Ontwikkeling van Cu:Ag bimetallische nanodeeltjes met meerdere concentraties als een veelbelovend bacteriedodend middel voor antibioticaresistente bacteriën zoals geëvalueerd met Molecular Docking Study

Resultaten en discussie

XRD-analyse werd uitgevoerd om de samenstelling van fasen en kristalstructuur van geformuleerde producten te beoordelen. Figuur 3a laat het XRD-patroon zien dat is uitgezet tussen 20° en 80°. In bimetaal Cu:Ag worden waargenomen reflecties rond ~ -38,2 °, 46 °, 64,4 ° en 77,1 ° toegeschreven aan (111), (200), (220) en (311) facetten van fcc Ag-fase volgens JCPDS nr. 04-0783 [32, 49.50.51.52]. Terwijl, in het geval van Cu, diffracties die verschijnen bij 32,6°, 44,2° en 51° de (110), (111) en (200) roostervlakken aanduiden die de aanwezigheid van respectievelijk fcc gestructureerd CuO en metallisch Cu bevestigden, en goed afgestemd op JCPDS nr. 04-0836 [32, 53,54,55,56]. In het geëxtraheerde patroon werden zowel Ag- als Cu-pieken waargenomen, wat duidt op de aanwezigheid van NP's die zowel Ag- als Cu-fasen vormen. Bovendien onthult het bestaan ​​van CuO in monsters met een lager Ag-gehalte (bijv. 1:0.025, 1:0.050 en 1:0.075) dat Cu NP's geoxideerd waren en niet-beschermend gedrag vertoonden bij hoge temperatuur vanwege lagere Ag-concentraties [ 52]. Omgekeerd vertoont de CuO-piek in het monster met het hoogste Ag-gehalte (1:0,1) een lage intensiteit, wat wijst op de vorming van een gedeeltelijk oxidevrij product [57]. Dit suggereert dat een verbeterde oxidatieweerstand van bimetaal NP's zal optreden als gevolg van de toevoeging van Ag [52]. Er werd geen extra piek van onzuiverheid gedetecteerd binnen de detectielimieten van het instrument, terwijl elk kristallografisch vlak energetisch verschillende locaties omvat op basis van atoomdichtheid. Zowel Cu- als Ag-NP's hebben facetten met een hoge atoomdichtheid op (111) die dienden om de maximale oriëntatie van vlakken bloot te leggen [51, 58]. Met behulp van de wet van Bragg bleek de d-afstand van Ag en Cu respectievelijk 0,24 en 0,21 nm te zijn, wat overeenkomt met een duidelijk vlak (111) van beide elementen en in overeenstemming was met HR-TEM-bevindingen (Fig. 6) [51, 59 ,60,61,62]. Overeenkomstige SAED-ringen (Fig. 3b-d) verkregen uit geprepareerde bimetaalproducten vertonen verschillende ringpatronen die goed gekristalliseerde producten vertonen en goed overeenkomen met XRD-patronen.

een XRD-profielen verkregen uit Cu:Ag bimetallische NP's, b –d SAED-ringen verkregen met HR-TEM voor monsters b 1:0.025, c 1:0.050, en d 1:0,10, e FTIR-spectra van voorbereide monsters

FTIR-spectra zijn opgenomen tussen 500 en 4000 cm ⁻¹ zoals weergegeven in Fig. 3e; de uitgezonden band tussen 600 en 900 cm ⁻¹ wordt veroorzaakt door de vorming van Cu:Ag-binding [63]. De waargenomen band rond ~ 1200 en 1400 cm ⁻¹ wordt toegeschreven aan respectievelijk C–O en C–H; pieken die verschijnen bij ~ 1800 en 2100 cm ⁻¹ komt overeen met C=O en N–H binding door PVP en NH₄ OH [64]. Transmissies waargenomen rond ~ 2800 cm ⁻¹ en 3400 cm ⁻¹ worden toegeschreven aan de aanwezigheid van C≡N en hydroxylgroep (O–H) [64].

Figuur 4a toont de absorptiespectra van Ag-Cu bimetaal NP's met duidelijke absorptiebanden op 340, 410 en 500 nm, die worden toegeschreven aan plasmonische resonantieabsorptie aan het oppervlak van metallisch Ag en Cu [52]. De band die bij 410 nm verschijnt, ontstaat meestal door de aanwezigheid van Ag NP's, en de laatste piek gepositioneerd op 510 nm wordt toegeschreven aan het bestaan ​​van Cu NP's [52, 57,58,59, 65,66,67]. Er kan worden gesuggereerd dat bimetaal NP's worden ontwikkeld met verschillende Ag- en Cu-fasen, in plaats van bimetaalontwikkeling die ook werd bevestigd door XRD-resultaten zoals eerder besproken [52]. Een lichte roodverschuiving in de absorptieband bij 410 nm en een toename van de maximale absorptie met toenemend Ag-gehalte werd waargenomen [58]. Met behulp van de Tauc-vergelijking,

waar α wordt beschouwd als absorptiecoëfficiënt [2.303 log(T /d ), T is doorvallend licht en d toont dikte van monstercel], h symboliseert de constante van Planck (6.62607015 × 10 ⁻³⁴ Js), \(\nu\) is de lichtfrequentie, K toont absorptie-index, en E _g is gelijk aan band gap-energie in eV. De waarde van “n ” is gerelateerd aan elektronische overgangstype band gap [13, 26, 68, 69]. De bandafstand van bereide bimetaalproducten werd berekend en bleek 3,2, 2,9, 2,7 en 2,6 eV te zijn, zoals aangetoond in figuur 4b-e.

UV–Vis-spectra verkregen uit bimetaal b –e Tauc plotanalyse

Uit SEM-afbeeldingen (Fig. 5a-d) van gesynthetiseerde Cu:Ag bimetaal nanocomposieten, werd waargenomen dat kleine deeltjes werden afgezet op het oppervlak van grote deeltjes. Een toename van het Ag-gehalte van 2,5 tot 7,5% leidde tot de vorming van verschillende deeltjes met verschillende morfologie die uiteindelijk uitmondden in dikke Cu:Ag NP's. Verder werd de accumulatie van ongelijke en kleine Ag-deeltjes vergroot met toenemende doteringsconcentratie, wat suggereert dat er meer verspreide blokken op het oppervlak verschijnen. Dit duidt op de grote invloed die Ag-doping in Cu heeft op de morfologie, wat verder werd bevestigd met HR-TEM-microfoto's (zie Fig. 5e–h).

a–d SEM-afbeeldingen verkregen van bereide producten, e–h HR-TEM-microfoto's

Om de morfologie en d-afstand van geprepareerd bimetaal verder uit te werken, werd HR-TEM met een resolutie van 10 nm ingeschakeld. In figuur 6a komt de d-afstand (0,21 nm) van Cu NP's overeen met (111) facet van Cu, zoals ook duidelijk is in XRD-resultaten (figuur 3a). Figuur 6b toont een lichte toename van de laagafstand (0,21 tot 0,22 nm) en toont Ag NP's met een interplanaire afstand van 0,24 nm die overeenkwam met het (111) vlak. Evenzo toont figuur 6c, d berekende laagafstanden en afzonderlijke fasen van bimetaal, terwijl figuur 6e de deeltjesvorm van Ag en Cu NP's laat zien. De deeltjes in HR-TEM-afbeeldingen blijken een kern-schaalstructuur te hebben. In Fig. 6d werden binnen een enkel deeltje roosterranden opgenomen die afkomstig waren van Cu en Ag. Dit suggereert sterk de vorming van kern-schil bimetalen NP's met verschillende Cu:Ag-verhoudingen die onregelmatige quasi-sferische NP's opleveren. Verder toonde het TEM-beeld dat deeltjes lijken op een donker en helder gebied. Deze variatie binnen een enkel deeltje kan wijzen op de aanwezigheid van twee verschillende samenstellende materialen die de vorming van bimetalen Cu:Ag-deeltjes suggereren [70, 71].

a–d HR-TEM (10 nm)-afbeeldingen voor d-afstandmeting voor alle voorbereide monsters, e afbeelding met lage vergroting met bimetaaldeeltjes

De aanwezigheid van een duidelijke piek in het EDS-spectrum en de elementaire samenstelling afkomstig van bimetaal bevestigde de succesvolle vorming van Cu:Ag NP's. Afbeelding 7a geeft het EDS-spectrum weer dat is verkregen uit een 1:0,050-monster dat duidelijke pieken van Cu en Ag vertoont. Figuur 7b is genomen uit een 1:010 monster waar pieken voor C en O werden gedetecteerd in gedoteerde monsters. Deze verschijnen omdat koolstoftabs worden gebruikt om monsters te bewaren tijdens SEM-onderzoek en/of vanwege achtergrondtellingen in de SEM-EDS-sensor.

EDS-profielen verkregen uit bimetaal NP's

In vitro bactericide werkzaamheid van Cu:Ag bimetaal NP's met behulp van agar-putdiffusie-assay wordt weergegeven in Tabel 1. De resultaten tonen een directe proportionele relatie tussen gesynthetiseerde NP's-concentratie en remmingszones (mm). Statistisch significant (P <-0,05) remmingszones geregistreerd voor (2,5, 5, 7,5 en 10 gew.%) Ag-doteringsstof tegen S. aureus, E. coli en A. baumannii varieerden van respectievelijk 0,85-2,8 mm, 0,55-1,95 mm en 0,65-1,85 mm, zie tabel 1. Alle resultaten werden vergeleken met respectievelijk DIW (0 mm) en amoxicilline (4 mm) als negatieve en positieve controle. Evenzo nam het percentage leeftijdseffectiviteit van gedoteerde NP's toe (21,2-70%) (13,7-48,7%) en (16,2-46,2%) tegen S. aureus, E. coli en A. baumannii , respectievelijk. Over het algemeen bleken Cu:Ag bimetaal NP's krachtiger te zijn tegen S. aureus (d.w.z. gram + ive) vergeleken met E. coli en A. baumannii (d.w.z. gram −ive).

Grootte, concentratie en vorm van NP's hebben een directe invloed op oxidatieve stress geproduceerd door nanostructuren. Bacteriedodende werkzaamheid in de vorm van remmingszones (mm) verbeterde door grotere gew% dotering van Ag-gedoteerde Cu bimetaal NP's als gevolg van verhoogde beschikbaarheid van kationen (++). Bacteriedodende werking met betrekking tot grootte en concentratie toont een omgekeerde relatie tot grootte [58, 59]. Nanostructuren produceren op efficiënte wijze reactieve zuurstofsoorten (ROS) die zich in bacteriële celmembranen bevinden, wat leidt tot extrusie van celorganellen en uiteindelijk de dood van bacteriën [60]. Naast ROS-productie, kationische interactie van Ag ⁺ en Cu ⁺⁺ met negatief geladen delen van bacteriecelmembraan resulteert in verbeterde bacteriedodende werkzaamheid bij toenemende concentraties door cellysis en instorting van bacteriën [58, 61].

Biologische toepassingen van verschillende klassen nanodeeltjes zijn de afgelopen decennia uitgebreid bestudeerd. Vanwege de unieke kenmerken van NP's zijn ze op grote schaal gebruikt vanwege hun potentieel als bacteriedodend middel met het vermogen om traditionele antibiotica te vervangen. NP's interageren met bacteriële cellen, verstoren de celmembraanpermeatie en vernietigen belangrijke metabole routes [72]. Het specifieke mechanisme van de toxiciteit van nanodeeltjes voor bacteriën moet worden onderzocht. Er wordt aangenomen dat NP's een interactie aangaan met bacteriële cellen met elektrostatische krachten, van der Waals-krachten of hydrofobe interacties die uiteindelijk leiden tot de dood van bacteriën. Van enzymen is gemeld dat ze de belangrijkste virulentiefactor zijn die betrokken zijn bij bacteriële infectie en die erop gericht zijn om hun activiteit te remmen bij het aanpakken van de veroorzaakte infectie [73]. Hier identificeerde moleculair docking-onderzoek van Cu:Ag NP's tegen enzymdoelen van celwand naast vetzuurbiosynthetische route het bindingsinteractiepatroon van deze NP's in actieve pocket. Rekening houdend met het in vitro antibacteriële potentieel van deze NP's tegen A. bauminnii , S. aureus en E. coli , werden de enzymtargets geselecteerd uit deze micro-organismen om inzicht te krijgen in mogelijke mechanismen achter hun bacteriedodende activiteit.

Beste gecoupeerde conformatie waargenomen in het geval van Cu:Ag Bimetallic NP's met β -lactamase van A. bauminnii onthulde waterstofbindingsinteractie met Glu272 (2,8 ) en Ser286 (3,2 ) samen met metaalcontactinteractie met Val292 terwijl de koppelingsscore -4,013 kcal / mol was (Fig. 8a). Evenzo bindingsscore van Ag-Cu bimetaal NP's waargenomen tegen β -lactamase van S. aureus was -4,981 kcal/mol met H-bindingsinteractie met Ser403 (3,2 ), Tyr519 (3,6 ), Gln521 (3,0 Å) en Asn464 (3,1 ) zoals weergegeven in Fig. 8b.

Bindend interactiepatroon van Ag-Cu Bimetaal NP's in actieve zak. een β -lactamase van A. bauminnii , b β -lactamase van S. aureus . c , d Bindend interactiepatroon van Ag–Cu Bimetaal NP's in actieve pocket c enoyl-[acyl-drager-eiwit]-reductase (FabI) ​​van A. bauminnii , d enoyl-[acyl-carrier-proteïne] reductase (FabI) ​​van S. aureus , e bindingsinteractiepatroon van Ag-Cu Bimetaal NP's in actieve zak van FabH van E. coli

Tweede enzymdoelwit dat in het huidige FabI-onderzoek is geselecteerd, behoort tot de biosynthese van vetzuren en voorspellingen voor moleculaire docking suggereerden Cu:Ag-bimetaal-NP's als potentiële remmer tegen dit doelwit. De Cu:Ag Bimetallic NP's vertoonden een goede bindingsscore (-3,385 kcal/mol) tegen FabI van A. bauminnii met H-binding met Ser201 (2,7 ), Ala199 (3,5 ) en Leu198 (3,3 ) zoals weergegeven in figuur 8c. Evenzo is de best gekoppelde conformatie van Ag-Cu NP's met de actieve plaats van FabI van S. aureus toonde H-binding met Gly202 (2,5 ) en Gln155 (2,5 Å) met een bindingsscore − 3.012 kcal/mol (Fig. 8d).

Bovendien is de bindingscapaciteit van Cu:Ag bimetaal NP's tegen FabH van E.coli werd ook geëvalueerd en de waargenomen bindingsscore was -4,372 kcal/mol met H-bindingsinteractie met Thr254 (3,5 ), HIE244 (2,6 Å) en Glu302 (3,0 Å) weergegeven in Fig. 8e.