Biocompatibele FePO4-nanodeeltjes:medicijnafgifte, RNA-stabilisatie en functionele activiteit

Abstract

FePO₄ NP's zijn van speciaal belang in voedselverrijking en biomedische beeldvorming vanwege hun biocompatibiliteit, hoge biologische beschikbaarheid, magnetische eigenschappen en superieure sensorische prestaties die geen nadelige organoleptische effecten veroorzaken. Deze kenmerken zijn ook wenselijk bij medicijnafgifte. Hier hebben we de FePO₄ . verkend nanodeeltjes als leveringsvehikel voor het antikankergeneesmiddel, doxorubicine, met een optimale medicijnbelading van 26,81% ± 1,0%. Deze belasting versterkt de vorming van Fe³⁺ . nog meer doxorubicine-complex resulterend in de vorming van FePO₄ -DOX nanodeeltjes. FePO₄ -DOX-nanodeeltjes vertoonden een goede groottehomogeniteit en concentratieafhankelijke biocompatibiliteit, met meer dan 70% biocompatibiliteit tot een concentratie van 80 µg/ml. Belangrijk is dat uit cytotoxiciteitsanalyse bleek dat Fe³⁺ complexatie met DOX in FePO₄ -DOX NP's verhoogden de cytotoxiciteit met ongeveer 10 keer dan vrije DOX en verbeterden de selectiviteit naar kankercellen. Bovendien, FePO₄ NP's stabiliseren RNA op temperatuur en ondersteunen mRNA-translatie-activiteit die beloften voor RNA-stabiliserende middelen laat zien. De resultaten tonen de biocompatibiliteit van op ijzer gebaseerde anorganische nanodeeltjes, hun medicijn- en RNA-lading, stabilisatie en leveringsactiviteit met mogelijke gevolgen voor voedselverrijking en medicijn / RNA-afgifte.

Inleiding

Onder verschillende anorganische nanodeeltjes zoals goud, silica en kwantumdots, worden op ijzer gebaseerde nanodeeltjes (Fe-NP's) op grote schaal onderzocht voor biomedische toepassingen zoals contrastmiddelen, dragers voor medicijnafgifte en op warmte gebaseerde therapieën [1,2,3]. Vanwege de magnetische eigenschap, het hoge biologische aanpassingsvermogen en het bekende endogene metabolisme van ijzer, zijn Fe-NP's wenselijke kandidaten voor biomedische toepassingen. Als zodanig vormen Fe-NP's de meerderheid van de door de FDA goedgekeurde anorganische nanogeneeskunde [1, 2]. Deze omvatten INFeD, DexFerrum, Ferrlecit, Venofer, Feraheme en Injectafer die in de handel verkrijgbaar zijn voor hun toepassing bij bloedarmoede door ijzertekort en ijzertekort bij chronische nierziekte [1]. Evenzo is intraveneuze toediening van het chelaat ijzergluconaat een goed verdragen interventie voor bloedarmoede [4]. Bloedarmoede is een van de meest voorkomende voedingstekorten ter wereld en op Fe gebaseerde nanodeeltjes zoals FePO₄ en FeSO₄ is gebruikt in voedselverrijking om bloedarmoede te voorkomen. Voedselverrijking is het proces waarbij micronutriënten aan het voedsel worden toegevoegd met als doel het voedingstekort in een populatie te verhelpen [5]. FePO₄ NP's zijn van speciaal belang in voedselverrijking vanwege hun biocompatibiliteit, hoge biologische beschikbaarheid en superieure sensorische prestaties die geen nadelige organoleptische effecten veroorzaken [6,7,8,9]. Perfecto et al. hebben de FePO₄ . aangetoond De internalisatie van NP's in menselijke darmcellen vindt voornamelijk plaats via divalente metaaltransporter-1 (DMT-1) en kan daarom gemakkelijk worden geabsorbeerd [9, 10]. Op ijzer gebaseerde Feridex® en Revosit® zijn veelgebruikte MRI-contrastmiddelen (magnetic resonance imaging) voor contrastversterkte MRI [11,12,13,14,15,16]. In het licht van deze uitstekende rapporten, FePO₄ NP's profileren zich als een goede bezorger. Hier hebben we FePO₄ . verkend als een medicijnafgiftemiddel door een antikankergeneesmiddel, doxorubicine (DOX) te laden. IJzerion (Fe³⁺ ) kan een complex vormen met DOX-molecuul gefaciliteerd door elektrostatische interactie tussen elektron-deficiënt Fe in FePO₄ en elektronenrijke –OH-groep in DOX om met DOX geladen FePO₄ . te vormen NP's:FePO₄ -DOX NP's. We evalueerden de fysisch-chemische eigenschappen van FePO₄ en FePO₄ -DOX NP's en beoordeelden hun biocompatibiliteit en cytotoxiciteitsprofiel, respectievelijk, in muis osteosarcoom K7M2 en fibroblast NIH/3T3 cellijn.

Daarnaast heeft het anorganische nanodeeltje beloften getoond in de stabilisatie en levering van nucleïnezuur [17,18,19]. In dit opzicht is het gouden nanodeeltje uitgebreid bestudeerd vanwege hun vermogen om oligonucleotiden in hun oppervlak te immobiliseren, wat resulteert in het voorkomen van moleculaire aggregatie en afbraak [17, 20]. Goud is echter geen endogeen element en kan daardoor de translationele toepassing ervan beperken. Hier, op Fe gebaseerde nanodeeltjes zoals FePO₄ nanodeeltjes kunnen van primair belang zijn voor RNA-stabilisatieonderzoek vanwege hun endogene aard en gevestigd biocompatibiliteitsprofiel. Er zijn twee voorgestelde interactiemechanismen van nucleïnezuur (RNA/DNA) met Fe-NP's voor de stabilisatie:(1) vorming van waterstofbruggen en elektrostatische interactie tussen de fosfaatgroep van de nucleïnezuurruggengraat en Fe-NP's resulterend in adsorptie van nucleïnezuur zuur in Fe-NP's, en (2) nucleïnezuur kan adsorberen aan het Fe-NP's-oppervlak via nucleotide-basenpaarinteractie [19, 21, 22]. Een onderzoek heeft het potentieel aangetoond van calciumfosfaat-nanodeeltjes voor de stabilisatie en afgifte van DNA-vaccins [23]. In dit opzicht hebben we hier de RNA-stabilisatie en functionele activiteit van een ander op fosfaat gebaseerd nanodeeltje, FePO₄ onderzocht. , om het multifunctionele potentieel van FePO₄ . te onderzoeken gebaseerde nanodeeltjes, bij de levering en stabilisatie van lading.

Met de snelle goedkeuring van het mRNA-vaccin tegen COVID19, zijn nanodeeltjes van het mRNA-vaccin van groot belang, aangezien RNA onderhevig is aan snelle hydrolyse en verlies van functionele expressie, is het de taak van het nanodeeltje om deze kritieke kenmerken te verbeteren. Hier tonen we FePO₄ NP's stabiliseren RNA en ondersteunen functionele mRNA-translatie. Gezien deze uitstekende eigenschappen, FePO₄ NP's verdienen mogelijk aandacht voor voedselverrijking, medicijn- en RNA-afgifte, wat opwindende biomedische toepassingen mogelijk maakt.

Resultaten en discussie

FePO₄ NP's synthese, karakterisering en biocompatibiliteitsanalyse

Een eenvoudige chemische reactie in één stap tussen (NH₄ )₃ PO₄ en Fe(NO₃ )₃ geeft FePO₄ als precipitaat dat is gedispergeerd in biocompatibele lipide-PEG-surfactant die helpt om FePO₄ te stabiliseren nanodeeltjes en voorkomen aggregatie. FePO₄ NP's vertoonden een hydrodynamische grootte van 175 ± 5 nm met een polydispersiteitsindex (PDI) van 0.150 ± 0.01 wat wijst op een goede deeltjeshomogeniteit en een smalle grootteverdeling. Zeta-potentiaalanalyse toonde een negatieve oppervlaktelading van FePO₄ NP's met − 19,1 ± 8 mV zeta-potentiaal. De negatieve oppervlaktelading helpt verder om deeltjes in colloïden te stabiliseren, waardoor eiwitopsonisatie wordt voorkomen, een mechanisme dat cellulaire targeting voorkomt en de farmacokinetiek verandert [24,25,26]. FePO₄ werd verder gekenmerkt door FTIR. Figuur 1c toont de spectrale karakteristiek van FePO₄ nanodeeltjes en hun voorloper-Fe(NO₃ )₃ en (NH₄ )₃ PO₄ . FePO₄ spectra vertonen een duidelijke scherpe piek op 1030 cm⁻¹ die kan worden toegeschreven aan de P–O-rekband, een kleine piek op 520 cm⁻¹ komt overeen met de O–P–O antisymmetrische buiging, en een breed bereik van 3000 tot 3500 cm⁻¹ vertegenwoordigt water buigende en uitrekkende trillingen van geadsorbeerde watermoleculen [27, 28]. De FePO₄ spectra toonden de aanwezigheid van PO₄ ³⁻ groep en zijn vergelijkbaar met de FTIR-piek gerapporteerd door andere onderzoeken, waardoor de vorming van FePO₄ wordt bevestigd nanodeeltjes [27,28,29]. Fe(NEE₃ )₃ spectra vertoonden karakteristieke pieken voor N–O-rekbanden bij 1326 en 813 cm⁻¹ [30]. Piek bij 1625 kan worden toegeschreven aan –OH-buigingstrillingen en een brede piek rond 3000 cm⁻¹ kan worden toegeschreven aan waterbuig- en rektrillingen [30]. Evenzo, (NH₄ )₃ PO₄ vertoonde karakteristieke pieken voor de ammoniumgroep rond 1500 cm⁻¹ en fosfaatgroep rond 1000 cm⁻¹ [31]. De afwezigheid van nitraat- en ammoniumpieken in FePO₄ nanodeeltjes suggereren dat het product vrij is van mogelijke bijproducten en bevestigt de zuiverheid van de synthese.

Karakterisering en biocompatibiliteit van FePO₄ nanodeeltjes. een Hydrodynamische grootteverdeling van FePO₄ NP's, b zeta-potentiaalmeting van FePO₄ NP's die de oppervlaktelading tonen, c FTIR van FePO₄ NP's en zijn voorloper-Fe(NO₃ )₃ en (NH₄ )₃ PO₄ , en d biocompatibiliteit van FePO₄ NP's op muis osteosarcoom K7M2 en muis fibroblast NIH/3T3 cellijn. NP's werden 48 uur in verschillende concentraties behandeld (a, b gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± s.d.; n = 3 herhalingen. d staat voor gemiddelde ± s.d., n = 6 herhalingen).

Met de zekerheid van succesvolle synthese, zuiverheid, goede homogeniteit van de grootte en stabiele oppervlaktelading van FePO₄ NP's, gingen we verder met het analyseren van de biocompatibiliteit van FePO₄ NP's. Voor dit doel gebruikten we kanker- en niet-kankercellen:muis osteosarcoom K7M2 en muis fibroblast NIH/3T3 en analyseerden we de biocompatibiliteit van NP's bij een variërende concentratie in termen van cellevensvatbaarheid met behulp van MTT-assay. FePO₄ NP's vertoonden concentratieafhankelijke biocompatibiliteit in beide cellijnen - K7M2 en NIH / 3T3, in het concentratiebereik van 20 tot 600 g / ml (figuur 1d). FePO₄ NP's vertoonden een goede biocompatibiliteit tot een concentratie van 80 µg/ml met een cellevensvatbaarheid van meer dan 70%. Biocompatibiliteit was relatief hoger in niet-kankercel NIH/3T3 in vergelijking met kankercel K7M2.

Doxorubicine wordt geladen in FePO₄ en cytotoxiciteit van FePO₄ -DOX

Doxorubicine is geladen in FePO₄ via de co-incubatie-precipitatiemethode waarbij doxorubicine-oplossing wordt gemengd met de voorloper van FePO₄ dat resulteert in de vorming van met DOX geladen FePO₄ . Er worden drie verschillende formuleringen gebruikt om DOX te laden, zoals besproken in de methoden. Formulering 1 vertoonde de beste laadefficiëntie van 26,81% ± 1, terwijl formulering 2 een laadefficiëntie van 8,83% ± 2 vertoonde en formulering 3 geen enkele lading vertoonde (figuur 2a). Voor het laden hebben we DOX-oplossing toegevoegd aan de voorloper Fe(NO₃ )₃ in formulering 1 en tot (NH₄ )₃ PO₄ in formulering 2, terwijl we in formulering 3 DOX-oplossing hebben toegevoegd aan FePO₄ NP direct. Uit de laadgegevens bleek duidelijk dat het toevoegen van DOX aan de FePO₄ NP's behouden de DOX niet terwijl DOX aan beide voorlopers wordt toegevoegd:Fe(NO₃ )₃ en (NH₄ )₃ PO₄ oplossing helpt bij het laden en vasthouden van DOX. Dit kan worden verklaard door het feit dat Fe³⁺ van Fe(NO₃ )₃ kan een complex vormen met de elektronenrijke zuurstofgroep die aanwezig is in doxorubicine [32, 33]. De Fe³⁺ -DOX-complex wordt vervolgens geprecipiteerd door toevoeging van (NH₄ )₃ PO₄ resulterend in FePO₄ -DOX, die wordt gekenmerkt door een kleurverandering van vage geel tot vage bruin (Fig. 2b). Ondanks de kleurverandering was er geen verandering in de emissiespectra van FePO₄ -DOX die emissiemaxima vertoonde bij 590 nm vergelijkbaar met die van gratis DOX, wanneer geëxciteerd bij 480 nm (figuur 2c). FePO₄ -DOX NP's vertoonden een hydrodynamische grootte van 187 ± 7 nm en PDI van 0.143 ± 0.02, vergelijkbaar met die van FePO₄ (Fig. 2d). Er was echter een significant verschil in de oppervlaktelading van FePO₄ -DOX NP's (-8,89 ± 5 mV), vergeleken met FePO₄ NP (-19,1 ± 8 mV) (Fig. 2e). Verandering in zeta-potentieel suggereert functionele veranderingen in de oppervlakte-eigenschap van nanodeeltjes. Hier kan de reductie van zeta-potentiaal van − 19,1 tot − 8,89 mV worden toegeschreven aan de DOX-complexering die kationische eigenschappen aan het complex toevoegt.

Doxorubicine (DOX) laden in FePO₄ NP's en karakterisering van FePO₄ -DOX. een DOX-laadefficiëntie in drie verschillende formuleringen van FePO₄ NP's en DOX, b picturale weergave van de kleurverandering van geel naar bruin na het laden van DOX in FePO₄ om FePO₄ . te formuleren -DOX, c karakterisering van emissiespectra van met DOX geladen FePO₄ NP's (FePO₄ -DOX) na excitatie bij 480 nm, d hydrodynamische grootteverdeling van FePO₄ -DOX NP's en e zeta-potentiaalkarakterisering van FePO₄ -DOX NP's die oppervlaktelading tonen (gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± s.d.; n = 3 herhalingen)

Na de fysisch-chemische karakterisering werd de cytotoxiciteit van FePO₄ -DOX werd geanalyseerd in K7M2- en NIH/3T3-cellen en vergeleken met vrije DOX (Fig. 3). FePO₄ -DOX vertoonde een hogere cytotoxiciteit in vergelijking met vrij DOX bij een equivalente DOX-concentratie in beide cellijnen. IC50-waarde toonde ongeveer 10 keer reductie met FePO₄ -DOX-behandeling, van 2,61 tot 0,248 µM in NIH/3T3 en 1,01 tot 0,107 µM in K7M2-cellen. Deze drastische verlaging van de IC50-waarde in beide cellijnen suggereert een verhoogd cytotoxiciteitsprofiel van FePO₄ -DOX NP's. De equivalente FePO₄ concentratie in het IC50-concentratiebereik van FePO₄ -DOX is 40 µg/ml (0,107 µM in K7M2-cellen) en 100 µg/mL (0,248 µM in NIH/3T3-cellen), die beide binnen het biocompatibele bereik van FePO₄ vallen concentratie, met meer dan 70% levensvatbaarheid van de cellen. Vandaar dat de verhoging van FePO₄ -DOX-cytotoxiciteit kan worden toegeschreven aan de Fe³⁺ -DOX-complexvorming en niet op de individuele bijdrage van FePO₄ en DOX. Literatuur heeft het verhoogde cytotoxische effect aangetoond van antracycline zoals doxorubicine in aanwezigheid van ijzer [34,35,36,37]. Deze rapporten worden verder ondersteund door de verlichting van Fe-DOX-cytotoxiciteit door het gebruik van ijzerchelatoren [35,36,37]. Een voorgesteld mechanisme is dat Fe-DOX-complex de toxiciteit van van DOX afgeleide reactieve zuurstofspecies (ROS) versterkt en relatief veilige ROS transformeert (O^2· – en H₂ O₂ ) in veel giftiger ROS wat leidt tot verhoogde DNA-schade en celdood [34, 36]. Een ander voorgesteld mechanisme is de interactie van DOX met de functie van ijzerregulerende eiwitten en ferritine in aanwezigheid van overtollig Fe, waardoor de ijzerhomeostase wordt beïnvloed, wat leidt tot ROS-afhankelijke en onafhankelijke schade en apoptotische celdood [36, 38].

Cytotoxiciteit van FePO₄ -DOX NP's. a, b Cytotoxiciteit van vrij doxorubicine (DOX) en FePO₄ -DOX NP's in respectievelijk muisfibroblast NIH / 3T3 en osteosarcoom K7M2-cellijn bij verschillende DOX-equivalente concentraties. Cytotoxiciteit werd geanalyseerd in procentuele levensvatbaarheid van de cellen na behandeling met deeltjes gedurende 48 uur. c, d Een vergelijking in procentuele cellevensvatbaarheid van FePO₄ -DOX NP's en vrije DOX in respectievelijk NIH / 3T3- en K7M2-cellijnen bij equivalente DOX-concentratie. De inzet in het midden vertegenwoordigt de IC-50-waarden van Free DOX en FePO₄ -DOX NP's in NIH/3T3- en K7M2-cellen (gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± s.d.; n = 6 herhalingen)

Samen met de verhoogde cytotoxiciteit, FePO₄ -DOX vertoonde selectiviteit naar kankercellen met een hoger cytotoxiciteitsgedrag vergelijkbaar met dat van Free DOX. Afbeelding 3c toont 0,1 µM DOX-equivalent FePO₄ -DOX toonde 53% cellevensvatbaarheid voor kankercel K7M2 vergeleken met 72% cellevensvatbaarheid voor niet-kanker NIH/3T3. Evenzo vertoonde Free DOX ook een hoger cytotoxiciteitsgedrag ten opzichte van kankercellen, met 54% levensvatbaarheid van de cellen in K7M2-cellen vergeleken met 66% in NIH/3T3. De verschillen zijn echter groter geworden in het geval van FePO₄ -DOX, met 19% verschillen in cellevensvatbaarheid tussen kanker- en niet-kankercellen vergeleken met 12% in vrije DOX. Cytotoxiciteitsanalyse heeft aangetoond dat Fe-complexering met DOX in FePO₄ -DOX NP's hebben de cytotoxiciteit aanzienlijk verhoogd en de selectiviteit naar kankercellen verbeterd.

Cellulaire internalisatie van FePO₄ -DOX NP's

Het internalisatiegedrag van FePO₄ -DOX NP's werden geanalyseerd met behulp van confocale microscopie na een tijdsafhankelijk internalisatieonderzoek (Fig. 4). Gratis DOX werd gebruikt als een positieve controle. Beide FePO₄ -DOX NP's en gratis DOX vertoonden geen significante internalisatie in de initiële incubatietijdstippen van 0,5 en 1 uur. Na 3 uur incubatie vertoonden beide echter internalisatie zoals weergegeven door rode DOX-fluorescentie in het confocale beeld. De blauwe kleur komt van kernkleuring door DAPI. Uit de analyse blijkt dat FePO₄ . binnen 3 uur -DOX NP's internaliseren naar cellen na vergelijkbaar internalisatiegedrag als dat van Free DOX. Het is belangrijk op te merken dat, vanwege de kleurverandering van FePO₄ -DOX, dat bruinachtig is in vergelijking met de rode kleur van Free DOX, we kunnen het relatieve internalisatieprofiel van FePO₄ mogelijk niet kwantitatief vergelijken -DOX. Desalniettemin bevestigde de internalisatietest dat FePO₄ -DOX wordt binnen 3 uur door de cellen opgenomen. Gezien het goed begrepen mechanisme van het omgaan met ijzer door ons lichaam, kunnen voorgestelde NP's beloften inhouden in de ontwikkeling van op ijzer gebaseerde geneesmiddelen tegen kanker met het vermogen om de therapeutische respons in een enkele therapiesessie te volgen.

Onderzoek naar cellulaire internalisatie. Cellulaire internalisatie van FePO₄ -DOX NP's en vrije DOX op K7M2-cellen na behandeling van 3 uur, 1 uur en 0,5 uur. Cellen werden behandeld met 200 µL van 5 µg/ml DOX-concentratie. De rode kleur die wordt waargenomen in met nanodeeltjes behandelde cellijn betekent succesvolle internalisatie van de nanodeeltjes. De rode kleur is te wijten aan de fluorescentiekarakteristiek van DOX. Er wordt geen rood signaal waargenomen in de onbehandelde controlecel

RNA-stabilisatie en mRNA-expressie

Zoals te zien is in figuur 5a, terwijl koperen nanodeeltjes (Cu NP) en koolstofnanobuisjes (CNT's) de hydrolytische afbraak van RNA versnellen (lagere bandintensiteit dan controle), de FePO₄ en controle zilver (Ag) nanodeeltjes stabiliseren het RNA zoals aangetoond door relatief sterke bandintensiteit in RNA-agarosegelelektroforese (RAGE). De FePO₄ en controle-zinkoxide-nanodeeltjes (ZnO NP) verlenen ook enige weerstand tegen afbraak in serum, zoals weergegeven door de bandintensiteit die iets hoger is dan die van controles (Fig. 5b). Belangrijk is dat de functionele activiteit, mRNA-expressie hoger is dan niet-nanodeeltjescontroles, terwijl het RNA-afbrekende Cu NP verlies in mRNA-expressie veroorzaakt als maatstaf voor relatieve lichteenheden (figuur 5c). Deze resultaten laten zien dat FePO₄ NP's helpen bij het stabiliseren van RNA en kunnen worden gebruikt als een stabiliserend afgiftemiddel voor therapeutische RNA-afgifte. Eerdere voorlopige experimenten hadden aangegeven dat een normaal werkbereik van de translatie twee onafhankelijke experimenten zijn voor de controlemonsters die niet met nanodeeltjes zijn behandeld en die 2393 en 2630 RLU/putje laten zien, wat representatief is. Een tweevoudige toename in overeenstemming met de bovenstaande gegevens suggereert dat FePO44 NP translatie ondersteunt, terwijl in overeenstemming met RNA-denaturatie/degradatie hierboven, de Cu NP translatie onderdrukt. Een verscheidenheid aan anorganische nanodeeltjessystemen is gebruikt voor therapeutische RNA-stabilisatie en afgifte, waaronder; goud, zilver, koper, ijzeroxide, mesoporeuze silica nanodeeltjes (MSN), op koolstof gebaseerde polymeren, composieten en andere [39–45]. Onze groep had bijvoorbeeld gerapporteerd dat de complexering van nanodeeltjes met macromoleculair RNA ervoor kan zorgen dat het bestand is tegen afbraak door RNase, of nucleasen die aanwezig zijn in serum en weefsels. Het COVID-19-mRNA-vaccin heeft hernieuwde belangstelling voor dergelijke macromoleculaire RNA-therapieën die verder gaan dan vaccins, waar het de plicht is van het nanodeeltje om niet alleen RNA te beschermen tegen hydrolyse en door nuclease gemedieerde vertering, maar complexering van het NP moet bijvoorbeeld de RNA-functie behouden , mRNA-expressie. Eerder hadden we gezien dat macromoleculaire RNA-complexatie van kopernanodeeltjes RNA-denaturatie veroorzaakt [46]. Daarom onderzochten we de effecten van NP-complexatie op macromoleculair RNA met behulp van Torula-gist-RNA (TY-RNA) of een reporterconstruct-mRNA dat luciferase tot expressie brengt.

RNA-hydrolyse. een Er werd een model-RNA gebruikt dat we in een aantal van onze publicaties hebben gebruikt en dat qua grootte en sequentiesamenstelling vergelijkbaar is met de meeste mRNA's van torula-gist (TY-RNA). Het RNA werd in de loop van de tijd geïncubeerd in dubbel gedestilleerd water in de aanwezigheid of afwezigheid van nanodeeltjes, hetzij koper (Cu NP), ijzerfosfaat (FePO4), zilver (Ag NP) of koolstofnanobuisjes (CNT) bij 37 graden Celsius en monsters verwijderd bij hetzelfde tijdstip en getest door RNA-agarosegelelektroforese (RAGE). Verlies van bandkleuringsintensiteit duidt op RNA-degradatie, terwijl handhaving van RNA-bandkleuringsintensiteit op stabilisatie wijst. b Net als hierboven werd RNA geïncubeerd in 10% FBS/DMEM bij kamertemperatuur in aanwezigheid van zinkoxide (ZnO) NP of FePO₄ NP versus controle die alleen RNA was in afwezigheid van nanodeeltjes. Opnieuw werden monsters in de loop van de tijd verwijderd en getest met RAGE, de aanwezigheid van de gekleurde RNA-band in de loop van de tijd duidt opnieuw op stabiliteit en resistentie tegen nuclease- of RNase-afbraak uit het serum. c mRNA dat voor Luciferase codeert, werd in vitro getranslateerd van standaard konijnenreticulocyten en de relatieve luminescentie werd gestandaardiseerd naar RNA in aanwezigheid of afwezigheid van ijzerfosfaat (FePO₄ ) of koper (Cu) nanodeeltje

Conclusie

FePO₄ nanodeeltjes werden met succes gesynthetiseerd volgens een eenvoudige co-incubatie-precipitatietechniek, resulterend in de vorming van deeltjes van homogene grootte van 175 ± 5 nm. FTIR-analyse bevestigde de aanwezigheid van een fosfaatgroep en de afwezigheid van voorloperverontreinigingen in het nanodeeltje. Biocompatibiliteitsanalyse onthulde concentratieafhankelijke biocompatibiliteit met meer dan 70% levensvatbaarheid van de cellen tot 80 µg/ml. Verder werd DOX effectief geladen in FePO₄ resulterend in FePO₄ -DOX NP's die vergelijkbare fysisch-chemische eigenschappen vertoonden als die van FePO₄ . Cytotoxiciteitsanalyse onthulde dat Fe-complexatie met DOX in FePO₄ -DOX NP's verhoogden de cytotoxiciteit, met een verbetering van ongeveer 10 keer in IC50, en verbeterden de selectiviteit naar kankercellen. Bovendien toonde de internalisatietest FePO₄ -DOX NP's werden efficiënt geïnternaliseerd in cellen op een incubatietijdstip van 3 uur. RNA-stabilisatiestudie toonde aan dat FePO₄ nanodeeltjes stabiliseren efficiënt RNA, voorkomen snelle afbraak en behouden de functionele activiteit die beloften voor de levering van therapeutisch RNA aantoont. Gezien de goede homogeniteit van de grootte, het biocompatibiliteitsbereik, de efficiëntie van het laden van geneesmiddelen, het verbeterde cytotoxiciteitsprofiel, de RNA-stabiliserende eigenschap en de efficiënte cellulaire opname, FePO₄ NP's vertoonden gewenste kenmerken voor medicijn- en RNA-afgiftevehikels. Bovendien hebben de resultaten veelbelovende vooruitzichten getoond voor het gebruik van FePO₄ -drug NP's in voedselverrijking voor de ontwikkeling van een op voedsel gebaseerd medicijnplatform.

Methoden

Synthese en karakterisering van FePO₄ Nanodeeltjes

FePO₄ nanodeeltjes werden gesynthetiseerd door middel van chemische precipitatietechniek die het protocol optimaliseert door Sokolova et al. [47]. Kortom, ammoniumfosfaat ((NH₄ )₃ PO_4, 16 mg/ml) en ijzernitraat (Fe(NO₃ )_3, 8 mg/ml) oplossing werd bereid. Naar de 1 ml Fe(NO₃ )₃ , 1 ml (NH₄ )₃ PO₄ werd druppelsgewijs toegevoegd onder constant roeren, resulterend in precipitatie van ijzerfosfaten (FePO₄ ). Eigen risico van (NH₄ )₃ PO₄ werd gebruikt zodat alle Fe van Fe(NO₃ )₃ neerslaan als FePO_4. De aldus gevormde ijzerfosfaatoplossing werd driemaal met water gewassen om bijproducten te verwijderen door 2 minuten te centrifugeren bij 300 g. Eindelijk, FePO₄ precipitaat werd gedispergeerd met DSPE-PEG-COOH-oplossing (10% w/w) in water om FePO₄ te formuleren nanodeeltjes. FePO₄ NP's werden gekarakteriseerd op grootte en oppervlakte-eigenschappen met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS) en spectrale kenmerken met behulp van Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR).

Doxorubicine (DOX) wordt geladen op FePO₄ Nanodeeltjes

Doxorubicine was geladen in FePO₄ nanodeeltjes door de co-incubatie-precipitatiemethode. Drie verschillende DOX-FePO₄ NP's-formuleringen werden onderzocht om de beste laadefficiëntie te optimaliseren. In de eerste formulering, DOX-FePO₄ NP's werden geformuleerd door 100 µg DOX toe te voegen aan 1 ml Fe(NO₃ )₃ (8 mg/ml) gevolgd door toevoeging van 1 ml (NH₄ )₃ PO₄ (16 mg/ml) druppelsgewijs onder constant roeren. In de tweede formuleringen werd eerst 100 µg DOX toegevoegd aan 1 ml (NH₄ )₃ PO₄ (16 mg/ml) gevolgd door toevoeging van 1 ml Fe(NO₃ )₃ (8 mg/ml) druppelsgewijs onder constant roeren. In de derde formuleringen werd 100 µg DOX toegevoegd aan de FePO₄ NP-oplossing. Zo geformuleerd FePO₄ -DOX NP's werden drie keer gewassen met water en de hoeveelheid doxorubicine in FePO₄ -DOX werd spectrofluorimetrisch gekwantificeerd door DOX-excitatie en -emissie te meten bij 490 nm en 595 nm.

DOX-laadefficiëntie werd berekend met de volgende vergelijking:

$$\% \;{\text{Bezig met laden}}\;{\text{efficiency:}}\;\left( {{\text{DOX}}\;{\text{ present}}\;{\text { in}}\;{\text{ FePO}}_{{4}} - {\text{DOX}}\;{\text{NP/Initial}}\;{\text{input}}\;{ \text{of}}\;{\text{DOX}}} \right) \times {1}00$$

Biocompatibiliteit van FePO₄ NP's en cytotoxiciteit van FePO₄ -DOX NP's

Biocompatibiliteit van FePO₄ NP's en cytotoxiciteit van FePO₄ -DOX NP's werden getest in muis osteosarcoom K7M2 en muis fibroblast NIH/3T3 met behulp van MTT-assay volgens vastgesteld protocol [48, 49]. In het kort werden 10.000 cellen gezaaid in platen met 96 putjes en 24 uur geïncubeerd in een 37 ° C 5% CO₂ broedmachine. Vervolgens werden de media verwijderd en werden verse media met variërende concentraties nanodeeltjes behandeld tot cellen en 48 uur incubatie gelaten. Controlecellen werden alleen met media gehouden. FePO₄ De NP's-concentratie varieert van 20 tot 600 µg/ml en de DOX-concentratie varieert van 0,05 tot 5 µM. Na NP-incubatie werden de media verwijderd en werden de cellen 2 uur geïncubeerd met MTT-oplossing (0,5 mg/ml) in serumvrije media om de vorming van formazankristal mogelijk te maken. MTT-oplossing werd verwijderd en formazankristal werd opgelost in DMSO en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur gelaten om goed te mengen. Vervolgens werd de absorptie van de DMSO-oplossing gemeten bij 550 nm met behulp van een microplaatlezer (BioTek, Synergy H1 Hybrid Reader) en werd het percentage levensvatbaarheid van de cellen berekend.

Cellulaire internalisatie via confocale microscopie

Cellulaire internalisatie van FePO₄ -DOX NP's werden geanalyseerd in K7M2-cellen van osteosarcoom van muizen met behulp van confocale microscopie [49,50,51]. In het kort werden 12.000 cellen gezaaid in platen met 8 putjes en 24 uur geïncubeerd in 37 ° C 5% CO₂ broedmachine. Vervolgens werd 200 µL van 5 µg / ml DOX-concentratie in media gedurende 3 uur behandeld en werden cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde voor beeldvorming. De kern werd gekleurd met DAPI en cellen werden waargenomen onder een confocale laserscanmicroscoop (Carl Zeiss, LSM-700). Hier kan het emissiemaximum van DOX bij 560 nm worden benut om de internalisering ervan te volgen, wat een rode kleur geeft in confocale microscopie. Met hetzelfde protocol werd een tijdsafhankelijke internalisatietest uitgevoerd door FePO₄ . te incuberen -DOX NP's en gratis DOX voor respectievelijk 0,5, 1 en 3 uur.

RNA-stabiliteit en expressie

Torula-gist-RNA (Sigma-Aldrich) werd opgelost bij 1 mg/ml in steriel gedeïoniseerd water en 2 µg aliquots blootgesteld aan 20 ug/mL nanodeeltjes (CNT, Cu, Ag, ZnO NP of FePO₄ ) geïncubeerd bij 37 ° C en in de loop van de tijd getest door RNA-agarosegelelektroforese zoals we eerder hebben gemeld [42, 52]. Tijdspunt getoond in Fig. 5 is 's nachts. Evenzo werd het RNA met/zonder nanodeeltjes blootgesteld aan 10% FBS/DMEM en opnieuw getest met RAGE zoals hierboven. mRNA fLuc werd verkregen van Trilink Biotechnologies, 2 µl werd geïncubeerd in konijnenreticuloysaat aangevuld met methinine, cysteïne en leucine (ProMega Corp) gedurende 30 graden gedurende 1,5 uur met of zonder nanodeeltjes van 20 µg/ml, standaard Luciferine-reagens toegevoegd en luminescentiemeting genomen op een Biotek Synergy H1-plaatlezer onder standaardomstandigheden.

Statistische analyse

Alle gegevens vertegenwoordigen ten minste drie onafhankelijke replica's en worden uitgedrukt als gemiddelde ± s.d. wanneer mogelijk. Cell viability data includes six replicates.