power 100 W, base pressure 0.3 torr), followed by dehydration for 10 min on a 150 °C hot plate. Samples were then placed in a desiccator containing an open vial of Hexamethyldisilazane (HMDS, Sigma Aldrich product no:440191). HMDS was applied by vapour deposition, the desiccator was pumped to low vacuum using a diaphragm pump for 5 min and the samples were kept in HMDS atmosphere for 60 min.

Substrates for EBL were prepared directly after HMDS treatment by spin coating SU-8 2001 (Microchem Corp.) to a desired thickness of 500 nm and 1000 nm. SU-8 was made fluorescent by adding either Oxazine 170 perchlorate, Rhodamine 800 or Coumarin 102 (all Sigma Aldrich) to a final concentration of 100 μg mL ⁻¹ resist. After spin coating samples were dehydrated on a hot plate at 95 °C. To mitigate charging during EBL exposure samples were then covered by a layer of conductive polymer AR-PC 5091 Electra 92 (AllResist GmbH) by spin coating at 2000 rpm for 60 s to thickness of 50 nm.

An Elionix ELS-G100 100 kV EBL-system was used to fabricate SU-8 nanopillars (NPs) with processing parameters as described in our previous work [63]. Table 1 summarise the arrays fabricated for this work. Pillar arrays were exposed using the Elionix dot-pattern generator where each pillar is exposed in a single exposure. Arrays were exposed over an area of 2000 μm by 4000 μm, with a current of 500 pA in write fields of 500 μm by 500 μm. NPs had a tip diameter of about 100 nm as a base diameter of 150 nm and 200 nm for structures of length 500 nm and 1000 nm respectively.

After EBL exposure, the samples were rinsed in DI-water to remove the conductive polymer, then post exposure baked for 2.3 min at 95 °C and developed twice in mr-Dev 600 (Micro Resist Technology GmbH) developer for 20 s, rinsed in isopropyl alcohol and dried. Samples were then treated with oxygen plasma (Diener Femto plasma cleaner, power 50 W, base pressure 0.3 torr) for 30 s to render SU-8 hydrophilic and to give it similar surface chemistry as glass by oxidising surface epoxy-groups to hydroxyl.

Fabricated structures were imaged using Scanning electron microscopy (SEM) and samples sputter coated with 5 nm Platinum/Palladium alloy deposited with a 208 HR B sputter coater (Cressington Scientific Instruments UK). SEM was performed with a FEI Apreo SEM, at 5 kV and 0.2 nA with sample 45° pre-titled stage and with additional tilting of 30°.

A Side view schematic representation of nano-structured surface mounted in petri dish. Glass slides are mounted using paraffin such that structures are pointing upwards. B Tilted schematic representation of nano-pillar array on flat surface, and two important parameters for the nano-pillar arrays (height and pitch). These figures are not drawn to scale. C , D Overview of the nanopillar arrays employed in this work. Top-down and tilted side-view scanning electron micrographs of fabricated nano-pillar array with pillars of height 1000 nm and pitch 1000 nm. Scalebars 2000 nm

When exposing the pillars, an indexing system was also exposed to make navigation during live-cell imaging more reliable. Arrays were optically inspected after fabrication to ensure free and standing pillars. The short Oxygen plasma treatment to render the SU-8 structures did not lead to any optically visible change to the structures. Lastly, the samples were mounted underneath 35 mm diameter dishes (Cellvis, Mountain View, CA, USA) with 14 mm holes and nano-structures pointing upwards, as indicated schematically in Fig. 7. As flat surfaces, areas outside the structured part of the same samples were used. Before usage, all dishes were disinfected with 70% ethanol twice and dried.

Cell Culture and Transfection

U2OS-cells (ATCC) were cultivated in Dulbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM Prod. 41965039, Fischer Scientific) with 10% fetal bovine serum (FBS) and kept at 5% CO₂ and 37 °C. Before detachment, cells were washed with PBS and detached with Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (trypsin-EDTA) and seeded on nanostrucutred or flat surfaces. For the diameter 14 mm glass wells 15,000 cells were seeded.

For the standard transfection experiments, cells were allowed 6 h for adhering to surfaces before transfection. U2OS cells were transiently transfected using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Fischer Scientific) by adapting the manufacturer protocol to our system. Briefly, 2 μL Lipofectamine 2000 was added to 50 μL Opti-MEM I Reduced Serum Media (Prod. 11058021, Gibco , Fischer Scientific) and incubated for 5 min at room temperature. Plasmid DNA coding for fluorescent LifeAct-TagGFP2 and TagRFP-vinculin fusion proteins were co-transfected by using 0.5 μg plasmid DNA (vinculin-pTagRFP and pCMVLifeAct plasmids) was diluted in 50 μL Opti-MEM I and incubated at room temperature for 5 min. For co-transfection of TagRFP-vinculin and pCMVLifeAct 0.5 μg of each plasmid was used.

The diluted DNA was added to the diluted Lipofectamine 2000 in a 1:1 ratio, and left to incubate for 20 min at room temperature. 40 μL of the combined transfection complex was then added to each well. After 18 h, 1.5 mL DMEM (Prod. 41965039) supplemented with 10% FBS and 1% 10000U/mL Penicillin-Streptomycin was added to each dish.

For reverse transfection experiments, the same amounts of reactants were used, but the transfection complex was added to a suspension of U2OS cells, and the suspension was then added to the wells.

Microscopy

Live cell imaging was performed usin g a Zeiss LSM 800 Airyscan with an inverted Axio Observer Z1 stand connect to a PeCon compact incubator. Imaging was performed in an humidified environment at 37 °C, with 5% CO₂ flow. High resolution imaging was performed using a Zeiss Plan-Apochromat 63x/1.4NA DIC M27 oil objective with Cargille Immersion Oil Type 37 (n =1.51) suited for use at 37 °C. All images were taken using the system optimised pixel size both in-plane (typically 34 nm) and for stacks in the vertical axis (typically 180 nm).

To minimise imaging bias, imaging was performed in a standardised manner where each pillar array was raster scanned and cells expressing both LifeActGFP and Vinculin RFP were imaged. The high resolution images were then processed using a Zeiss algorithm for reconstruction of AiryScan images and exported as CZI-files for further manual and automatised image processing.

Image Analysis

For all cells, cell shape was based on the expression LifeActGFP fusion protein and expression of TagRFP-vinculin was used to identify FAs. Segmentation of images was performed using a script written in Python 3 [72] using CZIfile [73] (version 2017.09.12) for reading the microscopy images in Zeiss-format. The python packages Scipy [74] and Scikit-image [75] were used for multi-dimensional image processing and image segmentation respectively.

To reduce the influence from fluorescence cross-talk from pillars (due to Oxazine 170 perchlorate, Rhodamine 800 or Coumarin 102), the pillar/surface channel was used as a background and subtracted from the TagRFP-vinculin imaging channel. A median filter (size:10 pixels) was applied to remove noise from the TagRFP-vinculin channel, followed by classification of the image into regions based on their intensity value using a Multi-Otsu approach. Multi-Otsu thresholding with three classes was applied. The first class was typically the background, the second class constituted the cytosolic vinculin, whereas vinculin rich areas in FAs appeared brighter and could be classified into a third class. The quality of the image segmentation was briefly assessed by comparison to manual segmentation.

Area of cells and vinculin rich regions were described by counting pixel numbers and from this the actual area was found by correcting for the pixel size. Shape geometries were described by fitting each region with an ellipse with the same second-moment as the segmented region. In order to describe the cell area geometry, three measures were used:(1) Aspect ratio defined as the ratio of the ellipse major axis to the minor axis. (2) Circularity given as,

$$\begin{aligned} C =\frac{4\pi *\text{Area}}{\text{Perimeter}^2}, \end{aligned}$$ (1)

and roundness given as,

$$\begin{aligned} R =\frac{4*\text{Area}}{\pi *\text{MajorAxis}^2}. \end{aligned}$$ (2)

Segmented vinculin areas with a fitted ellipse that were too round (aspect ratio \(\le 1.5\)) or too elongated (aspect ratio \(\ge 8.5\)) were rejected. In addition, vinculin areas smaller than 0.05 μm ² were filtered out. In order to find the distance between each vinculin area and the cell edge, the shortest euclidean distance between each centroid (the centre of the fitted ellipse for each vinculin area) and the cell edge was calculated.

Statistical Analysis

Statistical comparisons of distributions were performed by using the non-parametric two-tailed Mann-Whitney test neither assuming normal distribution nor equal standard deviation. P -values \(\ge {0.05}\) were considered to represent a non-significant (ns) difference between the two populations. Significant values were denoted with * for p in 0.01 to 0.05, ** for p in 0.001 to 0.01, *** for p in 0.0001 to 0.001 and lastly **** for p \(\le {0.0001}\).

Abbreviations

DMEM:

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

EBL:

Electron Beam Lithography

ECM:

Extracellular Matrix

EDTA:

Ethylenediaminetetraacetic Acid

FA:

Focal Adhesion

FBS:

Fetal Bovine Serum

GFP:

Green Fluorescent Protein

HMDS:

Hexamethyldisilazane

NP:

Nanopillar

RFP:

Red Fluorescent Protein

SEM:

Scanning Electron Microscopy