Mierikswortelperoxidase-geencapsuleerde holle silicananospheren voor intracellulaire ROS-detectie

Samenvatting

Reactive zuurstofsoorten (ROS) zijn cruciaal in celsignalisering, maar hun overproductie drijft oxidatieve schade. Precieze, live-cel kwantificering van ROS is daarom essentieel voor zowel fundamentele biologie als klinische diagnostiek. Traditionele fluorogene probes gekoppeld aan mierikswortelperoxidase (HRP) lijden onder HRP's slechte membraandoorlaatbaarheid. Hier presenteren we mierikswortelperoxidase-geencapsuleerde holle silicananospheren (HRP@HSNs) gefabriceerd via een microemulsie-getemplateerde sol-gel-aanpak. Deze nanoreactoren behouden robuuste enzymatische activiteit, doorkruisen gemakkelijk celmembraan en tonen uitstekende biocompatibiliteit. Koppeling van HRP@HSNs met de dihydrorhodamine 123 (DHR123) sonde maakte kwalitatieve en semi-kwantitatieve detectie van intracellulaire waterstofperoxide (H₂O₂) in geactiveerde RAW 264.7 macrofagen mogelijk. Het platform kan gemakkelijk worden gefunctionaliseerd met targetterende liganden, wat organel- of celtype-specifieke ROS-imaging mogelijk maakt.

Achtergrond

ROS – waaronder superoxide, waterstofperoxide, hydroxylerradicalen, zuurstof in de enkele toestand en peroxynitriet – worden continu gegenereerd tijdens aerobe metabolisme, voornamelijk uit de mitochondriale elektronen-transportketen. Antioxidante verdediging, zowel enzymatisch (bijv. superoxidedismutase, catalase, peroxidasen) als niet-enzymatisch (vitamines A, C, E, uraat, bilirubine), neutraliseert deze soorten normaal. Onbalans leidt tot oxidatieve stress, die DNA, lipiden, eiwritten schadigt en bijdraagt aan ziekten zoals diabetes, kanker, cardiovasculaire en neurodegenerative ziekten (Alzheimer, Parkinson) [1–5].

Recente vooruitgang in fluorescente microscopie heeft niet-invasieve, enkel-cel ROS-imaging mogelijk gemaakt, grotendeels door ratiometrische of intensiteitsgebaseerde probes die fluoresceren na oxidatie van een niet-fluorescerende precursor [6–8]. Specificiteit is cruciaal; boronaat-gebaseerde probes richten zich bijvoorbeeld op H₂O₂ via een bio-orthogonale oxidatie [9]. Veel probes zijn echter instabiel in vivo, slecht weefselpenetrerend en worden snel nierlijk gecleared [12–14]. Strategieën zoals stabiliserende linkers, genetisch gecodeerde sensoren, bioluminescente reporters of PET-tracers zijn verkend [15–18]. Nano-formulaties verbeteren ROS-imaging verder door specificiteit en gevoeligheid te verhogen [19–22].

Enzymen met hoge katalytische activiteit zijn krachtige biosensoren, maar hun vrije vorm mist stabiliteit en membraandoorlaatbaarheid, wat intracellulair gebruik beperkt. Elektrode-gebaseerde HRP-sensoren zijn ongeschikt voor live-cel imaging. Encapsulatie van HRP in nanodeeltjesschillen kan het enzym beschermen en intracellulaire levering vergemakkelijken, zoals aangetoond met holle silicananospheren (HSNs) [25–27]. Deze studie evalueert HRP@HSNs voor intracellulaire ROS-detectie, met beoordeling van lading, activiteit, celopname, cytotoxiciteit en functionele imaging in macrofagen.

Methoden/Experimenteel

Chemicaliën en Reagentia

Decaan, n-hexanol (98 %), ammoniumhydroxide (35 % m/m), TEOS (98 %), APTMS (95 %), FITC en andere reagentia werden verkregen van ACROS en Sigma-Aldrich. HRP (type VI-A), DHR123, PMA en H₂O₂ (35 %) werden gekocht van Cayman en SHOWA Chemical Industry. Alle reagentia werden gebruikt zoals ontvangen.

Synthese van holle silicananospheren (HSNs)

HSNs werden bereid via een water-in-olie microemulsie met selectieve etching, volgens protocollen in ons eerdere werk [25, 29]. Kortweg: 20 mL decaan, 1,63 mL CA-520 en 550 µL n-hexanol werden gerold op 650 rpm, waarna 350 µL water werd toegevoegd om de microemulsie te vormen. APTMS (25 µL, 200 µL in 1,4 mL ethanol) en TEOS (100 µL) werden geïntroduceerd, gevolgd door 250 µL 35 % ammonia bij 20 °C. Na 10 u werd de emulsie gedestabiliseerd met 95 % ethanol; vaste silicananodeeltjes (SSNs) werden gecentrifugeerd (11.000 rpm, 20 min). SSNs werden geëtst in water bij 40 °C gedurende 40 min om holle schillen te verkrijgen, daarna gewassen en opgeslagen in 99,5 % ethanol.

Synthese van mierikswortelperoxidase-geencapsuleerde holle silicananospheren (HRP@HSNs)

De procedure spiegelt HSN-synthese, met substitutie van 350 µL water door 350 µL waterige HRP (10 mg mL⁻¹). HRP@HSNs werden opgeslagen in gedemineraliseerd water bij 4 °C.

Synthese van FITC-HSNs en HRP@FITC-HSNs

Om groene fluorescentie te introduceren, verving FITC-APTMS (10 mg FITC, 200 µL APTMS in 1,4 mL ethanol, 18 u, donker) het ethanoliche APTMS in de synthese, wat FITC-HSNs en HRP@FITC-HSNs opleverde.

HRP-encapsulatie-efficiëntie en laadcapaciteit

HRP gelabeld met RITC om RITC-HRP te creëren, geencapsuleerd tot RITC-HRP@HSNs. Na oplossing in 1 M NaOH werd fluorescentie gemeten (Hitachi F-4500, λ_ex = 543 nm, λ_em = 550–650 nm) en vergeleken met een kalibratiecurve. Encapsulatie-efficiëntie (%) = (massa RITC-HRP in nanospheren / initiële RITC-HRP) × 100; laadcapaciteit (µg HRP mg⁻¹ HSNs) werd dienovereenkomstig berekend.

HRP-activiteitsassay

HRP-activiteit gekwantificeerd met chromogeen substraat TMB. Enzymoplossingen (native HRP en HRP@HSN) gemengd met 20 µM TMB en 20 µM H₂O₂ in fosfaat/citraatbuffer (pH 5,2). Absorptie op 655 nm geregistreerd met BioTek Synergy-reader; activiteit afgeleid van native HRP-kalibratiecurve.

Reactiviteitsassay met verschillende ROS

DHR123 (20 µM) met of zonder HRP@HSNs (50 µg mL⁻¹) geïnculeerd met 100 µM ROS (H₂O₂, TBHP, superoxide, •OH, •OtBu) in DMEM (pH 7,4). Fluorescentie (λ_ex = 488 nm, λ_em = 530 nm) gemeten elke 5 min over 120 min.

Celkweek en vitaliteitsassay

RAW264.7 macrofagen gekweekt in DMEM + 10 % FBS + antibiotica bij 37 °C, 5 % CO₂. Voor vitaliteit, 2 × 10⁵ cellen/put gezaaid in 24-putplaten; na 24 u blootgesteld aan 0–200 µg mL⁻¹ nanodeeltjes in serumvrij DMEM voor 2 u. WST-1 reagent (Clontech) gebruikt voor vitaliteitsbeoordeling (450 nm, referentie 650 nm) met Bio-Rad 680-reader.

Celopname-analyse

1 × 10⁶ RAW264.7 cellen/put geïnculeerd met 0–200 µg mL⁻¹ FITC-gelabelde nanodeeltjes voor 2 u. Na wassen en trypsinisatie, opname gekwantificeerd door flowcytometrie; trypsine blauw kwiste extracellulaire fluorescentie.

Flowcytometrie van ROS-productie in PMA-gestimuleerde macrofagen

Na 2 u nanodeeltjesblootstelling en 30 min DHR123-lading, cellen gestimuleerd met 1 µg mL⁻¹ PMA voor 1 u voor analyse op FACS Canto II.

Kwantitatieve analyse

96-putplaten gezaaid met 3 × 10⁴ RAW264.7 cellen/put. Na 2 u nanodeeltjesbehandeling en 1 u PMA (gevarieerd) + DHR123 (20 µM) incubatie, fluorescentie gemeten (λ_ex = 488 nm, λ_em = 530 nm). Een kalibratiecurve (H₂O₂ + HRP@HSN) maakte conversie van fluorescentie naar H₂O₂-concentratie mogelijk.

Karakterisering

TEM (JEOL JEM-1200 EX II, 100 kV) bevestigde 45 nm holle kernen; uraanylacetaat-kleuring verifieerde interne HRP. Dynamische lichtverstrooiing (Malvern Zetasizer Nano ZS) beoordeelde hydrodynamische grootte en zetapotentiaal; cellen geïmageerd met Zeiss Axio Observer Z1.

Resultaten en Discussie

Ontwerp en synthese van HSNs en HRP@HSNs

HRP@HSNs geproduceerd via ammonia-katalyseerde sol-gel-chemie in een w/o microemulsie (Schema 1). TEM (Fig. 1) toont monodisperse 45 nm spheren; uraanylacetaat-kleuring bevestigt HRP-encapsulatie in de holle caviteit. DLS onthult hydrodynamische diameters van 188 ± 4 nm (HSNs) en 184 ± 6 nm (HRP@HSNs) in water, die stijgen tot 1,8–1,7 µm in serumvrij DMEM door aggregatie. Bovine serumalbumine (BSA) vermindert deze aggregatie, met stabiele 195–197 nm deeltjes.

HRP-encapsulatie-efficiëntie en laadcapaciteit

RITC-HRP-encapsulatie leverde ~6 % efficiëntie op over 11–33 nmol lading; de hoogste laadcapaciteit bereikte 12,5 ± 1,2 µg HRP mg⁻¹ HSN bij 33,3 nmol input. Hoewel de efficiëntie bescheiden is, toont het aan dat HRP bewaard kan worden in de nanocaviteit, en de lading kan afgestemd worden via enzymconcentratie.

Cytotoxiciteit en celopname

WST-1-assays tonen geen significante reductie in RAW264.7-proliferatie na 2 u of 26 u blootstelling aan tot 200 µg mL⁻¹ HSNs of HRP@HSNs, wat lage cytotoxiciteit aangeeft. FITC-gelabelde deeltjes bereikten >80 % label-efficiëntie bij >50 µg mL⁻¹ na 2 u, wat efficiënte intracellulaire levering zonder compromis van celvitaliteit bevestigt.

Reactiviteit van HRP@HSNs tegenover verschillende ROS

HRP-activiteitsassay toont ~40 % retentie van native activiteit na encapsulatie, waarschijnlijk door diffusielimitaties door de silicaschil. In celvrije assays is DHR123 alleen ongevoelig voor H₂O₂ of superoxide, maar reageert sterk met •OH en •OtBu. HRP of HRP@HSNs versterken fluorescentie voor alle geteste ROS, met hoger signaal van native HRP correlerend met hogere activiteit. Relatieve fluorescentieverhoudingen op 60 min onthullen dat beide HRP-varianten detectie van H₂O₂ en superoxide versterken, wat bevestigt dat de nanocaviteit katalytische functie behoudt terwijl substraten diffusie toestaan.

Intracellulaire ROS-detectie met HRP@HSNs

RAW264.7 cellen voorbehandeld met HRP@HSNs (2 u) en geladen met DHR123 (30 min) toonden aanzienlijk hogere fluorescentie na PMA-stimulatie vergeleken met controles. Flowcytometrie toont >2-voudige toename in R123-fluorescentie in gestimuleerde cellen; HRP@HSNs leveren additionele katalytische activiteit, terwijl platte HSNs een modeste fluorescentiestoename produceren, waarschijnlijk reflekerend cellulaire stressresponsen. Fluorescentie-intensiteit nam dosis-afhankelijk toe met zowel PMA (0,1–2 µg mL⁻¹) als HRP@HSNs (50–200 µg mL⁻¹). Representatieve confocale beelden bevestigen verbeterde intracellulaire ROS-imaging (Fig. 3d).

Toepassing van HRP@HSNs voor kwantitatieve H₂O₂-analyse

Met een externe H₂O₂-kalibratiecurve (0,625–15 µM) werd intracellulaire H₂O₂ gegenereerd door PMA-gestimuleerde RAW264.7-cellen gekwantificeerd. Cellen behandeld met 100 µg mL⁻¹ HRP@HSNs en 20 µM DHR123, daarna blootgesteld aan 0,1–2 µg mL⁻¹ PMA, leverden endogene H₂O₂-concentraties van ~10 µM bij ≥0,25 µg mL⁻¹ PMA. Deze semi-kwantitatieve meting demonstreert de bruikbaarheid van het platform voor het beoordelen van oxidatieve stress in levende cellen.

Conclusies

We hebben holle silicananospheren ontworpen die actieve HRP encapsuleren, wat robuuste intracellulaire ROS-sensoren creëert. Het poreuze silicaschil laat kleine substraten de geencapsuleerde enzym bereiken terwijl HRP beschermd wordt tegen proteolyse. Gekoppeld met DHR123, bieden HRP@HSNs verbeterde, semi-kwantitatieve detectie van endogene H₂O₂ in macrofagen onder oxidatieve stress. Oppervlaktefunctionaliserings met antilichamen of peptiden zal organel- of tumorcel-specifieke targetting mogelijk maken, en alternatieve lading (bijv. nanokatalysatoren of boronaat-probes) kan het detectierepertoire verbreden. Deze nanoreactoren vertegenwoordigen een veelzijdig platform voor gelijktijdige ROS-imaging, kwantificering en gerichte therapeutische levering in biomedisch onderzoek en klinische diagnostiek.

Afkortingen

APTMS

3-Aminopropyltrimethoxysilane

BSA

Bovine serumalbumine

DHR123

Dihydrorhodamine 123

DLS

Dynamische lichtverstrooiing

FITC

Fluoresceïne isothiocyaan

HRP

Mierikswortelperoxidase

HSNs

Holle silicananospheren

Igepal CA-520

Polyoxyethyleen (5) isooctylfenylether

mETC

Mitochondriale elektronen-transportketen

PET

Positronen-emissie-tomografie

PMA

Phorbol 12-myristaat 13-acetaat

R123

Rhodamine 123

RITC

Rhodamine B isothiocyaan

ROS

Reactive zuurstofsoorten

SSN

Vaste silicananodeeltjes

TBHP

Tert-butylhydroperoxide

TEM

Transmissie-elektronenmicroscopie

TEOS

Tetraethylorthosilicaat

TMB

3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine