Verbeterde Waterstofperoxide Detectie via Oppervlakte-Gemodificeerde Solid-State Nanoporen

Achtergrond

Nanopore detectietechnologie ontstamt uit de Coulter teller en cel ionenkanalen. Nanopore detecteert geladen moleculen aanwezig in een oplossing die erdoorheen passeren. Het verschijnen van moleculen in de nanopore kan de geleidbaarheid van de poer schijnbaar veranderen, wat resulteert in een verandering in het stroomsignaal. De verandering in de stroom levert informatie over de groottes en concentraties van de moleculen binnen de poer, om de dynamische processen van de moleculaire translocatiegedragingen onthullen. Sommige nanoschaal objecten kunnen gedetecteerd worden met een nanopore, zoals nanopartikels, virussen, eiwitmoleculen en DNA-sequenties. Nanoporen zijn van twee typen. Biologische nanopore en de solid-state nanopore. De biologische nanopore heeft een lagere signaal-ruisverhouding (SNR), en hogere resolutie. Kleine en ongevouwen eiwitten kunnen gedetecteerd worden met behulp van biologische nanoporen. Solid-state nanopore is grootte-aanpasbaar en heeft hogere stabiliteit. De solid-state nanopore wordt normaal geboord in een film, deze film deelt de fluidic cel in twee delen. Een bias spanning wordt toegepast over een dunne membraan die een nanopore bevat, wat resulteert in een ionische stroom van de ene cel naar de andere. Eiwitmoleculen inclusief gevouwen en ongevouwen structuren worden gedetecteerd en geanalyseerd door solid-state nanopore. De interactie van eiwitten kan ook gedetecteerd worden met solid-state nanopore. Bovendien heeft het de capaciteit om eiwitkinetica te detecteren. Om de limieten op het detectiebereik op te lossen, zijn chemisch gemodificeerde solid-state nanoporen uitgebreid toegepast, chemisch gemodificeerde solid-state nanoporen zijn toegepast om enkelstrengs DNA en eiwitten te detecteren.

Veel kwantitatieve methoden zijn al toegepast voor de detectie van H₂O₂, de meeste ervan zijn gebaseerd op spectrometrie, chemiluminescentie, amperometrie en electrochemie. De conventionele spectrometrische en chemiluminescente methoden zijn doorgaans tijdrovend en kostbaar. De solid-state nanopore sensor heeft laag verbruik en een simpele structuur, en kan gebruikt worden om kleine moleculen te detecteren.

Hier presenteren we een type solid-state nanopore die gemodificeerd was met horseradish peroxidase (HRP). De HRP's waren geïmmobiliseerd op de binnenkant van de solid-state nanopore, de geïmmobiliseerde HRP's bleven actief in de redoxreactie die plaatsvond binnen een enkele nanoporekanaal in de aanwezigheid van H₂O₂. De ABTS•⁺ geproduceerd in de redoxreactie zou aggregeren, daarna passeerde de geaggregeerde ABTS•⁺ door de nanopore. De translocatiegebeurtenissen kunnen gedetecteerd worden. Voor de waterstofperoxide detectie is de structuur van de solid-state simpel, en het kan de geaggregeerde ABTS•⁺ detecteren door gebruik te maken van laag reagentverbruik. Deze horseradish peroxidase (HRP) enzymen modificatie solid-state nanopore kan de waterstofperoxide (H₂O₂) sensing indirect volbrengen, door de geaggregeerde ABTS•⁺ detectie. Het heeft instructieve betekenis voor enkelmolecuul detectie en moleculaire assemblage binnen solid-state nanopore.

Methoden

Chemicaliën en Materialen

Het Horseradish Peroxidase (HRP) molecuul (1mg mL⁻¹, Enzyme Commissie No.1.11.1.7, 44 kDa) werd gekocht van Xiya Reagent (Chengdu, China). Het monster (HRP) werd opgelost in 0,02 µm gefilterde 0,1 M PBS, opgeslagen bij 4 °C, en binnen twee dagen na preparatie gebruikt. Kaliumchloride (KCl), N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS) en 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ((ABTS), 98%) werden gekocht van DiBo chemical technology co., LTD (Shanghai, China). Waterstofperoxide (H₂O₂, 30%) werd gekocht van Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (3-Aminopropyl)triethoxysilane (3-APTES) werd gekocht van Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Experimenten werden uitgevoerd met ultrazuiver water uit een Milli-Q water zuiveringssysteem (weerstand 18,2 MΩ/cm, 25 °C, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) en gefilterd door 0,02 µm in een FEI Strata 201 FIB systeem (FEI Co., Hillsboro, OR, USA), een Zetasizer (Malvern Zetasizer Nano ZS), en een Axopatch 700B (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA). De foto's van onze gebruikte instrumenten werden toegevoegd aan het supplementaire materiaal.

Solid-State Nanopore Fabricatie en Elektrische Metingen

Eerst werd een dunne membraan van Si₃N₄ (100 nm dikte) gedeponeerd op een Si substraat met 300 µm dikte. Vervolgens fotolithografie (het open venster formaat is 500 × 500 µm²). Dan werd het oppervlak van de membraan gebombardeerd met Ga⁺ ionen met behulp van een FEI Strata 201 FIB systeem (FEI Co., Hillsboro, OR, USA) bij een versnellingspotentiaal van 30 kV, terwijl de stroom gemeten werd als 1 pA. De maalduur was 1,5 s onder een spotmodus. Ten slotte werden de solid-state nanopore chips verkregen en gereinigd in vers bereide piranha-oplossing bij 80 °C gedurende 30 min, gevolgd door afspoelen met ultrazuiver water. Na reiniging werd de chip gemonteerd in een custom-built Teflon cel met twee Viton O-ringen om de twee kanten van de chip te scheiden, en twee reservoirs te vormen om de enige weg voor ionische stroom door de nanopore te garanderen. De foto's van ons gebruikte apparaat werden toegevoegd aan het supplementaire materiaal. Elektroden (Ag/AgCl) werden verbonden met de fluidic cel en een patch clamp versterker (Axopatch 700B, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA) die de ionische stroom meetbaar maakte onder constante spanningen, met 100 kHz bemonsteringssnelheid voor signalen. De versterker interne laagdoorlaat acht-pool Bessel filter was ingesteld op 10 kHz. Het gehele instrument werd geplaatst in een dubbele Faraday kooi omhulling.

Resultaten en Discussie

Immobilisatie van Nanopore met HRP's

De geselecteerde nanopore met een diameter van ~50nm werd gedoopt in piranha-oplossing bij 80 °C gedurende 30 min. Na behandeling met piranha-oplossing, was de binnenkant van de nanopore in staat om siliciumhydroxylgroepen aan te nemen. Vervolgens werd de hele dunne film geactiveerd met (3-Aminopropyl)triethoxysilane (3-APTES). Als resultaat van behandeling met 3-APTES, werden amino (-NH₂) groepen gegenereerd op het oppervlak van de film.

Na activering met (3-Aminopropyl)triethoxysilane (3-APTES), werd de nanopore chip gebracht in 0,1 M PBS oplossing van N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) (10 mM) en N-hydroxysuccinimide (NHS) (20 mM). Daarna werd de nanopore chip geïntroduceerd tot horseradish peroxidase (HRP) (10 ng/ml). Volgens eerdere onderzoeksresultaten van onze groep, met verschillende zoutconcentraties van 0,1 tot 2 M KCl, pH 7,0, aggregeerde HRP niet. Rekening houdend met de pI-waarde van horseradish peroxidase van 4,3 ± 0,2, hebben we ook bewezen dat HRP niet aggregeerde in 0,1 M KCl pH 6,0 en pH 7,0. Het EDC reagent activeerde de carboxyl (-COOH) groepen van HRP in een hoogst reactieve o-acylisourea intermediair. Verder werd het intermediair geconverteerd in een meer stabiele succinimidyl amine-reactieve ester in de aanwezigheid van NHS. Resulterend in covalente koppeling van het intermediair met de (-NH₂) gegenereerd op de binnenoppervlakken van de nanopore om stabiele amidebindingen te vormen (Fig. 1).

Deze processen leiden ons tot de immobilisatie van HRP's op de binnenkant van een enkele nanopore. De realisatie van het functionaliseringsproces werd bevestigd door het meten van de stroom-spanning (I-V) van een enkele nanopore voor en na modificatie (Fig. 2).

Karakterisering van HRP Gemodificeerde Solid-State Nanopore

Hier is de vorm van een enkele Si₃N₄ nanoporekanaal cylindrisch. Figuur 2 toont de typische stroom-spanning (I-V) curven van de ongemodificeerde (originele) en gemodificeerde nanopore in 0,1 M KCl, gebufferd op pH 7,0 met 0,1 M PBS. Na het modificeren van de binnenkant van de nanopore met HRP enzymen, werd de poorgrootte kleiner.

Volgens Wanunu et al., door rekening te houden met de geleidbaarheid van de buitenkant van de nanopore, kan de diameter van de solid-state nanopore berekend worden door de volgende vergelijking:

Waar, d en l de diameter en lengte van de poer zijn, G is de open poer geleidbaarheid van de nanopore, σ is de geleidbaarheid van de ionenoplossing.

Overweging van geometrische effecten, na de modificatie van de solid-state nanopore met HRP enzymen, kan de effectieve grootte berekend worden. De diameter van een enkele nanopore kan berekend worden gebaseerd op vergelijking (1). Waar, de waarde van geleidbaarheid (G_unmodified) is ~15 nS kan verkregen worden uit de I-V curven van de ongemodificeerde solid-state nanopore. De geleidbaarheid (σ) van de ionenoplossing 0,1 M KCl (25 °C), gebufferd op pH 7,0 met 0,1 M PBS is ~1,28 S/m. Daarom is de diameter van de ongemodificeerde nanopore ~51 nm, het is vergelijkbaar met de gemeten diameter. Met dezelfde methode, is de verkregen waarde van geleidbaarheid (G_modified) ~7,5 nS, en de diameter (~34 nm) van de gemodificeerde nanopore kan berekend worden. Reductie in diameter is mogelijk door de volgende twee redenen, ten eerste is het behandelen van de binnenkant van de nanopore met (3-aminopropyl)triethoxysilane (3-APTES), wat het oppervlak van de nanopore in staat stelt (-NH₂) aminogroepen aan te nemen. De tweede reden is dat de hydrodynamische diameter (D_h) van HRP enzym is ~8 nm, de geïmmobiliseerde HRP's konden de poer diameter reduceren. Hier wordt de HRP's gemodificeerde solid-state nanopore met diameter van ~34 nm gebruikt als de waterstofperoxide detectiekanaal.

Het Principe van de Redoxreactie

De redoxreactie werd uitgevoerd binnen een enkele gemodificeerde nanopore, en het volgende gepresenteerde reactieproces stemt goed overeen met de voorgestelde redoxreactie. In aanwezigheid van H₂O₂ (0,5 mM), werden HRP enzymen geïmmobiliseerd op de binnenkant van de nanopore direct geconverteerd in compound 1. Vervolgens accepteerde compound 1 één elektronen van het reducerende substraatmolecuul ABTS (1,5 mM) om compound 2 te genereren. Vervolgens werd compound 2 teruggereduceerd naar het rustende enzym via één elektronenoverdracht van een ander substraatmolecuul ABTS.

De kationische producten (ABTS•⁺) van de redoxreacties accumuleerden in de enkele nanopore. De translocatie van geaccumuleerde moleculen uit het nanoporekanaal zou de geleidbaarheid (G) veranderen, en dus de verandering van stroom (ΔI_b) kan gevonden worden.

Detectie van Translocatiegebeurtenissen

Experimenten werden uitgevoerd met horseradish peroxidase (HRP) gemodificeerde nanoporen met gemodificeerde poordiameters (~34 nm) in 0,1 M KCl, gebufferd op pH 7,0 met 0,1 M PBS. 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate (ABTS) (1,5 mM) en waterstofperoxide (H₂O₂) (0,5 mM) werden toegevoegd aan het trans compartiment van de nanopore. Na het toevoegen van ABTS en H₂O₂, werden experimenten met bias spanningen van -100 tot -800 mV uitgevoerd, en ze werden bemonsterd met 100 kHz. Er waren geen translocatiegebeurtenissen tot de spanning verhoogd werd tot -400 mV. Figuur 3 toont representatieve ionische stroomtraceringen van de translocatiegebeurtenis bij verschillende spanningen van -400 tot -800 mV in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. De experimenten data van lange duur translocatiegebeurtenissen van verschillende spanningen werden toegevoegd aan het supplementaire materiaal.

De milliseconde stroomblokkadegebeurtenissen werden waargenomen, uitgevoerd in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Door het reagent H₂O₂ en ABTS toe te voegen aan het transcompartiment, HRP enzymen geïmmobiliseerd op de binnenkant van een enkele nanoporekanaal, en redoxreactie plaatsvond. Overvloed van ABTS•⁺ moleculen werden geproduceerd, een enkel kleiner molecuul ABTS•⁺ kan misschien niet gedetecteerd worden met onze solid-state nanopore, vanwege de resolutie van het systeem. Echter, deze moleculen zouden aggregeren na hun productie. Daarom is het mogelijk om de ABTS•⁺ moleculen te detecteren. Hier werden de negatieve spanningen gehouden, en geaggregeerde ABTS•⁺ moleculen passaram door de nanoporen. Er was een elektroforetische en electro-osmotische stroom wanneer negatieve spanning werd toegepast. HRP was negatief geladen in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0, als resultaat, zou een dubbele elektrische laag geproduceerd worden, en electro-osmose zou naar de negatieve elektrode richting zijn. Vanwege deze reden, waren electroforese en electro-osmose in dezelfde richting. De geaggregeerde ABTS•⁺ in het enkele nanoporekanaal zouden transporteren door de solid-state nanopore, stroomend naar de negatieve elektrode richting.

Statistische Analyse van Translocatiegebeurtenissen

Omdat de bias spanning een sleutelrol speelde in de translocatie van geaggregeerde ABTS•⁺, werd de invloed van stroomblokkades van geaggregeerde ABTS•⁺ die door de HRP's gemodificeerde nanopore passeren versus toegepaste spanningen besproken. De voorkomensfrequentie van translocatiegebeurtenissen verbeterde aanzienlijk met de toename van spanning (Fig. 3f). Toen de spanning toenem, deed de amplitude van de stroom dat ook. Echter, de translocatiegebeurtenissen verdwenen geleidelijk toen de bias spanning onder -300 mV gehouden werd, wat suggereerde dat geaggregeerde ABTS•⁺ over HRP's gemodificeerde nanoporen een -300 mV drempelspanning nodig had. Figuur 4 toont histogrammen van de gemiddelde stroomamplitude van translocatiegebeurtenissen gemeten voor geaggregeerde ABTS•⁺ bij verschillende spanningen. Gebaseerd op de fitcurven, zijn de piekwaarden van de stroomblokkade (ΔI_b) 308,4 ± 27,795 pA, 419,1 ± 20,354 pA, 478,8 ± 32,857 pA, 528,1 ± 36,98 pA, 606,9 ± 40,916 pA bij -400, -500, -600, -700, en -800 mV, respectievelijk, het is waarschijnlijk dat de reductie van de stroom geïnduceerd wordt door geaggregeerde ABTS•⁺ molecuul dat door de nanopore passeert bij verschillende spanningen. De waarden van stroomamplitude werden gefit met een eerste-orde polynomiale functie, wat een helling van -0,706 en intercept van 49,262 produceert. Echter, gebaseerd op de fitcurven, zijn de waarden van verblijftijd 54,5 ± 21,374 ms, 42,8 ± 20,181 ms, 10,3 ± 3,05 ms, 6,0 ± 1,744 ms, 4,0 ± 1,441 ms, bij -400, -500, -600, -700, en -800 mV. Figuur 3h toont een exponentieel afnemende functie (t_d ~ e^{-v/v0}) werd gebruikt om de verblijftijd afhankelijk van de toegepaste spanningen te fitten. De histogrammen van de verblijftijd van translocatiegebeurtenissen werden toegevoegd aan het supplementaire materiaal.

De stroomblokkade versus gebeurtenissen verblijftijd voor elke geaggregeerde ABTS•⁺ bij verschillende spanningen werden gefit in twee-dimensionale spreidingsplots (Fig. 5). Alle geaggregeerde ABTS•⁺ tonen een cluster van gebeurtenissen van -400 tot -800 mV, de hoofdgebeurtenisclusters zijn door geaggregeerde ABTS•⁺ die door de HRP's gemodificeerde solid-state nanopore passeren.

Daarnaast werd de enkele translocatiegebeurtenis bij elke spanning geanalyseerd, en de stroomblokkade werd geïnduceerd door dezelfde grootte en geladen stof. Dus, het wordt geacht dat elke translocatiegebeurtenis geïnduceerd werd door de enkele geaggregeerde ABTS•⁺. Om de translocatietijd van geaggregeerde ABTS•⁺ in onze experimenten te analyseren. De stroomblokkadeduur t_d wordt beschouwd als de verblijftijd van een enkele geaggregeerde ABTS•⁺ van de locatie waar het geproduceerd werd tot de uitgang van de nanopore. Hier werd nog een voorwaarde overwogen, er kunnen enkele HRP enzymen geïmmobiliseerd zijn op de ingang van de nanopore, en het kan de redoxreactie katalyseren. Daarom werden andere experimenten uitgevoerd om te verifiëren dat de redoxreactie plaatsvond op de binnenkant van een enkele nanopore in plaats van aan de ingang. Voor de verificatie, ongemodificeerde door HRP's werden toegepast en geanalyseerd. Deze nanoporen werden geactiveerd met 3-APTES. En dezelfde concentratie HRP's (10 ng/ml), ABTS (1,5 mM) en H₂O₂ (0,5 mM) werden toegevoegd aan het trans compartiment van de nanopore, de negatieve bias spanning werd toegepast in 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0, door de elektroforetische kracht, waren HRP's onbekwaam om door de nanopore te passeren. Vanwege de redoxreactie, werden de geaggregeerde ABTS•⁺ geproduceerd, maar er werden geen translocatiegebeurtenissen gevonden. Het is mogelijk dat de geaggregeerde ABTS•⁺ electrostatisch effect veroorzaken met HRP's en de geaggregeerde ABTS•⁺ voorkomen om door de nanopore te passeren.

Figuur 6 toont de twee-dimensionale spreidingsplots van de verandering van geleidbaarheid (ΔG) versus gebeurtenissen verblijftijd voor elke geaggregeerde ABTS•⁺ bij verschillende spanningen. Het kan gevonden worden dat de verandering van geleidbaarheid (ΔG) voornamelijk geconcentreerd is in 0,8 nS. De vorm van translocatiegebeurtenissen zijn bijna hetzelfde. De gemiddelde waarde van ΔG is ~0,8 nS bij verschillende spanningen. Het kan gespeculeerd worden dat het volume-uitsluiting van elke geaggregeerde ABTS•⁺ molecuul bijna hetzelfde is. Het is mogelijk dat electrostatische en sterische effecten van geaggregeerde ABTS•⁺ moleculen de ionische stroom kunnen veranderen. Na de analyse, werden twee typische vormen van stroomtraceringen met de positief geladen geaggregeerde ABTS•⁺ translocatie waargenomen (Fig. 7). De translocatiegebeurtenissen bij -700 mV als representatief. Het percentage van twee type gebeurtenissen werd geanalyseerd, en het kan waargenomen worden dat het percentage van type 1 gebeurtenissen toename met de toename van spanning, aan de andere kant, het percentage van type 2 gebeurtenissen nam af. Het werd overwogen dat hogere spanning de translocatie sneller maakt dan lagere spanning.

De stroomblokkadesignalen onthulden de grootte, conformatie, en interactie van geaggregeerde ABTS•⁺ die door het enkele nanoporekanaal passeren. Voor de verandering in stroomvorm, werd het proces van de veranderingen gespeculeerd. Voor gebeurtenis 1, hebben stroomsignalen een typische fluctuerende diepe intensiteit en een korte verblijftijd. Het is mogelijk dat de geaggregeerde ABTS•⁺ door de nanopore passeerde van de plek waar het geproduceerd werd. Toen de geaggregeerde ABTS•⁺ door de nanopore passeerde, herstelde de ionische stroom van de nanopore naar het oorspronkelijke niveau (Baseline) (I_0). Voor gebeurtenis 2, hebben de stroomsignalen een fluctuerende diepe intensiteit en dan een horizontaal stadium. Deze vorm van signalen kan toegeschreven worden aan de electrostatische interactie van geaggregeerde ABTS•⁺ met de HRP's aan de uitgang van de nanopore, en de stroom herstelde langzaam naar de baseline. Voor beter begrip van de stroomverandering, moeten we beginnen met de open poer geleidbaarheidsverandering (G_pore) bij zoutconcentratie (0,1 M KCl). Zoals besproken in eerdere studies, kan een vergelijking van de open poer geleidbaarheid van een negatief geladen nanopore met een diameter van d en een lengte van l bij lage zoutconcentratie worden beschreven als:

waar μ_K en μ_Cl de elektroforetische mobiliteiten van K⁺ en Cl⁻ zijn, n_KCl is de getalsdichtheid van K⁺ en Cl⁻, de elementaire lading is e, σ_p is de oppervlakteladingsdichtheid van de nanopore-oppervlakken. In dit experiment werd de solid-state nanopore chemisch gemodificeerd, en de diameter van de nanopore veranderde. De oppervlakteladingsdichtheid van de nanopore-oppervlak (σ_p) kan niet exact verkregen worden. Daarom werd de open poer geleidbaarheid (G_pore) berekend gebaseerd op vergelijking (1). Rekening houdend met vergelijking (1), is de open poer geleidbaarheid (G_pore) ~7,5 nS. Het wordt gespeculeerd dat de verandering van geleidbaarheid toegeschreven kan worden aan twee redenen. De eerste reden is dat, de volume-uitsluiting van ionen in de nanopore bezet werden door de geaggregeerde ABTS•⁺ moleculen. Als resultaat, werd de geleidbaarheid van de solid-state nanopore verlaagd (ΔG⁻). De tweede reden is dat, sommige ionen werden uit de nanopore meegenomen door de geaggregeerde ABTS•⁺ moleculen wat de geleidbaarheid van de solid-state nanopore verhoogde. In deze experimenten werd de ABTS•⁺ binnen de nanopore geproduceerd, en er werden geen ionen meegenomen. Daarom was de verandering in de geleidbaarheid van de solid-state nanopore (ΔG) alleen geïnduceerd door de volume-uitsluiting. Dus, de totale verandering van de geleidbaarheid kan worden beschreven als:

De afname in de geleidbaarheid van de solid-state nanopore wordt geïnduceerd door de volume-uitsluiting en kan berekend worden door de volgende vergelijking:

waar γ de deeltjesvormfactor is wat de oppervlakteverhouding is van dezelfde volume spherische en het deeltje. In dit werk werd het geaggregeerde ABTS•⁺ molecuul vereenvoudigd tot een globaal object, daarom is de waarde van γ 1 en Λ is de volume-uitsluiting. De geleidbaarheid van de bulk oplossing σ is 1,28 S/m, 0,1 M KCl (25 °C).

Voor de volume-uitsluiting (Λ), kunnen we afleiden van de translocatiegebeurtenissen van sommige andere moleculen. Voor het verbinden van de geleidbaarheidsverandering (ΔG) met de fysieke eigenschap van moleculen, kan de Wet van Ohm toegepast worden op het volumeverandering van elektrolytoplossing gebaseerd op de solid-state nanopore. Wanneer een translocatiegebeurtenis van een molecuul in een cylindrische solid-state nanopore, daalt de stroom instantane. Wanneer de weerstand van de solid-state nanopore de hele circuitweerstand is, kan de geleidbaarheidsverandering (ΔG) worden beschreven door de volgende vergelijking:

In deze vergelijking, A_p H_eff = V_p is het volume van de solid-state nanopore, f(d_m/D_p, l_m/H_eff) is correctiefactor (het negeert het oppervlakteladingseffect), in onze experimenten vereenvoudigden we het geaggregeerde ABTS•⁺ molecuul tot een globaal object; daarom is de correctiefactor 1. De d_m/D_p is de verhouding van molecuuldiameter en nanoporediameter, De l_m/H_eff is verhouding van molecuul effectieve lengte en nanopore effectieve lengte. De uitdrukking (5) kan worden vereenvoudigd als:

De gemiddelde waarde van geleidbaarheid (G_pore) is geanalyseerd van translocatiegebeurtenissen. Uit vergelijking (5) kan de gemiddelde waarde van volume-uitsluiting (Λ) bij verschillende spanningen (-400, -500, -600, -700, -800 mV) verkregen worden. Tegelijkertijd is de grootte van de gebruikte nanopore bekend, het volume van de nanopore (V_p) is ~90746 nm³. Rekening houdend met vergelijking (4), kan de waarde van geleidbaarheidsverandering (ΔG⁻) berekend worden als ~0,6 nS. De gemiddelde waarde van geleidbaarheidsverandering die verkregen is uit de translocatiegebeurtenissen experimenten bij verschillende spanningen (-400, -500, -600, -700, -800 mV) is ~0,784 nS. Het kan gevonden worden dat de berekende waarde dichtbij de experimentele waarde ligt.

In eerdere onderzoeken zijn waterstofperoxide moleculen gedetecteerd met verschillende technologieën. Maar, om waterstofperoxide te detecteren door nano kanaal is zeldzaam. Tan et al. differentieerden uiteenlopende gebeurtenissignalen toen HRP's in nanopore geïmporteerd werden, er waren ABTS en H₂O₂ in KCl oplossing. De verschillende type signalen met HRP translocatie werden beschouwd als ABTS•⁺ die door nanopore passeren. Zes typische gebeurtenissen van de translocatie van het product van enzym katalyse substraten werden geanalyseerd. Ze speculeerden het waarschijnlijke proces van elk type. Echter, onvoldoende bewijzen om te testificeren. Mubarak Ali et al. hebben bereikt om de redoxreactie producten binnen enkele conische nano kanalen te detecteren. Ze vonden dat de kationische radicaal ABTS•⁺ de ionenstroom in de HRP-nano kanaal in een spanning-afhankelijke manier reduceerde, consistent met spanning-afhankelijke concentraties van ionen in conische nano kanalen. De grootte van de stroomblokkade was gecorreleerd met de H₂O₂ concentratie in de oplossing.

Conclusies

Concluderend, we fabriceren een Si₃N₄ nanopore met behulp van een FIB met succes, een enkel nanopore systeem wiens oppervlak gemodificeerd was met covalent gelinkte HRP enzymen. Het effect van de geïmmobiliseerde HRP enzymen in een enkele solid-state nanopore als een waterstofperoxide (H₂O₂) sensor bevestigd door het onderzoeken van producten (ABTS•⁺) van de redoxreacties die plaatsvinden in de aanwezigheid van de substraten H₂O₂ en ABTS. De geaggregeerde kationische radicaal ABTS•⁺ geproduceerd binnen de solid-state nanopore en verminderde de ionische stroom in de HRP's gemodificeerde solid-state nanopore, zijn consistent met spanning-afhankelijkheid. De stroomblokkadetrends toonden lineaire afhankelijkheid voor toegepaste bias spanningen. De relatie tussen de verblijftijd versus toegepaste bias spanning was de exponentieel afnemende (t_d ~ e^{-v/v0}). Tegelijkertijd, de geaggregeerde ABTS•⁺ die door de HRP's gemodificeerde nanoporen passeren nodig had een -300 mV drempelspanning. De verandering van geleidbaarheid (ΔG) is analytisch berekend en vergeleken met de gemeten experimentele waarden. De translocatiegebeurtenissen werden geproduceerd door de bepaalde grootte geaggregeerde kationische radicaal ABTS•⁺. We verwachten dat het gebruik van solid-state nanoporen zal toestaan de detectielimiet te verlagen en de systeemgevoeligheid te verbeteren. Voor ons solid-state nanopore systeem, is de structuur simpel; het is niet vatbaar voor vervuiling en kan meerdere keren gebruikt worden.

Afkortingen

3-APTES:

(3-Aminopropyl)triethoxysilane

ABTS:

3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid

EDC:

N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide

FIB:

Gefocuste ionenbundel

HRP:

Horseradish peroxidase

KCl:

Kaliumchloride

NHS:

N-hydroxysuccinimide

SEM:

Scanning-elektronenmicroscopie

SNR:

Signaal-ruisverhouding