Gerichte nanoliposome-afgifte van paclitaxel en P-gp-inhibitor via PD-L1-antistoom om multidrug-resistente maagkanker te overwinnen

Samenvatting

Multidrug-resistentie (MDR) gebaseerd op ATP-afhankelijke efflux-transporters (p-glycoproteïne (p-gp)) blijft een grote obstakel in succesvolle chemotherapiebehandeling. Hier onderzoeken we het potentieel van PD-L1 mAb-geconjugeerde nanoliposomen om te dienen als een gericht afgifteplatform voor de co-afgifte van paclitaxel (PTX) en p-gp-specifieke transportinhibitor (TQD, tariquidar) in medicijn-resistente maagkankers. Twee geneesmiddelen, PTX en TQD, werden in een enkele voertuig in een precieze verhouding geladen om de kans op een combinatie-chemotherapeutisch effect te vergroten. Cellulaire opname studie toonde aan dat PD-PTLP een hogere internalisatie-efficiëntie had in PD-L1-receptor overexprimerende SGC7901/ADR-cellen dan niet-gerichte PTLP. Hoogste synergie werd waargenomen bij een gewichtsverhouding van 1/0,5 (PTX/TQD) en de combinatie van PTX en TQD resulteerde in een duidelijk synergistisch effect vergeleken met die van individuele geneesmiddelen alleen. Onze in vitro resultaten toonden aan dat TQD effectief was in het omkeren van de multidrug-resistentie in SGC7901/ADR-cellen. De IC50-waarde van PD-PTLP was 0,76 μg/ml vergeleken met 6,58 μg/ml en 7,64 μg/ml voor PTX en TQD, respectievelijk. PD-TPLP ontlokte significant hogere niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en celdood (apoptose) vergeleken met die van vrij PTX of TQD. Verder toonde de in vivo antitumorstudie aan dat de combinatiechemotherapie van PD-PTLP een significante remming van de tumorlast van medicijn-resistente xeno-transplantatietumoren vertoonde met significant hogere terminale deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL)-positieve cellen. Verder resulteerde vrij PTX in een significante toename van de niveaus van AST en ALT, terwijl PD-PTLP niet significant verschilde ten opzichte van de controle, wat de veiligheidsindex aangeeft. Over het algemeen geloven we dat de combinatie van anticancergeneesmiddel met een p-gp-inhibitor een potentiële richting kan bieden voor de behandeling van medicijn-resistente maagtumoren.

Inleiding

Huidige chemotherapeutische behandelingen gebaseerd op een enkel geneesmiddelregime zijn ver van perfect en lijden onder ernstige bijwerkingen bij hogere doses en leiden tegelijkertijd tot de ontwikkeling van medicijnresistentie. Het afgelopen decennium heeft de hoge therapeutische effectiviteit van combinatiegeneesmiddelregimes in kankerbehandeling getuigd. Combinatie van twee of meer geneesmiddelen is aangetoond om synergistische antikankereffectiviteit op te leveren vanwege de verschillende farmacologische werking van de combinatiegeneesmiddelen. De keuze van de juiste combinatie van geneesmiddelen hangt echter af van meerdere factoren, waaronder kankerceltype, hydrofiel/hydrofoob geneesmiddelen, biochemische activiteiten en farmacokinetische patronen van de geneesmiddelen. Onder al deze factoren is de combinatie van geneesmiddelen selectief voor specifieke typen kanker.

Maagkanker is een wereldwijde gezondheidslast en de tweede meest voorkomende oorzaak van kankergerelateerde sterfte wereldwijd. De prevalentie van maagkanker is hoog in Oost-Azië, zoals Japan, Korea en China, waarbij China de hoogste sterftesijfer in de wereld rapporteert. Gemiddeld worden elk jaar 400.000 nieuwe gevallen geregistreerd in China en de meeste gevallen worden gediagnosticeerd in geavanceerde/late stadia. Er is enorme vooruitgang geboekt in behandelstrategieën; dit verbeterde de overlevingscijfers echter niet en resulteerde in therapieëc. De behandelingsmislukting wordt voornamelijk toegeschreven aan de ontwikkeling van chemoresistentie en ernstige toxiciteit van de chemotherapeutische dosis en herhaling van maagkankerepisodes. Daarom is er een dringende taak om de therapeutische effectiviteit te verbeteren en de metastasering en herhaling van maagkanker te overwinnen.

Paclitaxel (PTX) is een van de belangrijke geneesmiddelen aangewezen in de behandeling van maagkankers. PTX remt de celreplicatie door te interfereren met de afbraak van microtubuleren, wat leidt tot celcyclusarrest. De verwerving van multidrug-resistentie (MDR) is echter een groot hinderpaal voor het succes van chemotherapie. De ATP-afhankelijke efflux gemedieerd door transmembraan-transporters van de ATP-bindende cassette (ABC) familie, waarin p-glycoproteïne (p-gp) als de meest voorkomende factor wordt beschouwd, is overgeëxprimeerd in maagkankers. Andersom fungeert PTX als substraat voor p-gp-receptoren, waarbij medicijnefflux de intracellulaire medicijnconcentratie verlaagt, leidend tot lage effectiviteit en hoge resistentie. In dit opzicht is Tariquidar (TQD) een krachtige derde-generatie p-gp-inhibitor en is gerapporteerd om de over-expressie van p-gp-receptoren in verschillende kankercellen om te keren. Rapporten suggereerden echter dat TQD-administratie vroegtijdig moet worden beëindigd omdat het de p-gp-functie van het normale fysiologische systeem belemmert. P-gp-expressie is vereist om de bloed-hersenbarrière (BBB) te handhaven en toxicinen uit de normale weefsels te verwijderen. Aangezien p-gp aanwezig is in normale weefsels en fungeert als barrière tegen cellulaire toxicinen, kan niet-specifieke inhibitie van PTX of TQD potentiëel interfereren met de normale fysiologische functies en leiden tot schadelijke toxiciteit. Daarnaast zijn PTX en TQD sterk lipofiele geneesmiddelen met beperkte oplosbaarheid in waterige oplossingen en systeemisch bloed, wat de noodzaak van een stabiel geneesmiddelafgiftesysteem nodig maakt dat gericht is op de maagkankers in het lichaam.

Het geneesmiddelafgiftesysteem (DDS) verhoogde de concentratie van geencapsuleerde geneesmiddelen in de kankerweefsels significant en bood een vrijgeef van geneesmiddel voor een verlengde periode. In dit opzicht is liposoom een van de wijd gebruikte geneesmiddeldragers om de therapeutische effectiviteit in kankers te verbeteren. Liposomen hebben toenemend belang gekregen vanwege hun bio-compatibiliteit, structurele oppervlaktemodificaties, hydrofiel/lipofiele geneesmiddellading en hoge geneesmiddelladingscapaciteit. De geneesmiddelen kunnen stabiel worden geïncorporeerd in de lipide dubbellaag van het liposoom en eenvoudig voorzien van een lange circulatie-eigenschap (PEGylatie) door het verbeterde permeatie-en-retentie-effect (EPR). Recent is gerapporteerd dat liposomen de capaciteit hebben om meerdere geneesmiddelverhoudingen na intraveneuze toediening te behouden. Dit idee werd gedemonstreerd in 2017 na goedkeuring door de FDA, Vyxeos® (liposomale formulering) met verhoudingen van cytarabine:daunorubicine in de behandeling van leukemie. Vergeleken met niet-gerichte formuleringen, waren ligand-gerichte formuleringen zeer aantrekkelijk en veelbelovend. In dit opzicht is PD-1 een celoppervlakreceptor bekend om de afregeling van het immuunsysteem en het onderdrukken van T-cel-inflammatoire activiteit. PD-L1-expressie is gerapporteerd in 50% van de maagkankerpatiënten, wat PD-L1 maakt tot een doelreceptor voor nanopartikel-internalisatie. De PD-L1-monoklonale antistof (mAb) kan specifiek binden aan het extracellulaire domein van het PD-L1-eiwit en kan een uitstekende therapeutische strategie zijn om de antikankereffectiviteit te verbeteren.

De hoofddoel van de huidige studie was om de afgifte van combinatiegeneesmiddelen, PTX en TQD, te verbeteren om de antikankereffectiviteit tegen maagkankers te vergroten. Hiervoor werd PTX en TQD-geladen PD-L1/nanoliposoom geformuleerd en geëvalueerd op antikankereffectiviteit in in vitro- en in vivo-omstandigheden. De in vivo-effectiviteit werd geëvalueerd in een maagkankercel-gebaseerd xeno-transplantatiemodel en immunohistochemie (IHC) werd uitgevoerd.

Conclusie

Concluderend, ons werk realiseerde combinatietherapie tegen MDR-tumor door een geprogrammeerde afgiftestrategie. We hebben het potentieel gedemonstreerd van de combinatie van PTX en p-gp-inhibitor (TQD) in het remmen van de tumorlast van multidrug-resistente SGC7901/ADR xeno-transplantatietumoren. De co-afgifte van PTX en TQD in een multifunctionele nanodrager maakte de ratio-metriche controle van geladen antikankergeneesmiddelen mogelijk, remde de p-gp-effluxpomp en vertoonde synergistische antikankereffectiviteit. We geloven dat de combinatie van anticancergeneesmiddel met een p-gp-inhibitor een potentiële richting kan bieden voor de behandeling van medicijn-resistente tumoren.

Materialen en methoden

Formulering van PD-L1 mAb-geconjugeerde PTX/TQD-geladen nanoliposomen

Ei-phosphatidylcholine (EPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (DSPE-PEG), en DSPE-PEG2000-maleimide (DSPE-PEG2000-Mal) gemengd in een chlorofoormoplossing in een molaire verhouding van 3/2/0,5/0,25 samen met PTX en TQD en daarna werd het organische oplosmiddel verdampt met een rotatieverdamper gevolgd door vriesdrogen gedurende 3 uur. De lipide film werd gehydrateerd met een 250 mM ammoniumsulfaatoplossing gehandhaafd op pH 7,0. De grote multilamellaire liposomen werden 30 minuten gesoniced in een bad-type sonicator (Branson ultrasonicbath, VS) gehandhaafd op 65 °C. De liposomen gedialyseerd tegen een groot volume gedistilleerd water gedurende strikt 1 uur om het vrije geneesmiddel en de initiële componenten uit te wisselen. De liposomen werden opnieuw gedispergeerd in een fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4). De PD-L1 mAb werd geconjugeerd aan het liposoom door te mengen in een 8:1 (liposoom:mAb) verhouding en te incuberen bij 4 °C gedurende 4 uur. De PD-L1 mAb zal geconjugeerd worden aan de DSPE-PEG2000-Mal door interactie tussen sulfhydryl-residuen op de antilichamen tot de C-terminale maleimide-groepen van liposomen. De PD-L1-geconjugeerde liposomen werden gecentrifugeerd met 10.000 rpm gedurende 10 min en het supernataant werd verwijderd en opnieuw gedispergeerd in een PBS-buffer en opgeslagen bij 4 °C tot verdere analyse. De hoeveelheid PTX en TQD geencapsuleerd in het liposoom werd geëvalueerd door HPLC-methode. Agilent Technologies HPLC-systeem model 1260 Infinity uitgerust met een Agilent Technologies autosampler en G1315D diode-array-detector werd gebruikt in de studie. De mobiele fase bestaat uit een mengsel van acetonitril/water (70:30 v/v) gehandhaafd bij een stroomsnelheid van 1 ml/min. Een C18-kolom (5 μm, 150 × 60 mm, ODS-3) werd gebruikt om de monsters te elueren en gedetecteerd bij 227 nm. Voorafgaand aan, werd PTX/TQD-geladen liposoom opgelost in acetonitril en 15 minuten gevortexed, gefilterd door 0,45 μm filter, en 10 μl aliquot werd geïnjecteerd in de HPLC-kolom.

Grootteverdeling en deeltjesmorfologie-analyse

De grootteverdeling en zeta-potentiaal van geneesmiddelgeladen formuleringen werden bepaald door Malvern zetasizer (VK) bij 25 °C. Vóór het daadwerkelijke experiment werden nanopartikeldispersies 10× gedilueerd met gedistilleerd water en het experiment werd uitgevoerd bij een detectiehoek van 90° in drievoud. De morfologie van nanopartikels werd geëvalueerd door transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). De nanopartikeldispersies werden 10× gedilueerd met gedistilleerd water en in een koolstof-geladen koperen rooster geplaatst en gedroogd met IR-lamp en daarna werd het monster geëvalueerd door TEM (CM 30, Philips (Eindhoven, Nederland)) na kleuring met uranylacetaat (1% w/v).

Vrijgaveprofiel-analyse

Het vrijgaveprofiel van PTX en TQD uit nanoliposoom werd geëvalueerd door dialysemethode. Hiervoor werd 15 mg lyofiliseerd poeder van PD-L1 mAb-geconjugeerde PTX en TQD-geladen nanoliposomen (PD-PTLP) opgelost in 1 ml gedistilleerd water en verzegeld in een dialysemembraan (MWCO 3,5 kDa) en gedompeld in 30 ml van respectieve vrijgavebuffer gehandhaafd bij 37 °C. Op vooraf bepaalde tijden werden aliquoten van monsters onttrokken en vervangen door evenveel vrijgavebuffer. De studie werd voortgezet gedurende 72 uur. De monsters werden gefilterd door 0,22 μm spuitfilter en geïnjecteerd in de HPLC-kolom en geëvalueerd door de bovengenoemde methode.

Cellulaire opname studies

SGC7901/ADR-cellen werden gekweekt in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS en 100 IE/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine onder de omstandigheid van 5% CO₂-atmosfeer bij 37 °C. Een confocale laserscannermicroscoop (BX61WI; Olympus, Tokyo, Japan) werd gebruikt om de cellulaire distributie en cellulaire opname van PTLP en PD-PTLP in SGC7901/ADR-cellen te evalueren. Hiertoe werden 1 × 10⁵ cellen gezaaid in elk putje van een 12-putjesplaat en geïncuubeerd gedurende 18 uur. De cellen werden vervolgens blootgesteld aan PTLP en PD-PTLP en geïncuubeerd gedurende 3 uur. De cellen werden drie keer gewassen met koud PBS en gefixeerd met 4% paraformaldehyd (PFA) gedurende 10 minuten. De cellen werden opnieuw gewassen met PBS en gekleurd met 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) gedurende 10 minuten. Tenslotte werden de cellen zorgvuldig gewassen en waargenomen onder CLSM. Het competitie-experiment op de opname van PD-PTLP werd uitgevoerd door de cellen voor te behandelen met vrije PD-L1 mAb gedurende 30 minuten en te wassen. De cellen werden verdeeld in twee groepen, één behandeld met vrije PD-L1 mAb en de andere niet behandeld met vrije PD-L1 mAb. De cellen werden geïncuubeerd met PD-PTLP en geïncuubeerd gedurende 3 uur en dezelfde methode werd gevolgd voor de evaluatie van de cellulaire opname-analyse.

Eiwitexpressie door Western blot assay

De SGC7901/ADR-cellen werden gezaaid in een 6-putjesplaat bij een zaaidichtheid van 3 × 10⁵ cellen/put en geïncuubeerd gedurende 18 uur. De cellen werden behandeld met verschillende formuleringen (PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP) en geïncuubeerd gedurende 24 uur. Cellen werden gewassen en geëxtraheerd met strippingbuffer en gelyseerd met een standaard lyseringsbuffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, VS). De cellen werden gecentrifugeerd met een snelheid van 12.000 rpm gedurende 15 min en het supernataant werd verzameld en eiwitkwantificering werd uitgevoerd met BCA-eiwitassay (Beyotime). Gelijke hoeveelheid eiwitten werd geladen in 8% SDS-PAGE-geel en vervolgens overgebracht op een nitrocellulose-membraan (EMD Millipore, Billerica, MA, VS). Het membraan werd geblokkeerd met 5% magere melk gedurende 1 uur om de niet-specifieke bindingsplaatsen te remmen. Het membraan werd geïncuubeerd met primaire antilichamen (p-gp en GAPDH, 1:1000, Abcam, MA, VS) bij 4 °C overnacht. Het membraan werd gewassen met TBST en opnieuw geïncuubeerd met secundaire antilichamen van per-oxidase-gelabelde geit-anti-konijn of -muis antilichamen (konijn of muis, 1:10.000, Abcam, MA, VS) bij kamertemperatuur. De membranen werden opnieuw gewassen met TBST. De blotten werden gevisualiseerd onder een versterkte chemiluminescentiemethode (EMD Millipore).

In vitro cytotoxiciteitsanalyse

Het cytotoxische effect van individuele geneesmiddelen en formuleringen werd geëvalueerd door MTT-assay. Kortweg, kankercellen worden gelaagd met een dichtheid van 1 × 10⁴ cellen/put in een 96-putjesplaat en geïncuubeerd gedurende 18 uur. De cellen werden vervolgens behandeld met vrij PTX, TQD, PTLP en PD-PTLP, respectievelijk gedurende 24 uur. Vervolgens werden de cellen zorgvuldig gewassen en toegevoegd met 15 μl van 5 mg/ml MTT-oplossing en onderworpen aan 3 uur extra incubatie en daarna werd 100 μl DMSO toegevoegd om de formazankristallen te extraheren. De resulterende absorbantie werd gemeten bij 570 nm met een geautomatiseerde microplaatlezer. Cellevensvatbaarheid wordt berekend door OD van testgroep/OD van controle × 100%. De combinatie-index werd geëvalueerd door CalcuSyn™ software. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd.

In vitro apoptose- en reactieve zuurstofsoorten analyse

Voor apoptose-assay werden kankercellen gelaagd met een dichtheid van 2 × 10⁵ cellen/put in een 12-putjesplaat en geïncuubeerd gedurende 18 uur. De cellen werden vervolgens behandeld met vrij PTX, TQD, PTLP en PD-PTLP, respectievelijk gedurende 24 uur. De cellen werden geëxtraheerd door stripping en gecentrifugeerd en de pellets werden opnieuw gedispergeerd in 100 μl bindingsbuffer. De cellen werden gekleurd met een combinatie van 5 μl Annexin-V/FITC en 2,5 μl PI-werkoplossing en geïncuubeerd gedurende 15 minuten. De gekleurde cellen werden geanalyseerd door stroomcytometer met een BD FACS Calibur (BD Biosciences, CA, VS). De Annexin-V en PI vertegenwoordigen de vroege apoptose-indicator en late apoptose-indicator gebaseerd op de structurele componenten van levende en dode cellen, respectievelijk.

De 2,7-dichlorofluorescine diacetaat (DCFH-DA) werd gebruikt als een probe voor de reactieve zuurstofsoorten (ROS) analyse. Voor kwantitatieve analyse werden 1 × 10⁴ cellen/put gezaaid in een 96-putjes zwarte-bodem plaat en geïncuubeerd gedurende 18 uur. De cellen werden vervolgens behandeld met vrij PTX, TQD, PTLP en PD-PTLP, respectievelijk gedurende 24 uur. De cellen werden gewassen met PBS-buffer en daarna geïncuubeerd met 1 ml DCFH-DA-oplossing volgens de richtlijnen van de fabrikant gedurende 30 minuten. Vervolgens werden cellen gelyseerd en gecentrifugeerd met 10.000 rpm gedurende 15 min. Het resulterende supernataant werd overgebracht naar een nieuwe 96-putjesplaat en de fluorescentie werd gemeten bij 485 nm met een geautomatiseerde microplaatlezer. Gelijktijdig werd een aparte set cellen op dezelfde manier verwerkt en beelden waargenomen met fluorescencemicroscoop (Nikon A1, Japan).

Antitumor effectiviteit van PD-PTLP in xeno-transplantatiemodel

De antitumor-effectiviteitstudie werd uitgevoerd in BALB/c naakte muizen en verkregen van Laboratory Animal Center, The Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de nationale standaarden voor laboratoriumdierenkwaliteit. De experimenten werden strikt uitgevoerd in overeenstemming met de Richtlijnen voor Experimentele Dieren Commissie van The Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin. De dieren werden subcutaan geïnjecteerd met 1 × 10⁶ SGC7901/ADR-cellen in 150 μl kweektmedium in de rechterflank van de muizen. De tumoren werden toegestaan te groeien tot 100 mm³ voordat het daadwerkelijke experiment. De muizen werden gelijkmatig verdeeld in vijf groepen met acht muizen in elke groep. De individuele dosis van PTX en TQD werden vastgelegd op 5 mg/kg, terwijl de combinatie een totale dosis van 5 mg/kg gebruikte. De staartveneninjectie was elke derde dag, in totaal werden drie injecties uitgevoerd. Op vooraf bepaalde dagen werden tumorvolume en lichaamsgewicht gemeten. Het tumorvolume werd berekend door de langste diameter en kortste diameter van de tumoren te meten met een digitale schuifmaat. Tumorvolume (V) = ½ × lengte × breedte (mm)². De muizen werden geofferd aan het einde van de studie en de tumor werd geëxtraheerd en geweegd. De tumor werd onderworpen aan immunohistochemische (IHC) analyse. De tumoren werden geëxtraheerd, in een dun stuk gesneden en vastgezet in 10% formoline-oplossing. De tumoren werden ingebed in paraffinewas en vervolgens de TUNEL-assay uitgevoerd volgens de richtlijnen van de fabrikant.

Serum biochemische analyse

De muizen werden geadministreerd met respectieve formuleringen; 24 uur later werden de muizen geofferd en bloedmonsters verzameld van de controle- en test-behandelde diergroepen. Het serum werd gescheiden van het heel bloed en opgeslagen bij −80 °C tot verdere analyse. Serum biochemische analyse werd uitgevoerd om de prestaties van de lever te beoordelen. Aspartaat-transaminase (AST) en alanine-transaminase (ALT) werden gemeten om de leverfunctie te evalueren. Alle metingen werden uitgevoerd volgens de procedures van de biochemische kit-assay.

Resultaten en discussie

Voorbereiding en karakterisering van PTX/TQD-geladen PD-L1-geconjugeerde nanoliposomen

PTX is wijd gebruikt in de kliniek en voornamelijk aangewezen in de behandeling van maagkankers. Echter, de meerderheid van de patiënten lijkt te lijden onder slechte therapeutische respons door multidrug-resistentie (MDR) van de maagkankers. Een toename van de dosis van PTX resulteerde in verhoogde systemische toxiciteit, waardoor MDR een groot obstakel werd in de succesvolle kankertherapiebehandeling. Onder de overvloed aan MDR-mechanismen wordt p-gp-gemedieerde medicijnefflux beschouwd als primair verantwoordelijk voor de medicijnresistentie in kankercellen. Daarom hebben we in deze studie een tweede geneesmiddel (TQD) als p-gp-inhibitor gebruikt om het MDR-fenomeen in de kankercellen te overwinnen en de antikankereffectiviteit van PTX te verbeteren. We hebben de gewichtsverhouding van twee geneesmiddelen waarin ze het synergistische effect vertonen, zorgvuldig bestudeerd. Om het antikankereffect te maximaliseren, is het belangrijk om meerdere geneesmiddelen in een enkel nanopartikelsysteem co-te leveren. Levering van twee geneesmiddelen (PTX en p-gp-inhibitor) tegelijkertijd zal de efficiënte onderdrukking van het medicijneffluxmechanisme toelaten en de kans op verhoogde intracellulaire concentraties in de kankercellen vergroten. Hiervoor hebben we in deze studie twee geneesmiddelen in de lipide dubbellaag van nanoliposomen geladen, die als extreem stabiel in de systemische circulatie worden beschouwd (Fig. 1). Om de verhoogde tumor-specifieke targeting te bereiken, werden nanoliposomen oppervlakte-geconjugeerd met PD-L1 mAb. De maleimide-groep aanwezig in het nanoliposoom zal binden met de thiol-groep van PD-L1 mAb en een stabiele covalente binding vormen. Maar een mogelijke beperking van maleimide-conjugatie is dat de reactie reversibel is: het product kan retro-Michael-additiereacties ondergaan met biologische thiolen in plasma wat kan leiden tot de vrijgave van de maleimide. Echter, we hebben dergelijke reactie overwonnen door maximale oppervlakteconjugatie van antilichaam op de maleimide-liposoom. Het is gerapporteerd dat tumor-targeting-ligand specifiek de therapeutische lading in de tumorweefsels zal afleveren en onnodige bijwerkingen in normale weefsels zal vermijden. Vroeger rapporteerden Patel et al. dat incorporatie van p-gp-inhibitor met PTX de MDR in de eierstokkankercel kon overwinnen bij in vitro-omstandigheden. Op dezelfde manier rapporteerden Zou et al. en Zhang et al. dat de PTX-cytotoxiciteit tegen SKOV-3TR en A2780-Adr multidrug-resistente cellen significant toenem in de aanwezigheid van Tariquidar. Echter, in deze studies werd ofwel fysieke combinatie van PTX + TQD gebruikt of een niet-gerichte drager ontwikkeld. Belangrijk is dat al deze studies alleen bij in vitro-omstandigheden zijn uitgevoerd. De huidige studie richtte zich op het ontwerpen van de gerichte nanodrager met behulp van een relatief nieuwe klasse van targeting-agent, PDL1-antistof. Daarnaast toonde de huidige studie de effectiviteit van PTX + TQD in xeno-transplantatietumormodel en beoordeelde ook de bloedparameters om te relateren met de systemische toxiciteit.

De gemiddelde deeltjesgrootte van PTLP was 135,6 ± 1,26 nm terwijl het toegenomen tot 168,59 ± 1,34 nm na conjugatie met PD-L1 mAb (PD-PTLP). De deeltjesgrootte nam toe door het grote molecuulgewicht van PD-L1 mAb; niettemin was de algehele grootte minder dan 200 nm en bolle vorm het punt om op te merken (Fig. 2a). Nanopartikels met een grootte kleiner dan 200 nm zullen een hogere accumulatie in tumorweefsels toelaten dankzij het verbeterde permeatie-en-retentie-effect (EPR). Daarnaast zal de aanwezigheid van PEG een verlengde bloedcirculatietijd in de systemische circulatie toelaten. Het zeta-potentiaal van PD-PTLP was 22,1 ± 1,21 mV wat geen niet-specifieke binding aan bloedcomponenten toelaat. PD-PTLP vertoonde een hoge insluitefficiëntie van ~95% voor beide geneesmiddelen (PTX en TQD). PD-PTLP vertoonde ook een hoge geneesmiddellading van 12-14% w/w voor PTX en TQD, respectievelijk (Fig. 2b).

In vitro geneesmiddelvrijgave

Het vrijgavegedrag van PTX en TQD uit PD-PTLP werd bestudeerd in pH 7,4 en pH 5,0 omstandigheden bij 37 °C. Zoals getoond in Fig. 2c, werd een gecontroleerde vrijgave van geneesmiddelen (PTX en TQD) waargenomen uit de PD-PTLP gedurende de studietijdperk (72 uur). De vrijgave van geneesmiddel uit de dikke dubbellaag van nanoliposoom kan verantwoordelijk zijn voor de langzame en continue vrijgave van twee geneesmiddelen uit de PD-PTLP. Het moet worden opgemerkt dat geen significant verschil werd waargenomen in het vrijgavepatroon van PTX en TQD in pH 7,4 en pH 5,0. Op langere tijdstippen werd significant verschil in vrijgave waargenomen in verschillende pH-omstandigheden. Het is de moeite waard op te merken dat geen pH-responsieve elementen werden toegevoegd in het nanoliposoom en hogere geneesmiddelvrijgave in zuure omstandigheden kan worden toegeschreven aan de hogere diffusie bij lagere pH. Bijvoorbeeld, ~85% van PTX vrijgegeven in pH 5,0 omstandigheden vergeleken met ~55% geneesmiddelvrijgave bij fysiologische pH-omgeving. Een vergelijkbaar patroon van snelle vrijgave van kleine moleculen bij zuure omstandigheden en langzamere vrijgave in basische pH-omstandigheden is gedemonstreerd door andere onderzoekers. Niettemin kan relatief lage geneesmiddelvrijgave in pH 7,4 omstandigheden onnodige systemische bijwerkingen verminderen en de systemische circulatie verlengen, terwijl hogere geneesmiddelvrijgave in pH 5,0 de hogere therapeutische effectiviteit in de tumorweefsels kan bevorderen.

In vitro cellulaire opname-analyse

De afgifte-efficiëntie van gerichte (PD-PTLP) en niet-gerichte (PTLP) nanoliposomen werden getest in SGC7901/ADR. De cellulaire opname werd geëvalueerd met behulp van rhodamine-B als fluorescentie-tracker. Rhodamine-B is de veelvoorkomende fluoroforen zonder celbiologische interacties. De celkern werd gekleurd met blauw-gekleurde DAPI en rode kleur afkomstig van de nanopartikels. De CLSM-data onthullen duidelijk dat PD-PTLP een sterke rode fluorescentie in de kankercellen vertoonde vergeleken met die van niet-gerichte PTLP. Een hogere rode fluorescentie in PD-PTLP-behandelde kankercellen toegeschreven aan de hogere nanopartikel-internalisatie (Fig. 3a). Het resultaat van de CLSM-data geeft aan dat de PD-L1-receptor geëxprimeerd op het celmembraan herkend werd door PD-L1 mAb geconjugeerd op het nanoliposoom-oppervlak. Een niet-specifiek of passief opnamemechanisme was duidelijk in de PTLP-behandelde kankercellen. De PD-L1-doelspecificiteit werd verder bevestigd door PD-L1 mAb voorbehandelingsexperiment. De SGC7901/ADR-cellen werden voorbehandeld met PD-L1 mAb en geïncuubeerd gedurende 30 minuten. De cellen werden vervolgens blootgesteld aan PD-PTLP en PTLP en geïncuubeerd gedurende 3 uur. Zoals getoond (Fig. 3b), toonden cellen voorbehandeld met PD-L1 mAb aanzienlijk minder rode fluorescentie vergeleken met die van niet-behandelde cellen, wat aangeeft dat PD-L1 mAb werd geconsumeerd door de oppervlakte-geëxprimeerde receptoren en geen additionele receptoren beschikbaar waren voor binding en internalisatie, resulterend in minder opname van nanopartikels en minder internalisatie. Deze CLSM onthulden duidelijk de targetingspecificiteit van PD-PTLP in SGC7901/ADR-kankercellen.

Dubbel geneesmiddel-geladen nanoliposomen verbeteren antiproliferatief effect

Voor combinatietherapie werden verschillende verhoudingen van twee geneesmiddelen (PTX en TQD) gebruikt om de mate van synergistisch of additief effect op de resistente maagkankercellen vast te stellen. Om de isobologram en combinatie-index (CI) te berekenen, werd CalcuSyn software (Biosoft, Versie 2.1) gebruikt. Het isobologram-plot kan worden uitgelegd op basis van de Chou-Talalay-vergelijking. De CI-waarden worden gekarakteriseerd door synergistisch (CI < 0,9), additief (CI = 1) en antagonistisch (CI > 1). Zoals getoond, onthulde alle combinatieverhouding van PTX en TQD een CI-waarde van < 1, wat een synergistisch werkingsmechanisme betekent (Fig. 4a). Om specifiek te zijn, werd de hoogste synergie waargenomen bij een gewichtsverhouding van 1/0,5 (P/T), terwijl het niveau van synergie afnam met de toename van de TQD-gewichtsverhouding, wat het belang van de aanwezigheid van twee geneesmiddelen in specifieke gewichtsverhouding aangeeft. Te lage en te hoge concentratie van TQD in een combinatieregime leverde niet het beste synergistische effect op. Voor alle in vitro-experimenten hebben we P/T = 1/0,5 verhouding in de studie gebruikt.

Het in vitro cytotoxische effect van individuele alsook combinatiegeneesmiddelen werd bepaald door MTT-protocol na 24-uurs incubatie. Zoals getoond in Fig. 4b, had lege NP geen effect op de cellevensvatbaarheid, wat de mogelijkheid van enige interferentie in de uiteindelijke resultaten uitsloot. De monotherapie met PTX en TQD toonde wel een concentratie-afhankelijk cytotoxisch effect in de resistente maagkankercellen; het viel kort van waardeerbare effectiviteit in behandeling. Het antiproliferatieve effect van enkel agent was aanzienlijk verbeterd toen gecombineerd met het tweede geneesmiddel geencapsuleerd in een nanoliposoom. De combinatie van PTX en TQD resulteerde in een duidelijke synergistische effect vergeleken met die van individuele geneesmiddelen alleen. Bovendien vertoonde PD-L1 mAb-geconjugeerde nanoliposoom (PD-PTLP) het sterkste antiproliferatieve effect, wat de invloed van de targeting-ligand op het nanopartikelen-oppervlak aangeeft. Deze verbeterde celdoding in de PD-L1-gerichte behandelgroep kan worden toegeschreven aan de hoge cellulaire internalisatie van PD-L1-gerichte nanoliposomen door SGC7901/ADR-cellen consistent met de cellulaire opname-analyse. De IC50-waarde van PD-PTLP was 0,76 μg/ml vergeleken met 6,58 μg/ml en 7,64 μg/ml voor PTX en TQD, respectievelijk. Een tienvoudige afname in IC50-waarde van PD-PTLP geeft duidelijk aan dat resistentie tegen PTX in p-gp overexprimerende SGC7901/ADR omgekeerd werd door TQD. Onze in vitro resultaten toonden aan dat TQD effectief was in het omkeren van de multidrug-resistentie in SGC7901/ADR-cellen. Resultaten toonden ook aan dat nanoliposomen de farmacologische werking van geencapsuleerde geneesmiddelen behielden en het geneesmiddel op een gecontroleerde manier in de kankercellen vrijgaven. De combinatietherapie met PTX en TQD verbeterde de antikankereffectiviteit met verhoogde synergistische activiteit, wat de minimale voordelen van monotherapie en mogelijke bijbehorende bijwerkingen overtreft. Over het algemeen kan combinatiebehandeling van PTX met een effectieve p-gp-inhibitor in nanoliposoom een veelbelovende strategie zijn om MDR te overwinnen en maagkankers te behandelen.

Om het moleculaire mechanisme te evalueren, werd Western blot-analyse uitgevoerd op SGC7901/ADR. Zoals getoond (Fig. 4c), had PTX geen effect op de p-gp-eiwitexpressie, terwijl TQD de p-gp-expressie significant down-reguleerde, wat haar farmacologische rol als p-gp-inhibitor bevestigt. Interessant genoeg toonden combinatiegeneesmiddel-gebaseerde PTLP en PD-PTLP onbeduidend verschil in eiwitexpressie vergeleken met die van TQD-behandelde kankercellen. Het resultaat demonstreerde het voordeel van het laden van PTX en TQD (p-gp-inhibitor) samen in een enkel nanodragersysteem. Het Western blot-resultaat kon worden gecorroborneerd met de cellevensvatbaarheidsresultaten waar combinatie van PTX + TQD de MDR omkeerde en hogere antikankereffectiviteit vertoonde in maagkankercellen.

Apoptose-analyse door stroomcytometer

Apoptose-analyse van individuele formulering werd geëvalueerd door Annexin V-FITC/PI-kleuringsmethode met behulp van stroomcytometer. Resultaten van apoptose worden gepresenteerd in Fig. 5a. Zoals getoond, toonden controlecellen geen teken van apoptose, terwijl vrij PTX en TQD duidelijke toename in de apoptosecellen vertoonden. Combinatiegeneesmiddel-gebaseerde PTLP toonde twee keer hogere apoptose vergeleken met die van individuele geneesmiddelen, wat het synergistische antikankereffect van de formuleringen aangeeft. Belangrijker nog, PD-PTLP toonde de hoogste apoptose van kankercellen met ongeveer 60% onder apoptose-regio. Verbeterde apoptose-effect van PD-PTLP werd toegeschreven aan hogere internalisatie van dubbel-geneesmiddel-geladen nanodragers en synergistisch potentieel van PTX en TQD in een ratio-metriche manier. Het p-gp-silencing-effect van TQD in combinatieregime verbeterde het antikankereffect van PTX in de kankercellen. De apoptosesnelheid van individueel geneesmiddel lag in het bereik tussen 20 en 25% terwijl ongeveer 60% apoptosecellen werden waargenomen voor PD-PTLP-behandelde cellen. PD-PTLP induceerde meer apoptose dan vrije geneesmiddelen en niet-gerichte liposomen, wat suggereert dat PD-L1 PTX/TQD efficiënter kon afleveren om apoptose van de SGC7901/ADR-cellen te induceren.

Intracellulaire ROS-niveau bepaling

We hebben de capaciteit van individueel geneesmiddel en dubbel geneesmiddel onderzocht om de redoxtoestand van de kankercellen te beïnvloeden door het niveau van reactieve zuurstofsoorten (ROS) in maagkankercellen te evalueren. ROS-niveaus in kankercellen werden geëvalueerd door DCFH-DA (groene fluorescentie). Kwantitatieve ROS-data worden gepresenteerd in Fig. 5b. Zoals getoond, hadden niet-behandelde cellen geen teken van ROS; echter, PTX of TQD induceerden waardeerbare niveaus van ROS-generatie. Belangrijk, TPLP en PD-TPLP ontlokten significant hogere niveaus van ROS vergeleken met die van vrij PTX of TQD of niet-behandelde controlecellen. Een opmerkelijk hogere ROS geeft het potentieel van PD-TPLP aan om hogere apoptose te bevorderen. Microscopische beelden bevestigen de kwantitatieve resultaten met helderste en hogere intensiteit groene fluorescentie vergeleken met onbehandelde of vrij PTX of TQD-behandelde kankercellen. De hogere intensiteit van groene fluorescentie is een indicatie van hogere ROS-productie. Oxidatieve stress zoals ROS wordt beschouwd als een belangrijke indicator van cellulaire cytotoxiciteit. Studies hebben getoond dat inductie van ROS een reeks fysiologische gebeurtenissen induceert, waaronder DNA-schade, inflammatie en celdood (apoptose).

Combinatie van PTX en TQD remde groei in medicijn-resistente tumoren

Ten slotte werden therapeutische effectiviteit en toxiciteitsparameters van formuleringen onderzocht op medicijn-resistent SGC7901/ADR xeno-transplantatietumormodel (Fig. 6a). De geneesmiddelen werden intraveneuze geadministreerd bij een vaste dosis van 5 mg/kg elke 3 dagen met in totaal drie injecties. De PTX/TQD werd geadministreerd bij een vaste gewichtsverhouding van 1/0,5. Op de verwachte lijn toonden vrij PTX en vrij TQD geen remmend effect op de groei van MDR-tumoren, wat suggereert dat de SGC7901/ADR-cellen medicijntolerantie vertonen op de proliferatie van MDR-tumoren. P-gp-inhibitor (TQD) hoewel efficiënt in het remmen van de medicijneffluxpompen, converteert niet in verbeterde therapeutische uitkomst. In vergelijking toonde combinatie van PTX + TQD (PTLP) een significante remming van de groei van medicijn-resistente tumoren. De beste antitumor-effectiviteit werd waargenomen met PD-PTLP, wat driemaal effectief was vergeleken met controle, 2,5 vergeleken met vrije geneesmiddelen, en ongeveer twee keer effectief in het verminderen van de tumorlast vergeleken met niet-gerichte formuleringen (p < 0,05; p < 0,001). Het eindige tumorvolume van controle, vrij PTX, TQD, PTLP en PD-PTLP was ~2000 mm³, ~1650 mm³, 1625 mm³, ~1000 mm³ en ~650 mm³, respectievelijk. Vrije geneesmiddelen waren iets effectief tijdens het initiële tijdstip; echter, ze groeiden hetzelfde als die van niet-behandelde controle-groep. Resultaten onthullen duidelijk het potentieel van combinatie van PTX + p-gp-inhibitor als unieke strategie om de tumorlast effectief te controleren. De uitgebreide tumoronderdrukking in PD-PTLP suggereert duidelijk de grotere antitumor-effectiviteit van de gerichte formuleringen-groep. De tumoren werden geëxtraheerd en geweegd; tumorgewichten waren consistent met de tumorvolumedata (Fig. 6b). PD-PTLP-behandelde muizengroep toonde de kleinste tumor vergeleken met elke andere formulering-behandelde groep (p < 0,001). Om de inhibitor-effect van individuele tumoren verder te verifiëren, werden tumoren onderworpen aan TUNEL-assay (Fig. 6c). Zoals getoond, toonde PD-PTLP grote gebiedjes van apoptose-kleuring vergeleken met niet-behandelde controle of vrije geneesmiddelen. PD-PTLP toonde duidelijke apoptose-kenmerken met ongerangschikte celarrangementen. De prominente tumordoding-effect van PD-PTLP toont de grotere kankercelremming in medicijn-resistente tumorcellen. De uitstekende effectiviteit van PD-PTLP werd voornamelijk toegeschreven aan de aanwezigheid van gerichte ligand (PD-L1 mAb) die bindt met de respectieve receptoren en de intracellulaire concentraties verhoogt. De aanwezigheid van combinatieregime en vrijgave op een gecontroleerde manier voor verlengde tijd droeg ook bij aan de verbeterde effectiviteit. Daarnaast kan een dense hydrofiele PEG-oppervlakte-corona uitstekende fysieke stabiliteit aan de deeltjes bieden en potentiëel onnodige eiwitafsheid vermijden en snelle clearance vermijden. De lange circulatie en nano-grote grootte zorgen op hun beurt voor hogere accumulatie van deeltjes in de tumorweefsels.

Systemische toxiciteitsanalyse

De verandering in lichaamsgewicht is een goede indicator van systemische toxiciteit. Zoals getoond (Fig. 7a), losten muizen behandeld met vrij PTX ~20% van lichaamsgewicht op dag 10 wat geleidelijk afnam om het oorspronkelijke lichaamsgewicht te herwinnen naar het einde van de studie. Verlies van meer dan 5% van lichaamsgewicht wordt beschouwd als ernstige interne toxiciteit en 20% lichaamsgewichtsverlies wordt beschouwd als een significant nadelig effect van vrije geneesmiddelen. In tegenspraak, PTLP of PD-PTLP veroorzaakten geen dergelijke verlies van lichaamsgewicht en de muizen bleven gezond gedurende de studietijdperk, wat de veiligheidsindex van de nanoliposomen aangeeft. Afgiftesysteem zonder systemische toxiciteit en verbeterde antitumor-effectiviteit wordt beschouwd als hoogst effectief in tumorbehandeling. De veiligheid van nanopartikels werd verder bestudeerd door plasma-niveaus van enzymen te meten. Plasma-niveaus van aminotransferasen (AST en ALT) werden gemeten na de 24-uurs administratie van respectieve formuleringen (Fig. 7b, c). Zoals getoond, resulteerde vrij PTX in significante toename (p < 0,01) in de niveaus van AST en ALT terwijl PD-PTLP en PTLP onbeduidend verschillen vergeleken met die van niet-behandelde controle. AST wordt vrijgegeven in serum bij orgelschade zoals hart, nieren of lever, terwijl ALT specifiek vrijgegeven wordt in geval van leverschade. De niveaus van AST en ALT dienen als specifieke indicator van orgelschade en in dit opzicht toonde PD-PTLP een veilige drager te zijn.