Tindisulfide-nanoflakes-gebaseerde electrochemische biosensor voor snelle, gevoelige detectie van salivaire cortisol

Samenvatting

Cortisol, het quintessentiële stresshormoon, wordt gesecreteerd door de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HHB) as en fungeert als cruciale biomarker voor psychologische en fysiologische stress. Langdurige overexpressie van cortisol kan leiden tot ernste stoornissen zoals Cushing- en Addison-ziekte, wat de noodzaak benadrukt voor snelle, point-of-care (POC) detectie. Hier rapporteren we een non-invasieve electrochemische assay voor salivaire cortisol gebaseerd op een multilayermfilm van tindisulfide (SnS₂) nanoflakes, een cortisol-specifiek antilichaam (C-M_ab) en bovine serumalbumine (BSA) geïmmobiliseerd op een glaskoolelektrode (GCE). De BSA/C-M_ab/SnS₂/GCE sensor werd gekarakteriseerd door electrochemische impedantiespectroscopie (EIS) en cyclische voltammetrie (CV). Differentiele pulsvoltammetrie (DPV) onthulde een lineaire respons op cortisolconcentraties van 100 pM tot 100 µM, met een detectielimiet (LOD) van 100 pM en een gevoeligheid van 0.0103 mA M⁻¹ cm⁻² (R² = 0.9979). Salivamonsters gemeten met de sensor kwamen overeen met ELISA-resultaten binnen een marge van 5%, wat de klinische relevantie en specificiteit aantoont. Het apparaat biedt een snelle, kosteneffectieve alternatief voor conventionele immunoassays voor het monitoren van stress-gerelateerde biomarkers.

Inleiding

Cortisol is een steroïdenhormoon vrijgemaakt door de HHB-as en is de meest gebruikte biomarker voor het beoordelen van psychologische stress. De circadiane ritme piekt in de vroege ochtend en daalt 's nachts, en dysregulatie kan aandoeningen veroorzaken variërend van Cushing-syndroom tot Addison-ziekte. Accurate, real-time monitoring van cortisol is daarom essentieel voor het diagnosticeren en managen van diverse stress-gerelateerde stoornissen, inclusief PTSS, depressie en autismespectrumstoornis.

Huidige laboratoriummethoden - chromatografie, radioimmunoassay, ELISA, SPR en QCM - zijn laboratoriumgebonden, tijdrovend en duur, wat hun gebruik in POC-instellingen beperkt. Electrochemische immunosensoren, die berusten op specifieke antigeen-antilichaam interacties, bieden een veelbelovende oplossing met eenvoudige instrumentatie, snelle uitlezing, lage kosten en hoge gevoeligheid. Salivaire cortisolmeting is vooral aantrekkelijk omdat het non-invasief is en minimaal monsterhandling vereist.

Hoewel tal van metaalsulfide-nanomaterialen zijn verkend voor biosensing, is tindisulfide (SnS₂) zelden gebruikt als eiwit-immobilisatiematrix. SnS₂ is een n-type halfgeleider met een bandgap van 2.18-2.44 eV, hoge dragerbewegelijkheid en uitstekende chemische stabiliteit, wat het een ideaal platform maakt voor electrochemische transductie. In dit werk benutten we 2-D SnS₂ nanoflakes om een hooggevoelige cortisol-sensor te construeren die werkt over het fysiologische concentratiebereik.

Materialen en methoden

Materialen

Hydrocortison, anti-konijn cortisol antilichaam (C-M_ab), kaliumhexacyanoferraat (II/III), β-oestradiol, testosteron, progesteron, corticosteron en bovine serumalbumine (BSA) werden verkregen van Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Tin(IV)chloride pentahydraat en thioacetaamide werden geleverd door Showa (Japan) en Alfa Aesar (UK), respectievelijk. Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en micropolijst alumina werden verkregen van Sigma-Aldrich en Buehler (UK). Alle reagentia werden zonder verdere zuivering gebruikt. Een commerciële cortisol ELISA-kit (Cat # SA E-6000) werd gekocht van LDN (Duitsland).

Synthetisering van tindisulfide

SnCl₄·5H₂O en C₂H₅NS werden opgelost in 70 mL gedemineraliseerd water en ingesteld op pH 7.4. De oplossing werd overgebracht naar een hydrothermale autoklaaf en verwarmd tot 200 °C binnen 1 uur, daarna 11 uur gehandhaafd. Het resulterende SnS₂-poeder werd gewassen met water en ethanol bij 6000 rpm gedurende 15 min en gedroogd bij 80 °C in lucht, wat uniforme nanoflakes opleverde.

Materialenkarakterisatie

Röntgendiffractie (XRD) bevestigde de hexagonale SnS₂-fase (JCPDS 89-2358). Veld-emissie scanning elektronenmicroscopie (FE-SEM) onthulde vlak-vormige morfologie met laterale afmetingen ~300 nm. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en geselecteerde-gebied elektronen diffractie (SAED) bevestigden einkristallijne structuur met roosterafstanden van 0.167 nm en 0.316 nm; de nanoflakes waren dunner dan 10 nm.

Fabricage van BSA/C-M_ab/SnS₂/GCE biosensoren

Glazen koolelektrodes (GCE) werden gepolijst met alumina-slurry en met een 5 M SnS₂-dispersie gedropcast. De elektrodes werden vervolgens achtereenvolgens geïncueerd met 1 mg mL⁻¹ C-M_ab en 1% BSA-oplossingen in PBS. De afgeronde sensoren werden op 4 °C opgeslagen wanneer niet in gebruik. Het detectieconcept en de opzet zijn geïllustreerd in Fig. 1.

Electrochemische analyse

Electrochemische impedantiespectroscopie (EIS) en cyclische voltammetrie (CV) werden gebruikt om het elektroactieve gedrag van de sensor te beoordelen. Alle metingen gebruikten een drie-elektrode cel: de BSA/C-M_ab/SnS₂/GCE als werkelektrode, een Pt-draad als counter, en een verzadigde calomelelektrode als referentie, in 10 mM PBS (pH 7.4) bevattend 5 mM Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻. CV en differentiele pulsvoltammetrie (DPV) scans werden uitgevoerd van -0.4 V tot 1.0 V bij 10 mV s⁻¹.

Salivamonstername en electrochemische sensing

Twee gezonde vrijwilligers leverden 2 mL salivamonsters aan 's middags. Monsters werden bevroren bij -20 °C, ontdooid, gecentrifugeerd (3500 rpm, 15 min), en het supernatans werd gebruikt voor analyse. De cortisolmetingen van de sensor werden vergeleken met resultaten van de ELISA-kit.

Interferentie-studie

Potentiële interferenten - β-oestradiol, testosteron, progesteron, corticosteron (elk 100 nM) - werden getest door de sensor 10 min te incuberen en de CV-respons te meten. De invloed op cortisol-detectie was onder de 5%.

Detectie van salivaire cortisol door ELISA

ELISA werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. Een standaardcurve werd gegenereerd met zes cortisolconcentraties (0, 0.1, 0.4, 1.7, 7.0, 30 ng mL⁻¹). Absorbantie werd gelezen bij 450 nm en de resulterende curve werd gebruikt om onbekende monsters te kwantificeren.

Resultaten en discussie

Materialenanalyse van SnS₂

Het XRD-patroon komt overeen met de hexagonale SnS₂-fase (JCPDS 89-2358). FE-SEM-beelden tonen uniforme, 300-nm vlak-vormige deeltjes. TEM bevestigt einkristallijne flakes met tussenlaagafstanden van 0.167 nm en 0.316 nm, en een totale dikte onder 10 nm.

Elektrochemische responsen van de elektrode

Het toevoegen van SnS₂ aan GCE verhoogde de oxidatiestroom aanzienlijk. daaropvolgende antilichaam- en BSA-modificatie verhoogde de ladingsoverdrachtsweerstand, zoals weerspiegeld in EIS-data. CV van de BSA/C-M_ab/SnS₂/GCE bij scansnelheden 10-100 mV s⁻¹ toonde een lineaire toename van piekstroom, wat een oppervlakte-gecontroleerd, reversibel redox-proces bevestigt.

Zowel CV als DPV toonden een monotone afname van piekstroom met toenemende cortisolconcentratie. DPV leverde een lineaire relatie: y = -0.0103x + 0.0443 (R² = 0.9979), met een LOD van 100 pM en een gevoeligheid van 0.0103 mA M⁻¹ cm⁻². Het dynamische bereik van de sensor (100 pM-100 µM) dekt het volledige fysiologische spectrum van salivaire cortisol.

Opslagstabiliteitsstudie

CV werd uitgevoerd op sensoren opgeslagen gedurende 1 dag tot 1 week onder twee condities: vacuüm-droog en 4 °C. De 4 °C opslag behield 91% van de redox-piekstroom na 7 dagen, vergeleken met 82% onder vacuüm, wat betere stabiliteit van antilichaam-activiteit bij lagere temperatuur aangeeft.

Interferentie-studie

Incubatie met 100 nM β-oestradiol, testosteron, progesteron en corticosteron produceerde <5% verandering in cortisol-signaal, wat de hoge assay-specificiteit bevestigt.

Detectie van salivaire cortisol met ELISA en electrochemische methoden

Salivamonsters van twee vrijwilligers leverden cortisolconcentraties van 1.105 × 10⁻⁸ M en 3.998 × 10⁻⁹ M via ELISA, en 1.046 × 10⁻⁸ M en 3.911 × 10⁻⁹ M via de electrochemische sensor - slechts een 2-5% discrepantie - wat de nauwkeurigheid van de sensor bevestigt.

Vergelijking met andere studies

Vergelijking met andere niet-goud-gebaseerde cortisol-sensoren toont voordelen van dit werk: (1) aanzienlijk lagere materiaalkosten; (2) een snelle, eenvoudige fabricageprotocol; en (3) een LOD vergelijkbaar met, of beter dan, bestaande apparaten.

Conclusies

We hebben een tindisulfide-nanoflakes-gebaseerde electrochemische biosensor gedemonstreerd die een 100 pM LOD en een 100 pM-100 µM detectiebereik levert voor salivaire cortisol, met ELISA-nauwkeurigheid. De sensor vertoont <5% interferentie van structureel vergelijkbare steroïden en behoudt >90% activiteit na 7 dagen bij 4 °C. De lage kosten, eenvoudige assemblage en snelle uitlezing maken het een overtuigende kandidaat voor POC-stressmonitoring.

Beschikbaarheid van data en materialen

Alle data gegenereerd of geanalyseerd tijdens deze studie zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel.

Afkortingen

2D:

Twee-dimensionaal

BSA:

Bovine serumalbumine

C-M_ab:

Cortisol antilichaam

CV:

Cyclische voltammetrie

DPV:

Differentiele pulsvoltammetrie

EIS:

Electrochemische impedantiespectroscopie

ELISA:

Enzyme-linked immunosorbent assay

FEG-TEM:

Field emission gun transmissie elektronenmicroscoop

FE-SEM:

Veld-emissie scanning elektronenmicroscoop

GCE:

Glaskoolelektrode

HPA:

Hypothalamus-hypofyse-bijnier

PBS:

Fosfaat-gebufferde zoutoplossing

POC:

Point-of-care

PTSD:

Post-traumatische stressstoornis

SAED:

Geselecteerde-gebied diffractie

XRD:

Röntgendiffractie