Snelle, Gevoelige Fluorescentie-Immunoassay voor CYFRA 21-1 met Koolstofkwantumdot/Zinkoxide Nanocomposiet

Samenvatting

De snelle detectie van longkanker in vroege stadia met behulp van het antigen cytokeratine-19 fragment (CYFRA 21-1) als tumormarker in humaan serum speelt een belangrijke rol in de overleving van patiënten en het nemen van snelle chirurgische maatregelen. Deze studie had als doel de groen gesynthetiseerde koolstofkwantumdot-gekoppelde zinkoxide nanocomposiet te gebruiken als een hooggevoelige fluorescentie-immunosensing oplossing voor snelle bepaling van CYFRA 21-1 antigen in humaan serum. De voorgestelde methode werd uitgevoerd door een hydrothermale methode toe te passen om koolstofkwantumdots te prepareren met behulp van Citrus lemon perikarp. De gevormde koolstofkwantumdots werden gebruikt in de reductie en stabilisatie van zinkacetaat om koolstofkwantumdot-zinkoxide nanocomposiet te synthetiseren. Om een sandwich-kapping antistof-antigen-antistof immunosensing systeem te vormen, werd een CYFRA 21-1 antigen gevangen door het immobiliseren van een niet-geconjugeerd monoklonaal antistof BM 19.21 op het oppervlak van het koolstofkwantumdot-zinkoxide nanocomposiet en een ander monoklonaal antistof KS 19.1, dat gecoat was op de microtiterputoppervlakte. Dit systeem heeft een instelbare fluorescentie-eigenschap gemeten bij excitatie en emissie van λ_ex = 470 en λ_em = 520 nm, respectievelijk. Het voorgestelde nanocomposiet fluorescentie-immunosensing systeem vertoonde een lineaire relatie van 0,01–100 ng mL⁻¹ met een detectielimiet van 0,008 ng mL⁻¹. Het voorgestelde immunosensing systeem gebaseerd op koolstofkwantumdot-zinkoxide nanocomposiet biedt een veelbelovende benadering voor snelle diagnose van longkanker door detectie van CYFRA 21-1 in humaan serum.

Inleiding

Longkanker is de meest voorkomende en agressieve kankersoort met grote uitdagingen in medische behandeling. Tumorreccidief en metastasering worden beschouwd als de belangrijkste doodsoorzaken voor longkankerpatiënten. De tumormarker cytokeratine-19 fragment (CYFRA 21-1) is een fragment dat voorkomt in zowel normale als maligne epitheele cellen. Het kan geschat worden met behulp van een sandwich immuno-radiometrische assay. Vroegere studies toonden aan dat in maligne stadia van longkanker, CYFRA 21-1 in de bloedsomloop van patiënten vrijkomt en verhoogd is in hun serum. Daarom is het mogelijk om de overleving van longkankerpatiënten te verbeteren door vroege detectie en consequent snelle chirurgische reactie.

Er zijn weinig technieken eerder gerapporteerd voor de detectie van CYFRA 21-1, waaronder enzyme-immunoassay, electrochemiluminescentie-immunoassay en immunoradiometrische assay. Een voordelige strategie voor het verbeteren en verbeteren van de gevoeligheid van CYFRA 21-1 in humaan serum blijft een zorg.

In de laatste jaren is grote vooruitgang en explosieve groei van nanotechnologie bereikt in bijna alle levensgebieden. Onder die gebieden vallen geneesmiddelverstrekkingssystemen, farmaceutische analyse, katalytische activiteitsreacties, medische toepassingen, kankertumormarkers en weefselimaging.

Tegenwoordig hebben fluorescentie (FL)-gebaseerde sensing technieken veel onderzoekers getrokken vanwege hun eenvoudige ontwerp en uitstekende gevoeligheid. Verschillende FL sensorische materialen zijn ontworpen en gesynthetiseerd voor biologische monitoring. De FL systemen voor biologische bepaling zijn hoogst luminescerend, waterdispergeerbaar, chemisch stabiel en niet-toxisch. Er zijn verschillende immunosensing fluorescentie-gebaseerde probes voor biomarker detectie. De heterogene competatieve assay wordt uitgevoerd door vangmoleculen op het oppervlak te immobiliseren en vervolgens te incuberen met fluoroforen-geconjugeerde biomarkers. De concurrentie tussen de vrije en geconjugeerde biomarkers voor binding aan de vangmoleculen verlaagt de fluorescentie-intensiteit met de biomarkerconcentratie. De heterogene sandwich assay is gebaseerd op de incubatie van vangmoleculen en oplossing van belang die een complex vormen met biomarkers. Gevolgens neemt de fluorescentie-intensiteit toe met de biomarkerconcentratie.

In de homogene competatieve assay, twee verschillende fluoroforen A-geconjugeerde vangmoleculen geconjugeerd met fluoroforen B-geconjugeerde biomarkers en de oplossing die de fluorescentie verhoogt met biomarkerconcentraties. Echter, die technieken toonden bepaalde nadelen, waaronder hun lange experimentele tijd, gebrek aan multiplexed detectie, complexiteit, en soms relatief valse resultaten. Vooruitgang in nanotechnologie maakte het onderzoekers mogelijk om nieuwe fluorescentie-immunosensing probes te ontwikkelen met unieke optische kenmerken. Sinds het eerste gebruik van kwantumdots in biomolecuuldetectie, hebben ze veel belangstelling gekregen omdat hun optische eigenschappen hoge flexibiliteit bieden in de selectie van geschikte golflengte, uitstekende labels voor multiplexed detectie, biocompatibiliteit en targetcapaciteit.

Koolstofkwantumdots (CQDs) hebben uitstekende chemische, fysieke, optische, magnetische en elektrische eigenschappen getoond. CQDs kunnen gesynthetiseerd worden met verschillende technieken, waaronder hydrothermale, elektro-oxidatie, laserablatie en magnetronmethoden. Vanwege hun lage toxiciteitseigenschappen, beschouwden wetenschappelijke onderzoekers CQDs als krachtige kandidaten in veel fluorescente probes. Bovendien hebben ze een sterke vermogen om te manipuleren door verschillende controleerbare chemische reacties in diverse eisen zoals biochemisch, fotochemisch, biosensing, bioimaging en geneesmiddelverstrekkingssystemen, alsook in immunoassay detectie. Eerdere studies over de synthetise van CQDs onthulden bepaalde nadelen door het gebruik van dure koolstofbronnen, toxische chemicaliën en reagentia, of het gebruik van niet-selectieve processen. Om die nadelen te beperken, begonnen onderzoekers met het gebruik van fruit sappen als nieuwe en goedkope koolstofbron. Aangezien het gebruik van fruit sappen niet het optimale doel van het benutten van hulpbronnen biedt, zijn fluorescentie CQDs recentelijk verkregen van fruitschillen. Het gebruik van fruitschillen biedt een veelbelovende route voor eco-vriendelijke en groene synthetise van CQDs.

Zinkoxide (ZnO) is een van de belangrijkste, potentieel actieve, stabiele en laag-toxische metalenoxiden die breed gebruikt worden in ultraviolette laserapparaten, biomedisch veld, diverse typen sensoren en fotokatalyse. ZnO nanopartikelen (ZnONPs) vertoonden fotoluminescente eigenschappen nabij UV en Vis spectrum ranges. Dit kan toegeschreven worden aan de excitonische emissie die gebaseerd is op de directe recombinatie van elektronen-gaten paren of als gevolg van de groen-gele emissie bij 520 nm als resultaat van de elektronische overgang van het geleidingsbandrand naar een valstreek niveau.

Over het algemeen zijn koolstofdots amorfe of nanokristallijn quasi-sferische nanopartikelen die sp² en sp³ koolstof, O/N-gebaseerde groepen en post-gewijzigde chemische groepen bevatten. Verder hebben CQDs de capaciteit om te exciteren met hogere golflengtes en kunnen de effectiviteit van de gecombineerde oppervlakken van de elektronen-gaten paren veranderen en de quenching in de geanalyseerde systemen behandelen, wat de kwantitatieve bepaling van biomoleculen kan vergemakkelijken. Ze hebben de capaciteit om gedecoreerd te worden door metalenoxiden zoals TiO₂ en ZnO om optisch actieve nanocomposiet te vormen dat kan worden benut bij de detectie van biomarkers in humaan serum. ZnO is een materiaal met een brede bandkloof (3,37 eV), dat luminescerend kan zijn in UV en blauwe gebieden van het zichtbare licht door de aanwezigheid van een grote dichtheid van defektniveaus in de bandkloof. De vorming van CQDs/ZnO nanocomposiet verhoogt de zichtbare lichtabsorptie door de hybridisatie van ZnO met CQDs, en de blauwe verschuiving in de luminescente absorptie naar 520 nm kan toegeschreven worden aan de radiatieve recombinatie van geïoniseerde O-vacatures. Naast de toename in absorptie van zichtbaar licht, kan een betere elektronen-gaten scheiding en reductie van interfaciale elektronenoverdrachtstijd overwogen worden voor de hogere optische prestaties van de gehybridiseerde CQDs met ZnO nanopartikelen. Verder kan de betekenisvolle toename van –OH* radicalen, gegenereerd vanuit CQDs/ZnO nanocomposiet in het waterinterface, een significante verhoging in fluorescentiesignalen van het analyserende systeem veroorzaken. Dus, het gecombineerde CQDs/ZnO nanocomposiet verbetert de modificatie van opto-elektronische en fotoluminescente eigenschappen van ZnO-oppervlak en produceert een sterke oppervlaktedefect met instelbare fotoluminescentie. Bovendien bieden CQDs geïmmobiliseerd met bioherkenningsantistoffen die antistof-antigen-antistof FL-sensing systeem vormen, een levensvatbare probe met hoge specificiteit en gevoeligheid voor het doelanalyte.

Citrus lemon perikarp werd gebruikt als koolstofvoorloper om CQDs te produceren onder hydrothermale condities. Bovendien werd het gebruikt als reducerend en stabiliserend middel voor de synthetise van CQDs geconjugeerd ZnO nanocomposiet. Het preparaat CQDs/ZnO nanocomposiet werd geïmmobiliseerd door een niet-geconjugeerd BM 19.21 monoklonaal antistof (mAb) en de microtiterputten werden gecoat met een ander monoklonaal KS 19.1 antistof om een sandwich-kapping immunosensing systeem te vormen.

Methoden

Instrumenten

Spectrofotometrische spectra van zowel CQDs als CQDs/ZnO nanocomposiet werden opgenomen met behulp van een Ultrospec 2100-Biochrom spectrophotometer (Biochrom Ltd., Cambium, Cambridge, VK). Oppervlaktemorfologie en deeltjesgrootteverdeling van de groen gesynthetiseerde CQDs en CQDS/Zn nanocomposiet werden geëvalueerd met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) JEOL 1200EX model instrument (JEOL Ltd., Freising, Duitsland) en scanning-elektronenmicroscoop (SEM) JSM-7610F model (JEOL, VS). De fluorescentie en Fourier-transformatie infrarood (FT-IR) spectra van het voorgestelde immunosensing systeem werden gecontroleerd met behulp van Biotek Synergy H1 multi-mode reader (Biotek, Tokio, Japan) en Perkin Elmer FT-IR spectrophotometer (PerkinElmer Ltd., Yokohama, Japan), respectievelijk. Raman spectra, X-straalfoto-elektronspectroscopie (XPS) en X-straalpoederdiffractie (XRD) patroon werden gemeten met behulp van micro-Raman spectrometer (CRAIC Technologies, CA, VS), Kratos Axis Ultra X-straalspectroscopie systeem (Kratos Analytical Ltd., Manchester, VK) en Siemens D-5000 diffractometer (Siemens, Erfurt, Duitsland), respectievelijk.

Chemicaliën en Reagentia

SG-2000-10090 instrument (Barsbuttel, Duitsland) werd gebruikt om het gedemineraliseerde water te verkrijgen dat doorheen alle experimenten gebruikt werd. CYFRA 21-1-niet-geconjugeerde monoklonale antistoffen (mAb) BM 19.21 en KS 19.1 om het sandwich-kapping immunosensing systeem te vormen, werden verkregen van Abcam (Cambridge, VK). Citrus lemon vruchten werden geleverd door lokale markten. Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) van pH = 7,4 werd bereid met natriumchloride, kaliumchloride, natriumhydroxide, monokaliumfosfaat en dinatriumfosfaat (BHD Ltd. Co. Poole, VK). Randox Laboratories (Noord-Ierland-VK) leverde vriendelijk de commerciële normale sera. Willekeurige bloedmonsters werden verzameld van gezonde vrijwilligers, en vóór de start van deze studie werd een ingevormde toestemming verkregen. Verder leverde Sigma-Aldrich (Hamburg, Duitsland) een zuivere graad van zowel carbodiimide hydrochloride (EDC) als N-hydroxysuccinimide (NHS). Het onderzoeksethiekcomité bij King Saud University, KSA (KSU-REC-002-E, 2019) keurde de studie goed.

Groene Hydrothermale Preparatie van Koolstofkwantumdots (CQDs)

Citrus lemon perikarp werd gebruikt om CQDs te synthetiseren onder hydrothermale condities. Ongeveer 20 g Citrus lemon perikarp en 200 mL gedemineraliseerd water werden overgebracht naar een ronde fles en teruggekoken bij 100 °C onder continue magnetische roeren gedurende 6 uur. Na afkoelen tot kamertemperatuur werd de resulterende extract gecentrifugeerd bij 3500 rpm en 20 mL van de bovenste geëxtraheerde oplossing werd geautoclaafd en verhit onder hydrothermale condities in het temperatuurbereik van 100 tot 200 °C voor verschillende intervallen van 6–120 uur. Na afkoelen tot kamertemperatuur vertegenwoordigt de bovenste vloeistof de CQDs.

Preparatie van Koolstofkwantumdot-Zinkoxide Nanocomposiet

Om CQDs/ZnO nanocomposiet te prepareren, werd een eenvoudige chemische reductiereactie uitgevoerd met CQDs als reducerend en stabiliserend middel. CQDs/ZnO nanocomposiet werd verkregen door 20 mL van de CQDs toe te voegen aan 50 mL van 5,0 × 10⁻² mol L⁻¹ zinkacetaat bij 60 °C onder continue roeren gedurende 10 min. Toen de kleur van het mengsel veranderde van geelachtig naar roomachtig, werd het mengsel 30 minuten apart gezet om het reductieproces te voltooien en op 4 °C opgeslagen. Om stabiliteit te waarborgen en de agglomeratie van het preparaat CQDs/ZnO nanocomposiet te controleren, werd UV-Vis spectrometrie gebruikt om de absorbantie binnen 20 dagen bij 390 nm op te nemen. De uitkomsten toonden hoge stabiliteit en geen significante verandering in de absorbantie van CQDs/ZnO nanocomposiet.

Karakterisatie van Koolstofkwantumdot-Zinkoxide Nanocomposiet

Om de vorming van CQDs/ZnO nanocomposiet te waarborgen, werden verschillende microscopische en spectroscopische technieken gebruikt. De uniformiteit en oppervlaktemorfologie van CQDs en CQDs/ZnO nanocomposiet werden bestudeerd met behulp van hoge-resolutie transmissie-elektronenmicroscoop (HRTEM) en SEM. De optische spectra werden bestudeerd met UV-Vis, FT-IR, XPS en Raman-spectroscopie. De kristalstructuur van de als-preparaat CQDs werd geëvalueerd met XRD patroon.

Immobilisatieproces

Een niet-geconjugeerd monoklonaal BM 19.21 antistof werd geïmmobiliseerd op het oppervlak van het gesynthetiseerde CQDs/ZnO nanocomposiet door een eenvoudige peptideaamidebinding tussen de amine en de actieve carboxylgroepen. Het immobilisatieproces werd uitgevoerd door 5,0 mL van elk equimolaire 3,0 × 10⁻³ mol L⁻¹ NHS en EDC toe te voegen aan 5,0 mL CQDs/ZnO nanocomposietoplossing onder continue roeren gedurende 1 uur. Ongeveer 5 mg niet-geconjugeerd monoklonaal BM 19.21 antistof werd opgelost in 1,0 mL 0,01 mol L⁻¹ fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH = 7,4) en toegevoegd aan de bovengenoemde sensingoplossing. Het niet-geconjugeerde monoklonaal BM 19.21 antistof werd geïmmobiliseerd op het oppervlak van een CQDs/ZnO nanocomposietoplossing na incubatie bij 37 °C gedurende 12 uur. Spectrofotometrie werd gebruikt om het succes van het immobilisatieproces te bevestigen.

Algemeen Principe van de Immunoassay Methode

Een sandwich-kapping reactie antistof-antigen-antistof werd verkregen met behulp van een ander monoklonaal KS 19.1 antistof dat het oppervlak van de microtiterputten coatte. Onder optimale immunoassay condities werd de concentratie van CYFRA 21-1 antigen bepaald als functie van een toename in fluorescentiesignaalintensiteit.

De Immunosensing Procedure

De monstername van humane sera werd geleverd door willekeurige vrijwilligers. Volledige stolling werd gewaarborgd vóór centrifugatie bij kamertemperatuur en opgeslagen bij 4 °C. De spiking-techniek werd gebruikt om standaardmonsters te prepareren die CYFRA 21-1 antigen bevatten in het concentratiebereik van 0,01–500 ng mL⁻¹. Ongeveer 50 μL van de gespikte monsters werden gedoseerd in microtiterputten en gemengd met 50 μL vers gedilueerd monoklonaal KS 19.1 antistof met behulp van fosfaat-gebufferde zoutoplossing van pH = 7,4 gedurende 30 min en daarna geïncubeerd zonder de plaat te bedekken gedurende 1 uur bij 37 °C. De inhoud van de putten werd heftig uitgeschud, en de putten werden driemaal gespoeld met gedemineraliseerd water (300 μL) per put. Ongeveer 50 μL van de geïmmobiliseerde CQDs/ZnO-BM 19.21 nanocomposietoplossing werd aan elke put toegevoegd, zacht gemengd, en geïncubeerd gedurende 30 min bij 37 °C. De preparaat monsters werden onderwerp aan fluorescentieanalyse met behulp van microtiterreader om de intensiteiten op te nemen.

Resultaten en Discussie

Morfologische Evaluatie van Koolstofkwantumdots en zijn Nanocomposiet

Een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) werd gebruikt om de oppervlaktemorfologie en de verdeling van CQDs in de monsters te karakteriseren. Om de onderzoek onder TEM uit te voeren, werd ongeveer 4 μL van het preparaat CQDs suspensie op het oppervlak van het koolstofrooster van TEM gedropt. In HRTEM-afbeelding, gaven de waargenomen uniforme zwarte vlekken met roosterafstand (0,36 nm) de vorming van CQDs aan. Een deeltjesgrootteverdelingsgrafiek werd geplot en de gemiddelde deeltjesgrootte varieerde van 1,5 ± 0,5 tot 5,0 ± 0,5 nm. De verkregen deeltjesgrootte bewijst dat de gevormde CQDs inderdaad kwantum-grootte nanomaterialen zijn. Bovendien werd een dynamische lichtverstrooiing (DLS) uitgevoerd, en de gemiddelde deeltjesgrootte werd ~ 20 ± 0,2 nm gevonden. Een verschil tussen de vorige twee metingen werd waargenomen. Eerdere studies onthulden dat HRTEM de kristalroosterstructuur van de gevormde CQDs bij hogere vergroting niet toont vanwege hun amorfe aard. Op dezelfde manier, in deze studie, is de natuurlijke koolstofvoorloper Citrus lemon perikarp en de afgeleide CQDs vertoonden ook amorfe aard. Daarom kan het verschil in deeltjesgrootte-metingen toegeschreven worden aan de agglomeratie van de gevormde CQDs, de amorfe aard van de gevormde koolstofdots, het betrokken mechanisme in elk experiment, en de hydratiedynamica van de deeltjes.

Het preparaat CQDs/ZnO nanocomposiet werd onderzocht met TEM en SEM. In de TEM-afbeelding, gaf de aanwezigheid van zeshoekige deeltjes gehecht aan CQDs de vorming van CQDs/ZnO nanocomposiet aan. In SEM, werd het nanocomposietmonster gecoat met goud om elektronenabsorptie door het monster en opbouw van lading te voorkomen. De toegepaste versnelde spanning was 15 kV bij vergroting × 30.000.

UV-Vis en fluorescentiespectra van CQDs werden bestudeerd, en de opgenomen spectra toonden twee significante pieken bij 224 en 280 nm die toegeschreven kunnen worden aan p~p* en n~P* overgang van C=C en C=O, respectievelijk. Ook toonde het fluorescentiespectrum van CQDs twee signalen bij maximaal λ_ex = 360 en λ_em = 453 nm. Verder werd het UV-Vis spectrum van CQDs/ZnO nanocomposiet bestudeerd. Een significante absorptiepiek werd waargenomen bij 370 nm met blauwgroene verschuiving. De fotoluminescente (PL) eigenschappen van CQDs/ZnO nanocomposiet werden bestudeerd. De grootte en oppervlaktedefecten van CQDs beïnvloeden hun luminescente eigenschappen sterk. Als functie van excitatiegolflengte, varieerde de (PL) emissie van CQDs. Ook vertoonden ZnO-nanogedeeltjes een defect-gerelateerde emissie in de blauw-naar-groene absorptie zichtbare regio. Daarom produceerden CQD-gedecoreerde ZnONPs een uitstekend nanocomposiet voor PL-emissie. Zoals getoond, vertoonde het PL-spectrum van CQDs/ZnO een blauwe verschuiving met een significante piek bij 520 nm na excitatiegolflengte 470 nm. De waargenomen verschuiving kan toegeschreven worden aan de overlapping tussen de energiebanden van CQDs en ZnONPs. De getoonde blauwe verschuiving was in het defectemissieniveau 2,1 eV.

Om de vorming van CQDs/ZnO nanocomposiet en geïmmobiliseerd CQDs/ZnO nanocomposiet met niet-geconjugeerd monoklonaal BM 19.21 antistof te bevestigen, werd een vergelijkende FT-IR studie uitgevoerd. Het opgenomen FT-IR spectrum van CQDs onthulde de aanwezigheid van verschillende duidelijke pieken die overeenkomen met bepaalde functionele groepen, waaronder rekende trillingspieken bij 3462 cm⁻¹ en 2932 cm⁻¹ voor C–OH en C–H groepen, respectievelijk. Verder werden drie trillingsabsorptiebanden waargenomen bij 1749 cm⁻¹, 1375 cm⁻¹ en 1246 cm⁻¹ die overeenkomen met de aanwezigheid van C=O, C–N en C–O–C functionele groepen, respectievelijk. Een nieuwe piek bij 436 cm⁻¹ overeenkomend met een rekende trillingsband van Zn–O werd waargenomen. De reducerende en stabiliserende eigenschappen van CQDs werden verkregen uit de aanwezigheid van –OH en COOH groepen op hun oppervlak. Deze functionele groepen fungeren als elektrondonoren en hebben een sterke affiniteit voor de vorming van CQDs/ZnO nanocomposiet. Daarom reducerden en stabiliseerden CQDs het gevormde nanocomposiet. Zoals afgebeeld, werd opgemerkt dat twee nieuwe pieken gevormd werden bij 3254 cm⁻¹ en 1675 cm⁻¹. Deze pieken werden toegeschreven aan rekende trilling van N–H en C=O, respectievelijk, en bevestigende de immobilisatie van CQDs/ZnO-BM 19.21 via peptidebindingen.

X-straalfoto-elektronspectroscopie (XPS) spectra van de groen gesynthetiseerde CQDs werden onderzocht. Het verkregen spectrum van CQDs toonde verschillende functionele groepen bij 288 en 286 eV voor C=O en COOH, respectievelijk. Ook werden twee significante bindingenergiepieken waargenomen bij 1044,4 en 1021,5 eV voor Zn 2p_1/2 en Zn 2p_3/2, respectievelijk. Bovendien bevestigde het hoge-resolutie XPS spectrum van CQDs/ZnO nanocomposiet de aanwezigheid van verschillende bindingenergiepieken bij 560, 385, 350, 246 en 200 eV voor O 1s, C 1s, Zn 3s, Zn 3p en Zn 3d, respectievelijk. Alle eerder genoemde gegevens bewijzen de aanwezigheid van ZnO op het oppervlak van CQDs die CQDs/ZnO nanocomposiet vormen.

Een vergelijkende studie tussen XRD patronen van CQDs en CQDs/ZnO nanocomposiet werd uitgevoerd. Een brede piek bij 20° (2Ɵ) voor koolstofdots werd opgemerkt in het XRD patroon van CQDs. Echter, verschillende scherpe pieken werden herkend bij 27°, 32°, 34°, 45°, 57°, 64°, 67°, 70°, 73°, 78° en 80° (2Ɵ) voor Zn (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112), (201), (004) en (202), respectievelijk. De waargenomen pieken weerspiegelden de verdeling van ZnO op het oppervlak van CQDs die CQDs/ZnO nanocomposiet vormen.

De Raman spectra van het preparaat CQDs, CQDs/ZnO en geïmmobiliseerd CQDs/ZnO-BM 19.21 nanocomposiet werden bestudeerd. De Raman signalen worden veel gebruikt om de kristalstructuur en zijn defecten te bestuderen. Er werden twee typische D- en G-band en waargenomen bij 1300 en 1520 cm⁻¹ voor koolstofnanopartikelen, respectievelijk. Zoals eerder gerapporteerd, vertegenwoordigt D-band doorgaans sp³ defecten, en G-band is een kenmerk van vlakke trilling van sp²-gebonden koolstoffen. De I_D/I_G verhouding werd berekend voor het preparaat CQDs en werd 1,02 ± 0,03 gevonden. Nieuwe scherpe pieken werden waargenomen bij 440 en 520 cm⁻¹ voor ZnO nanopartikelen en de typische pieken van CQDs werden waargenomen bij 1364 en 1595 cm⁻¹. De verhouding van I_D/I_G werd 1,2 ± 0,01 gevonden wat de vorming van CQDs/ZnO nanocomposiet aangeeft. Het Raman spectrum van geïmmobiliseerd CQDs/ZnO-BM 19.21 nanocomposiet toonde talloze pieken die gemakkelijk herkend kunnen worden als bevestigende tekens van secundaire en tertiaire structuren. De pieken waargenomen in het gebied 1007–1128 cm⁻¹ werden toegewezen om de belangrijkste secundaire structuur van het monoklonale antistof weer te geven. De Raman pieken bij 550–682 cm⁻¹ gebied werden toegewezen om disulfide conformaties weer te geven, terwijl de 867–797 cm⁻¹ die toegewezen waren om de waterstofbindingsstaat van tyrosineresten weer te geven. Ook kan de significante verschuiving in Raman spectrum piek naar 1630 cm⁻¹ toegeschreven worden aan de aanwezigheid van tertiaire structuur van het geïmmobiliseerde antistof. De verhouding van I_D/I_G was toegenomen tot 1,4 ± 0,04 wat een betere kristallijne structuur onthult door de vorming van geïmmobiliseerd CQDs/ZnO-BM 19.21 nanocomposiet.

Optimalisatie van Fluorescentie-Immunosensing Condities

De selectie en optimalisatie van de voorgestelde fluorescentie-immunosensing condities werden uitgevoerd door verschillende parameters te bestuderen. Over het algemeen moeten de hoeveelheid geïmmobiliseerd nanocomposiet, pH en concentratie van de gebruikte buffer, incubatietijd tussen het doelanalyte in de serummonsters en de immunosensing reagentia onderzocht en geoptimaliseerd worden. Om de geschikte hoeveelheid geïmmobiliseerd CQDs/ZnO-BM 19.21 nanocomposiet te selecteren, werden verschillende hoeveelheden in het bereik van 10–100 μL getest. De maximale fluorescentie-intensiteit werd waargenomen door 50 μL van het geïmmobiliseerde CQDs/ZnO-BM 19.21 nanocomposiet toe te voegen. Vier fosfaat-gebufferde zoutoplossingen van pH 7,2–7,5 waarden werden prepareren en getest als functie van fluorescentie-intensiteit. Een lichte verandering in fluorescentiesignaalintensiteit werd waargenomen door pH-waarden te veranderen. Bij pH 7,2 en 7,3, nam het fluorescentiesignaal af door de chemische onstabiliteit van het geïmmobiliseerde CQDs/ZnO nanocomposiet. Het fluorescentiesignaal nam toe bij pH 7,4 tot 7,5 door uitstekende interactie tussen de monoklonale moleculen op het oppervlak van het nanocomposiet. Het werd gevonden dat 7,4 de meest geschikte pH-waarde is om de activiteit van het doelantigen te behouden wat kan worden afgebroken door de pH meer dan 7,5 te verhogen. Daarom werd pH 7,4 geselecteerd voor verdere studies.

De invloed van fosfaat-gebufferde zoutoplossing-concentratie op de fluorescentie-intensiteit werd geschat met een concentratiebereik van 0,01–0,05 mol L⁻¹. De maximale fluorescentie-intensiteitssignaal werd verkregen met behulp van de bufferconcentratie van 0,01 mol L⁻¹. Bij hogere bufferconcentraties agglomererede het geïmmobiliseerde CQDs/ZnO-BM 19.21 nanocomposiet, en de onstabiliteit van de immunosensing oplossing kan een afname in fluorescentie-intensiteit veroorzaken. Om de immuno-reactietijd te berekenen, werd de analytische procedure herhaald met reactietijd variërend van 10 tot 60 min. De maximale fluorescentie-intensiteitssignaal werd waargenomen door de reactie tussen het geteste antigen en de immunosensing oplossing ten minste 30 min te handhaven.

Analytische Kwantificering

Onder geoptimaliseerde condities werd de voorgestelde immunoassay-methode uitgevoerd met 12 serummonsters die CYFRA 21-1 antigen bevatten in concentratiebereik van 0,01–500 ng mL¹. De uitkomsteresultaten werden geplot om de calibratiegrafiek te construeren die lineair was over een concentratiebereik van 0,01–100 ng mL⁻¹ met een detectielimiet van 0,008 ng mL⁻¹. De berekende vergelijking werd I_F = 7,933C + 181,24 (r² = 0,9992). Na zes herhalingen was het percentage van de relatieve standaarddeviatie (%RSD) 1,3%. De acceptabele resultaten onthulden een hoge gevoeligheid van de immunosensing fluorescentiemethode voor de kwantificering van CYFRA 21-1 antigen in serummonsters.

Systeemgeschiktheid

Systeemgeschiktheid werd onderzocht door een vergelijkende studie uit te voeren tussen de voorgestelde geïmmobiliseerde CQDs/ZnO-BM 19.21 immunosensing methode en de eerder genoemde methoden. Het voorgestelde fluorescentiesysteem bood significante voordelen zoals eenvoud, eco-vriendelijk en makkelijk om het doelanalyte in serummonsters te detecteren. De opgenomen resultaten onthulden hoge gevoeligheid met een breed lineair detectiebereik van 0,01–100 ng mL¹ en lagere detectielimiet van 0,008 ng mL¹.

Nauwkeurigheid, Precisie en Selectiviteit van het Geïmmobiliseerde Immunosensing Systeem

Om de nauwkeurigheid van het voorgestelde geïmmobiliseerde CQDs/ZnO-BM 19.21 fluorescentie-immunosensing systeem voor de bepaling van CYFRA 21-1 antigen in serummonsters te waarborgen, werden 12 serummonsters getest. De uitkomsteresultaten werden vergeleken met een andere eerder gerapporteerde techniek, die gebaseerd was op electrochemiluminescentie-assay met tris 2,2'-bipyridyl ruthenium (II) complex om te exciteren door tripropylamine. Acceptabele resultaten werden verkregen. Intra-dag en inter-dag assays werden gebruikt om de precisie van de voorgestelde methode te onderzoeken. De test werd uitgevoerd met een serummonster dat 10 ng mL⁻¹ CYFRA 21-1 antigen bevatte. De gemiddelde relatieve standaarddeviaties waren 1,1% en 1,3% voor zowel intra- als inter-dag assay, respectievelijk, wat hoge precisie onthulde. Verder werd de selectiviteit van de voorgestelde methode ten aanzien van de bepaling van CYFRA 21-1 antigen geëvalueerd met behulp van enkele mogelijke interfererende soorten zoals aminozuren (cysteine, lysine, serine, tyrosene, glycine), enkele kationen (K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ en Zn²⁺) en enkele andere biomarkers zoals CA 15-3, CA 27-29, CA 19-9 en CA 125. De test werd uitgevoerd onder optimale condities met humaan serum dat 10 ng mL⁻¹ CYFRA 21-1 antigen bevatte in de aanwezigheid van 10 ng mL⁻¹ co-bestaande soorten. De uitkomsteresultaten werden berekend als relatieve percentage fout (Er%) en het corresponderende resultaat overschreed niet ± 5% voor elk interfererende soort. De berekende tolerantiewaarden (F-F⁰/F⁰) vonden zich binnen de tolerantiegrenzen (< 5%). Daarom toonde het voorgestelde geïmmobiliseerde CQDs/ZnO-BM 19.21 immunosensing fluorescentiesysteem hoge selectiviteit ten aanzien van de bepaling van CYFRA 21-1 antigen in humaan serum.

Analyse van Echte Monsters

In echte humane monsters werd het voorgestelde immunosensing fluorescentiesysteem gebaseerd op geïmmobiliseerde CQDs/ZnO-BM 19.21 oplossing gebruikt om de tumormarker CYFRA 21-1 antigen te detecteren en te kwantificeren. Zoals eerder vermeld in de immunosensing procedure, werd het voorgestelde systeem gebruikt om CYFRA 21-1 antigen te bepalen door de relatie te vinden tussen de fluorescentie-intensiteit en de concentratie van CYFRA 21-1 antigen in serummonsters. Bepaalde hoeveelheden van het doelantigen (0,5, 1,0 en 2,0 ng mL⁻¹) werden aan de geschatte monsters toegevoegd, en de toename in signaalintensiteiten werd geëvalueerd. Na zes bepalingen werden de percentage relatieve standaarddeviaties (%RSD) berekend. De uitkomste percentage herstellingen variëerden van 96,7 ± 0,7 tot 100,0 ± 1,3%. De berekende %RSD was in het bereik van 0,2–1,4%. De geteste serummonsters werden geanalyseerd met een eerder gerapporteerde methode en de percentage herstellingen variëerden van 96,1 ± 1,6 tot 100,0 ± 0,4% met %RSD 0,3–1,7%. Om de geschiktheid van de voorgestelde immunosensing fluorescentietechniek met behulp van een geïmmobiliseerde CQDs/ZnO-BM 19.21 oplossing te waarborgen, werd een vergelijkende statistische studie met Student's t-toets en F-toets uitgevoerd tussen de huidige resultaten en die verkregen door anderen uit eerdere methoden. De verkregen t-toets en F-toets waarden vonden zich in het bereik van 0,354 tot 2,181 (2,228)* en 1,16 tot 4,0 (5,05)* met betrekking tot de getabuleerde waarden van P = 0,05, respectievelijk. De resultaten onthulden goede overeenstemming tussen de voorgestelde methode en de eerdere gepubliceerde procedures. Ook lagen alle gedetecteerde hoeveelheden CYFRA 21-1 antigen in serummonsters binnen de normale limiet wat aangeeft dat geen longkanker gediagnosticeerd werd in de onderzochte serummonsters.

Conclusie

De huidige studie betreft de preparatie van groene synthetise CQDs geconjugeerd met ZnO nanocomposiet met behulp van Citrus lemon als voorloper. Het CQDs/ZnO nanocomposiet werd gebruikt om een nieuw fluorescentie-immunosensing systeem te vormen door een monoklonaal BM 19.21 antistof te immobiliseren via eenvoudige peptidebindingen. Het hooggevoelige fluorescentiesysteem werd gebruikt om de tumormarker van longkanker (CYFRA 21-1) in humaan serum te bepalen. CYFRA 21-1 antigen werd bepaald via sandwich-kapping antistof-antigen-antistof reactie met behulp van een ander monoklonaal antistof KS 19.1 dat de microtiterputten coatte. De unieke kenmerken en hoge gevoeligheid van het voorgestelde systeem faciliteren de bepaling van de doeltumormarker met hoge stabiliteit en reproduceerbaarheid. Een vergelijkende studie werd uitgevoerd en de uitkomsteresultaten bevestigden de geschiktheid en hoge gevoeligheid van het voorgestelde immunosensing systeem, en de resultaten waren in overeenstemming met een eerdere conventionele techniek.