Nieuwe immunosensing-fluorescentiedetectie van tumormarker cytokeratine-19-fragment (CYFRA 21-1) via koolstof-kwantumstippen/zinkoxide-nanocomposiet

Resultaten en discussie

Morfologische evaluatie van koolstofkwantumstippen en zijn nanocomposiet

Een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) werd gebruikt om de oppervlaktemorfologie en de verdeling van CQD's in de monsters te karakteriseren. Om het onderzoek onder TEM uit te voeren, liet men ongeveer 4 L van de bereide CQDs-suspensie op het oppervlak van het koolstofraster van TEM vallen. In HRTEM-afbeelding (figuur 1a) gaven de waargenomen uniforme zwarte vlekken met roosterafstand (0,36 nm) de vorming van CQD's aan. Er werd een grafiek van de deeltjesgrootteverdeling uitgezet en de gemiddelde deeltjesgrootte varieerde van 1, 5 ± -0,5 tot 5,0 ± 0,5 nm (figuur 1b). De verkregen deeltjesgrootte bewees dat de gevormde CQD's inderdaad nanomaterialen van kwantumformaat zijn. Bovendien werd een dynamische lichtverstrooiing (DLS) uitgevoerd, en de gemiddelde deeltjesgrootte bleek ~ 20 ± 0.2 nm te zijn. Er werd een verschil waargenomen tussen de vorige twee metingen. Eerdere studies hebben aangetoond dat HRTEM de kristalroosterstructuur van de gevormde CQD's niet vertoont bij hogere vergrotingen vanwege hun amorfe karakter [43]. Evenzo is in deze studie de natuurlijke voorloper van koolstof Citruscitroen pericarp en de afgeleide CQD's vertoonden ook een amorfe aard. Daarom kan het verschil in deeltjesgroottemetingen worden toegeschreven aan de agglomeratie van de gevormde CQD's, de amorfe aard van gevormde koolstofstippen, het mechanisme dat bij elk experiment betrokken is en de hydratatiedynamiek van de deeltjes.

een Hoge resolutie transmissie-elektronenmicroscoop (HRTEM) afbeelding van CQD's met een diameter van 5 nm en b grootteverdelingsgrafiek van de CQD's op basis van de TEM

Het bereide CQD's / ZnO-nanocomposiet werd onderzocht met behulp van TEM en SEM. In het TEM-beeld (figuur 2a) duidde de aanwezigheid van hexagonale deeltjes aan CQD's op de vorming van CQD's / ZnO-nanocomposiet. In SEM werd het nanocomposietmonster gecoat met goud om de elektronenabsorptie door het monster en de opbouw van lading te voorkomen. De toegepaste versnelde spanning was 15 kV bij vergroting ×   30.000 (Fig. 2b).

een en b vertegenwoordigen de transmissie-elektronenmicroscoop- en scanning-elektronenmicroscoopbeelden van CQD's/ZnO-nanocomposiet

UV-Vis- en fluorescentiespectra van CQD's werden bestudeerd en de geregistreerde spectra vertoonden twee significante pieken bij 224 en 280 nm die kunnen worden toegeschreven aan p ~p* en n ~P* overgang van respectievelijk C=C en C=O. Ook vertoonde het fluorescentiespectrum van CQD's maximaal twee signalen λ_ex = 360 en λ_em = 453 nm (Fig. 3a, b). Verder werd het UV-Vis spectrum van CQDs/ZnO nanocomposiet bestudeerd. Een significante absorptiepiek werd waargenomen bij 370 nm die een blauwgroene verschuiving vertoonde (figuur 4a). De fotoluminescentie (PL) eigenschappen van CQDs/ZnO nanocomposiet werden bestudeerd. De grootte en oppervlaktedefecten van CQD's hebben een grote invloed op hun luminescentie-eigenschappen. Als functie van de excitatiegolflengte werd de (PL) emissie van CQD's gevarieerd [38]. Ook vertoonden ZnO-nanodeeltjes een defect-gerelateerde emissie in het blauwe tot groene zichtbare absorptiegebied [41]. Daarom produceerden CQD-versierde ZnONP's een uitstekende nanocomposiet voor PL-emissie. Zoals weergegeven in figuur 4b, vertoonde het PL-spectrum van CQD's / ZnO een blauwe verschuiving met een significante piek bij 520 nm na excitatiegolflengte 470 nm. De waargenomen verschuiving kan worden toegeschreven aan de overlapping tussen de energiebanden van CQD's en ZnONP's. De weergegeven blauwe verschuiving was in het defecte emissieniveau 2.1 eV.

Spectroscopische spectra van CQD's (a ) UV-Vis-spectrum bij 224 en 280 nm en (b ) fluorescentiespectrum van CQD's bij λ_ex = 360 en λ_em = 452 nm

Spectroscopische spectra van CQD's/ZnONP's a UV-Vis-spectrum bij absorptiepiek bij 370 nm en b fotoluminescentiespectrum van CQD's/ZnONP's bij λ_ex = 470 en λ_em = 520 nm

Om de vorming van CQD's/ZnO-nanocomposiet en geïmmobiliseerde CQD's/ZnO-nanocomposiet met niet-geconjugeerd monoklonaal BM 19.21-antilichaam te bevestigen, werd een vergelijkende FT-IR-studie uitgevoerd. Het geregistreerde FT-IR-spectrum van CQD's onthulde de aanwezigheid van verschillende afzonderlijke pieken die overeenkomen met bepaalde functionele groepen, waaronder uitrekkende vibratiepieken bij 3462 cm ⁻¹ en 2932 cm ⁻¹ voor respectievelijk C-OH- en C-H-groepen. Verder werden drie trillingsabsorptiebanden waargenomen bij 1749 cm ⁻¹ , 1375 cm ⁻¹ , en 1246 cm ⁻¹ overeenkomend met de aanwezigheid van respectievelijk C =O, C-N en C-O-C functionele groepen (figuur 5a). Een nieuwe piek van 436 cm ⁻¹ overeenkomend met een uitrekkende trillingsband van Zn-O werd waargenomen. De reducerende en stabiliserende eigenschappen van CQD's werden verkregen door de aanwezigheid van -OH- en COOH-groepen op hun oppervlak. Deze functionele groepen fungeren als elektronendonoren en hebben een sterke affiniteit voor de vorming van CQD's/ZnO-nanocomposiet. Daarom verminderden en stabiliseerden CQD's het gevormde nanocomposiet (figuur 5b). Zoals weergegeven in Fig. 5c, werd opgemerkt dat er twee nieuwe pieken werden gevormd op 3254 cm ⁻¹ en 1675 cm ⁻¹ . Deze pieken werden toegeschreven aan het uitrekken van de vibratie van respectievelijk N–H en C=O, en bevestigden de immobilisatie van CQD's/ZnO-BM 19.21 via peptidebindingen.

FT-IR-spectra van a CQD's, b CQD's/ZnO nanocomposiet en c geïmmobiliseerde CQD's/ZnO-BM 19.21 nanocomposiet

Röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS) spectra van de groene gesynthetiseerde CQD's werden onderzocht. Het verkregen spectrum van CQD's (Fig. 6a) vertoonde verschillende functionele groepen bij respectievelijk 288 en 286 eV voor C =O en COOH. Ook werden twee significante bindingsenergiepieken waargenomen bij 1044,4 en 1021,5 eV voor Zn 2p_1/2 en Zn 2p_3/2 , respectievelijk (Fig. 6b). Bovendien bevestigde het XPS-spectrum met hoge resolutie van CQD's/ZnO-nanocomposiet de aanwezigheid van verschillende bindingsenergiepieken bij 560, 385, 350, 246 en 200 eV voor O 1s, C 1s, Zn 3s, Zn 3p en Zn 3d, respectievelijk (Fig. 6c). Alle eerder genoemde gegevens bewezen de aanwezigheid van ZnO op het oppervlak van CQD's die CQD's/ZnO-nanocomposiet vormen.

Röntgenfoto-elektronenspectroscopie (XPS) spectra van a CQD's, b ZnO en c CQD's/ZnO nanocomposiet

Een vergelijkende studie tussen XRD-patronen van CQD's en CQD's/ZnO-nanocomposiet werd uitgevoerd. Een brede piek bij 20 ° (2 ') voor koolstofstippen werd opgemerkt in het XRD-patroon van CQD's (figuur 7a). Er werden echter verschillende scherpe pieken herkend bij 27°, 32°, 34°, 45°, 57°, 64°, 67°, 70°, 73°, 78° en 80° (2Ɵ) voor Zn (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112), (201), (004) en (202). De waargenomen pieken weerspiegelden de verdeling van ZnO op het oppervlak van CQD's die CQD's/ZnO-nanocomposiet vormen (Fig. 7b).

Röntgendiffractiepatroon van a CQD's en b CQD's/ZnO nanocomposiet

De Raman-spectra van de bereide CQD's, CQD's/ZnO en geïmmobiliseerde CQD's/ZnO-BM 19.21 nanocomposiet werden bestudeerd. De Raman-signalen worden vaak gebruikt om de kristalstructuur en zijn defecten te bestuderen. Afbeelding 8a toont twee typische D- en G-banden bij 1300 en 1520 cm ⁻¹ voor koolstof nanodeeltjes, respectievelijk. Zoals eerder gemeld, vertegenwoordigt de D-band gewoonlijk sp ³ defecten, en G-band is een kenmerk van vlakke trillingen van sp ² -gebonden koolstoffen [44]. De ik _D /Ik _G verhouding werd berekend voor de bereide CQD's en deze bleek 1,02 ± 0,03 te zijn. Nieuwe scherpe pieken werden waargenomen bij 440 en 520 cm ⁻¹ voor ZnO-nanodeeltjes en de typische pieken van CQD's werden waargenomen bij 1364 en 1595 cm ⁻¹ . De verhouding van I _D /Ik _G bleek 1, 2 ± 0, 01 te zijn, wat wijst op de vorming van CQD's / ZnO-nanocomposiet (figuur 8b). Het Raman-spectrum van geïmmobiliseerde CQD's/ZnO-BM 19.21 nanocomposiet vertoonde talrijke pieken die gemakkelijk kunnen worden herkend als bevestigende tekenen van secundaire en tertiaire structuren. De pieken waargenomen in de regio 1007–1128 cm ⁻¹ werden toegewezen om de belangrijkste secundaire structuur van het monoklonale antilichaam weer te geven. De Raman piekt op 550–682 cm ⁻¹ regio werden toegewezen om disulfide conformaties weer te geven, terwijl de 867–797 cm ⁻¹ die werden toegewezen om de waterstofbindingstoestand van tyrosineresiduen weer te geven. Ook de significante verschuiving in het Raman-spectrum piek naar 1630 cm ⁻¹ kan worden toegeschreven aan de aanwezigheid van tertiaire structuur van het geïmmobiliseerde antilichaam [45] (Fig. 8c). De verhouding van I _D /Ik _G werd verhoogd tot 1,4 ± 0,04, wat een betere kristalstructuur onthult door de vorming van geïmmobiliseerde CQD's/ZnO-BM 19,21 nanocomposiet.

Raman-spectraverschuiving van a CQD's, b CQD's/ZnO nanocomposiet en c geïmmobiliseerde CQD's/ZnO-BM 19.21 nanocomposiet

Optimalisatie van fluorescentie-immunosensingcondities

De selectie en optimalisatie van de voorgestelde fluorescentie-immunosensing-omstandigheden werden uitgevoerd door verschillende parameters te bestuderen. Over het algemeen moeten de hoeveelheid geïmmobiliseerde nanocomposiet, pH en concentratie van de gebruikte buffer, incubatietijd tussen de doelanalyt in de serummonsters en de immunosensingreagentia worden onderzocht en geoptimaliseerd. Om de geschikte hoeveelheid geïmmobiliseerde CQD's / ZnO-BM 19.21 nanocomposiet te selecteren, werden verschillende hoeveelheden in het bereik van 10-100  μL getest. De maximale fluorescentie-intensiteit werd waargenomen door 50 L van de geïmmobiliseerde CQD's / ZnO-BM 19.21 nanocomposiet toe te voegen (figuur 9a). Vier fosfaatgebufferde zoutoplossingen met pH-waarden van   7,2-7,5 werden bereid en getest als een functie van de fluorescentie-intensiteit. Een kleine verandering in de intensiteit van het fluorescentiesignaal werd waargenomen door de pH-waarden te veranderen. Bij pH  7.2 en 7.3 was het fluorescentiesignaal afgenomen vanwege de chemische instabiliteit van de geïmmobiliseerde CQD's/ZnO nanocomposiet. Het fluorescentiesignaal was verhoogd bij pH -7,4 tot 7, 5 vanwege uitstekende interactie tussen de monoklonale moleculen op het oppervlak van het nanocomposiet (figuur 9b). Er werd gevonden dat 7,4 de meest geschikte pH-waarde is om de activiteit van het doelantigeen te behouden, dat kan worden afgebroken door de pH met meer dan 7,5 te verhogen. Daarom werd pH  7.4 geselecteerd voor verder onderzoek.

Optimalisatie van fluorescentiebepaling van CYFRA 21-1-antigeen bij λ_ex = 470 en λ_em = 520 nm. een Effect van toegevoegde geïmmobiliseerde CQD's/ZnO-BM 19.21 nanocomposiet, b effect van fosfaatbufferzoutoplossing van pH-bereik 7,3–7,5, c effect of buffer concentration using PBS in the concentration range of 0.01–0.05 mol L ⁻¹ , and d effect of immunoreaction time using 10–60 min

The influence of phosphate-buffered saline concentration on the fluorescence intensity was estimated using a concentration range of 0.01–0.05 mol L ⁻¹ . The maximum fluorescence intensity signal was obtained using the buffer concentration of 0.01 mol L ⁻¹ . At higher buffer concentrations, the immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 nanocomposite was aggregated, and the instability of the immunosensing solution may cause a decrease in fluorescence intensity (Fig. 9c). To calculate the immunoreaction time, the analytical procedure was repeated using reaction time ranging from 10 to 60 min. The maximum fluorescence intensity signal was observed by maintaining the reaction between the tested antigen and the immunosensing solution for at least 30 min (Fig. 9d).

Analytical Quantification

Under optimized conditions, the suggested immunoassay method was performed using 12 serum samples containing CYFRA 21-1 antigen in concentration range of 0.01–500 ng mL ¹ . The outcome results were plotted to construct the calibration graph which was linear over a concentration range of 0.01–100 ng mL ⁻¹ with a detection limit of 0.008 ng mL ⁻¹ . The calculated equation was found to be I _F  = 7.933C + 181.24 (r ²  = 0.9992). After six repetitions, the percentage of the relative standard deviation (%RSD) was 1.3%. The acceptable results revealed a high sensitivity of the immunosensing fluorescence method for the quantification of CYFRA 21-1 antigen in serum samples.

System Suitability

System suitability was investigated by carrying out a comparative study between the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 immunosensing method and the previously addressed methods. The suggested fluorescence system provided significant advantages such as simplicity, eco-friendly, and easy to detect the target analyte in serum samples. The recorded results revealed high sensitivity with a wide linear detection range of 0.01–100 ng mL ¹ and lower detection limit of 0.008 ng mL ¹ (Table 1).

Accuracy, Precision, and Selectivity of the Immobilized Immunosensing System

To ensure the accuracy of the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 fluorescence immunosensing system for the determination of CYFRA 21-1 antigen in serum samples, 12 serum samples were tested. The outcome data were compared with another previously reported technique [6], which was based on electrochemiluminescence assay using tris 2,2′-bipyridyl ruthenium (II) complex to be excited by tripropylamine. Acceptable results were obtained as indicated in Table 2. Intra-day and inter-day assay were used to investigate the precision of the suggested method. The test was carried out using a serum sample containing 10 ng mL ^− 1 of CYFRA 21-1 antigen. The mean relative standard deviations were 1.1% and 1.3% for both intra- and inter-day assay, respectively, which revealed high precision. Furthermore, the selectivity of the suggested method towards the determination of CYFRA 21-1 antigen was evaluated using some possible interfering species such as amino acids (cysteine, lysine, serine, tyrosine, and glycine), some cations (K ⁺ , Na ⁺ , Ca ²⁺ , Mg ²⁺ , and Zn ²⁺ ) and some other bio-markers such as CA 15-3, CA 27-29, CA 19-9, and CA 125. The test was carried out under optimum conditions using human serum containing 10 ng mL ⁻¹ CYFRA 21-1 antigen in the presence of 10 ng mL ⁻¹ coexisting species. The outcome data were calculated as relative percentage error (Er%) and the corresponding result did not exceed ± 5% for each interfering species (Table 3). The calculated tolerance values (F-F ⁰ /F ⁰ ) were found to be with the tolerance limits (< 5%). Therefore, the suggested immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 immunosensing fluorescence system displayed high selectivity towards the determination of CYFRA 21-1 antigen in human serum.

Analysis of Real Specimens

In real human specimens, the suggested immunosensing fluorescence system based on immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 solution was exploiting to detect and quantify the percentage (%) recoveries of the tumor marker CYFRA 21-1 antigen. As previously mentioned in the immunosensing procedure, the suggested system was used to determine the CYFRA 21-1 antigen by finding the relationship between the fluorescence intensity and the concentration of CYFRA 21-1 antigen in serum samples. Certain amounts of the target antigen (0.5, 1.0, and 2.0 ng mL ⁻¹ ) were added to the estimated samples, and the increase in signal intensities was evaluated. After six determinations, the percentage relative standard deviations (%RSD) were calculated. The outcome percentage recoveries were found to be ranged from 96.7 ± 0.7 to 100.0 ± 1.3%. The calculated %RSD was in the range of 0.2–1.4%. The tested serum samples were analyzed using a previously reported method [6] and the percentage recoveries were found to be ranged from 96.1 ± 1.6 to 100.0 ± 0.4% with %RSD 0.3–1.7%. In order to ensure the suitability of the suggested immunosensing fluorescence technique using an immobilized CQDs/ZnO-BM 19.21 solution, a comparative statistical study using Student’s t test and F test [46] was carried out between the present results and those obtained by others from previously conducted methods (Table 4). The obtained t test and F test values were found to be ranged from 0.354 to 2.181 (2.228)* and 1.16 to 4.0 (5.05)* with respect to the tabulated values of P  = 0.05, respectively. The results revealed good agreement between the suggested method and the previously published procedures. Also, all detected quantities of CYFRA 21-1 antigen in serum samples were within the normal limit indicating no lung cancer was diagnosed in the investigated serum samples.