Vorm-afhankelijke cytotoxiciteit en cellulaire opname van groene-thee-gereed goudnanodeeltjes in kankercellen

Samenvatting

In dit rapport werden drie verschillende vormen van chitosan-gecapte goudnanodeeltjes (nanosferen, nanosterren en nanostaven) gesynthetiseerd om de effecten van vorm op cytotoxiciteit en cellulaire opname in kankercellen te onderzoeken. Groene-thee-extract werd gebruikt als reducerend middel om goudzouten te reduceren tot goudnanosferen. Nanosterren werden bereid met een as-geprepareerde nanosfeer-oplossing als zaadoplossing. Nanostaven werden gesynthetiseerd met een conventionele methode. Alle drie soorten goudnanodeeltjes toonden hun karakteristieke oppervlakte-plasmon-resonantie-banden bij UV-zichtbaar spectrophotometrie. In hoge-resolutie transmissie elektronenmicroscopie-afbeeldingen werden roosterstructuren duidelijk waargenomen in alle drie vormen, wat de kristallijne aard van de nanodeeltjes bevestigt. Alle drie colloidale oplossingen van goudnanodeeltjes behielden colloidale stabiliteit in diverse oplossingen. Om cytotoxiciteit te beoordelen, werd de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay uitgevoerd op vier kankercellijnen. De cytotoxiciteit was het hoogst in nanostaven, gevolgd door nanosterren en tenslotte nanosferen. De cellulaire opname van goudnanodeeltjes in humane hepatocellulaire carcinoomcellen (HepG2) werd gemeten, en de resultaten volgden de orde nanosferen > nanostaven > nanosterren. De uitkomsten van de huidige studie kunnen helpen bij het vormontwerp van goudnanodeeltjes voor therapeutische toepassingen als medicijn-afgifte voertuigen in het veld van nanomedicine.

Inleiding

Planten bevatten natuurlijke primaire en secundaire metabolieten, waaronder flavonoïden, saponines, alkaloïden, steroïden, coumarines, tannines, fenolen, terpenoïden, koolhydraten, eiwitten en aminozuren. Recent worden plantenextracten gebruikt voor de synthese van nanomaterialen, specifiek metaalnanodeeltjes zoals goud, zilver, titaniumoxide, koper, palladium, zinkoxide en platina nanodeeltjes [1]. Diversifie fytochemicals nemen actief deel aan het converteren van metaalzouten naar metaalnanodeeltjes als reducerende middelen. Bovendien spelen plantenextracten een rol als stabiliserende middelen om de colloidale stabiliteit van metaalnanodeeltjes in oplossing te behouden. Chemische reducerende middelen zijn doorgaans schadelijk en giftig voor levende organismen. In tegenstelling, het gebruik van plantenextracten in de synthese van metaalnanodeeltjes is groen, eco-vriendelijk en duurzaam. Verscheidene plantendelen, zoals stammen, vruchten, zaden, bladeren en bloemen, worden gebruikt om metaalnanodeeltjes te synthetiseren [1, 2]. Uitgebreide reviews hebben de groene synthese van goudnanodeeltjes (AuNPs) met plantenextracten als reducerende middelen onderzocht [2,3,4]. Met deze groene strategie wordt de synthetische stap in één stap en in één pot uitgevoerd. Verder is het proces eenvoudig, gemakkelijk, kosteneffectief en eco-vriendelijk. De grootte, vorm en topografie van AuNPs zijn afhankelijk van de concentraties van goudzouten en extracten, reactietijd, reactietemperatuur en oplossings-pH. Spectroscopische en microscopische technieken worden gebruikt om AuNPs te karakteriseren, waaronder UV-zichtbaar spectrophotometrie, röntgendiffractie, Fourier-transformatie infraroodspectroscopie (FT-IR), transmissie elektronenmicroscopie (TEM), atomische kracht microscopie (AFM), scanning elektronenmicroscopie (SEM) en hydrodynamische grootte en zeta-potentiaal metingen. Deze groene AuNPs worden toegepast als katalysatoren, antioxidanten, antimicrobiële en antikanker middelen [5,6,7,8].

In het laboratorium van de auteurs zijn plantenextracten (Artemisia capillaris, Leonurus japonicus, Polygala tenuifolia, Caesalpinia sappan, Bupleurum falcatum en Garcinia mangostana) gebruikt als reducerende middelen om groen zowel AuNPs als zilvernanodeeltjes (AgNPs) te synthetiseren [9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]. Het luchtige deel van A. capillaris werd geëxtraheerd en gebruikt voor de synthese van AgNPs en AuNPs [9, 15, 16]. De bereide AgNPs uitoefenden uitstekende antibacteriële activiteit tegen Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella aerogenes en Klebsiella oxytoca vergeleken met die van het extract alleen [15]. Dit resultaat gaf aan dat het synergistische effect van het combineren van AgNPs en het extract bijdroeg aan versterkte antibacteriële activiteit. Interessant genoeg, AgNPs gesynthetiseerd met A. capillaris in de aanwezigheid van cetyltrimethylammoniumbromide vertoonden antibacteriële activiteit tegen methicilline-resistente Staphylococcus aureus [16]. Bovendien toonden AuNPs gesynthetiseerd met A. capillaris katalytische activiteit ten aanzien van de 4-nitrofenol-reductiereactie [9]. L. japonicus extract werd gebruikt voor de synthese van AgNPs met opvallende verbeteringen in antibacteriële activiteit [10]. We observeerden dat antibacteriële activiteit tegen Gram-negatieve bacteriën groter was dan tegen Gram-positieve bacteriën. De wortel-extract van P. tenuifolia werd ook gebruikt voor de synthese van AuNPs en AgNPs [11, 17]. Versterkte anticoaguulant-activiteit en antibacteriële activiteit werden waargenomen in AuNPs en AgNPs, respectievelijk, gesynthetiseerd met P. tenuifolia extract. Meest interessant, AgNPs gesynthetiseerd met C. sappan extract toonden effectieve antibacteriële activiteit tegen methicilline-resistente S. aureus [18]. De extract van G. mangostana produceerde asymmetrische hamerkop-vormige AgNPs met apoptotische effecten [14].

Eerdere rapporten hebben de groene synthese van AuNPs en AgNPs met theeblaadje-extract onderzocht [19,20,21,22,23]. Kamal en medewerkers rapporteerden de succesvolle synthese van 25 nm AgNPs [19]. In een ander rapport werden sferische AgNPs van 20 tot 90 nm gesynthetiseerd met theeblaadje-extract [20]. De gesynthetiseerde AgNPs toonden lichte antibacteriële activiteit tegen E. coli. Sferische AgNPs van 3,42~4,06 nm werden ook bereid door Loo en medewerkers met theeblaadje-extract [21]. Vaseeharan en medewerkers synthetiseerden antibacteriële AgNPs met theeblaadje-extract [22]. De gesynthetiseerde AgNPs waren effectief tegen pathogene Vibrio harveyi infectie. Begum en medewerkers gebruikten zwarte theeblaadje-extract om zowel AuNPs als AgNPs te synthetiseren [23]. Tot nu toe zijn voornamelijk sferische AgNPs gesynthetiseerd met theeblaadje-extract.

In het huidige rapport werd chitosan gebruikt als capping-agent voor AuNPs. Chitosan is verkend als een medicijn/gen-afgifte voertuig vanwege zijn hoge biocompatibiliteit, lage allergeniciteit, afbreekbaarheid en lage toxiciteit [24,25,26]. Chitosan ontstaat uit chitine, wat overvloedig is in de exoskeletten van insecten en schaaltjes zoals krabben, kreeften en garnalen. Chitine is een polysacharide samengesteld uit N-acety-D-glucosamine verbonden door β(1-4) glycosidische bindingen. Chitosan kan verkregen worden uit chitine door een heterogene N-deacetylatie-proces. Chitosan zelf bezit antibacteriële, antifungale, antitumorale en antioxidante activiteit [25]. Als capping-agent contacteert chitosan direct AuNPs via een electrosterisch mechanisme [26]. Chitosan-nanodeeltjes beïnvloeden het mechanisme van cellulaire opname door A549-cellen zonder de cytotoxiciteit te wijzigen [24]. Verder is de graad van deacetylatie van chitosan invloedrijker dan molecuulgewicht op cellulaire opname en cytotoxiciteit [24].

Meeste studies hebben zich gericht op de synthese van sferische AgNPs met theeblaadje-extract. Hier werd groene-theeblaadje-extract gebruikt om goudnanosferen en nanosterren te synthetiseren. De nanosferen werden als zaden gebruikt voor de zaad-gemedieerde synthese van nanosterren. Voor vergelijking werden nanostaven gesynthetiseerd door een gangbare conventionele methode [27]. Drie verschillende vormen van AuNPs (nanosferen, nanosterren en nanostaven) werden gecapt met chitosan om hun biocompatibiliteit en colloidale stabiliteit te vergroten. Deze AuNPs werden gekarakteriseerd door UV-zichtbaar spectrophotometrie, hoge-resolutie transmissie elektronenmicroscopie (HR-TEM) en FT-IR. Hydrodynamische grootte-metingen uitgevoerd door dynamische lichtverstrooiing (DLS) en zeta-potentiaal-metingen werden uitgevoerd voor en na capping met chitosan. Colloidale stabiliteit werd beoordeeld in zoutoplossingen, buffer en celcultuurmedium. Om cytotoxiciteit te meten, werd de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay toegepast op vier kankercellen: AGS (humane maagadenocarcinoomcellen), HeLa (humane epitheliale baarmoederhalsadenocarcinoomcellen), HepG2 (humane hepatocellulaire carcinoomcellen) en HT29 (humane colorectal adenocarcinoomcellen). Cellulaire opname van AuNPs in HepG2-cellen werd kwantitatief gemeten door geïnductief gekoppelde plasma optische emissiespectroscopie (ICP-OES) en laser-ablatie geïnductief gekoppelde plasma massa-spectrometrie (LA-ICP-MS).

Materialen en methoden

Materialen en instrumentatie

Chloorzuurgoud trihydraat (HAuCl₄·3H₂O), cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB), chitosan (uit garnalenschillen, ≥ 75% gedeacetyleerd) en 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide werden gekocht van Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS). Alle overige reagentia waren van analytische kwaliteit. Een Shimadzu UV-1800 of UV-2600 spectrophotometer werd gebruikt om UV-zichtbare spectra te verkrijgen in een kwarts cuvet (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). Hydrodynamische grootte-metingen uitgevoerd door DLS en zeta-potentiaal-metingen werden uitgevoerd met een NanoBrook 90Plus Zeta (Brookhaven Instruments Corporation, New York, VS). Een Varian 640 IR werd gebruikt om FT-IR-spectra te verkrijgen (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, VS); het monster werd bereid door de KBr-schijf-methode. HR-TEM-afbeeldingen werden vastgelegd met een JEM-3010 bediend bij 300 kV (JEOL, Tokyo, Japan); het monster werd geladen op een koolstof-gecoate koperen rooster (koolstof type-B, 300 mesh, Ted Pella, Redding, CA, VS) en toegestaan om 24 uur bij 37 °C in een oven te drogen. Voor sonicatie werd een model WUC-A22H gebruikt (Daihan Scientific Co. LTD., Seoul, Republiek Korea). Een Centrifuge 5424R (Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland) en een FD8518 (IlshinBioBase Co. LTD., Gyeonggi, Republiek Korea) werden gebruikt voor centrifugatie en vriesdrogen, respectievelijk. Voor de cellulaire opname van AuNPs werden een Optima 8300 ICP-OES (PerkinElmer, Waltham, MA, VS) en een J200 Tandem LA-ICP-MS (Applied Spectra, Fremont, CA, VS) gebruikt.

Bereiding van groene-thee-extract

Het Instituut van Hadong Groene Thee (Hadong, Gyeongnam, Republiek Korea) leverde vriendelijk gedroogde groene-theebladen. Een mixer werd gebruikt om poeders van de gedroogde bladen te bereiden. Extractie werd uitgevoerd door gedemineraliseerd water (2 L) en poederbladeren (200 g) te mengen. Extractie werd 1 uur toegestaan door sonicatie bij kamertemperatuur met drie herhalingen. Whatman-filterpapiers werden gebruikt om waterfracties te filteren om onoplosbare materialen te verwijderen. Vervolgens werd het filtraat gecentrifugeerd (3.000g kracht, 18 °C, 25 min), en het supernatant werd verzameld. Het verzamelde supernatant werd spuitgefilterd, en het filtraat werd vriesgedroogd. Het vriesgedroogde materiaal werd opgelost in gedemineraliseerd water om een voorraadoplossing te creëren met een finale concentratie van 2% (w/v) voor de groene synthese beschreven in de volgende sectie.

Synthese van goudnanosferen met extract

Het nanosfeer-syntheseproces is geïllustreerd in Fig. 1a. De voorraadoplossing beschreven in de vorige sectie werd gebruikt voor synthese. In een glazen vial werd de extract (finale concentratie 0,03%) en chloorzuurgoud trihydraat (finale concentratie 0,5 mM) gemengd, en natriumhydroxide (finale concentratie 1 mM) werd toegevoegd. Gedemineraliseerd water werd toegevoegd om een finale volume van 2 mL te maken. Oven-incubatie werd uitgevoerd in een droge oven bij 80 °C gedurende 2 uur. De oppervlakte-plasmon-resonantie (SPR) van de nanosferen werd gemonitord door UV-zichtbare spectra over het bereik van 300~800 nm te verkrijgen. De nanosferen werden ook gebruikt als zaden voor de synthese van nanosterren beschreven in de volgende sectie.

Synthese van goudnanosterren

Het nanoster-syntheseproces is geïllustreerd in Fig. 2a. De nanosferen (50 µL) gesynthetiseerd zoals beschreven in de vorige sectie werden geroerd (750 toer/min) met een magnetische staaf op een warmplaat bij kamertemperatuur. Chloorzuurgoud trihydraat (0,25 mM, 5 mL) werd aan deze oplossing toegevoegd. Na 15 s werden twee oplossingen simultaan toegevoegd: zilvernitraat (1 mM, 50 µL) en ascorbijnzuur (vers bereid, 100 mM, 25 µL). Vervolgens werd het mengsel 5 minuten geroerd bij 750 toer/min. UV-zichtbare spectra werden verkregen over het bereik van 300~1100 nm.

Synthese van goudnanostaven

Het nanostaf-syntheseproces is geïllustreerd in Fig. 3a. Voor de synthese van goudnanostaven werd zaad-gemedieerde synthese uitgevoerd volgens een eerdere rapportage met kleine aanpassingen [27]. De groeioplossing werd als volgt bereid. In een 20 mL glazen vial werden chloorzuurgoud trihydraat (10 mM, 500 µL) en cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB, 100 mM, 9,5 mL) gemengd. De oplossing was geelbruin. Vervolgens werd ascorbijnzuur (vers bereid, 100 mM, 55 µL) toegevoegd, en deze oplossing werd geroerd totdat het van geelbruin naar kleurloos veranderde. Zilvernitraat (10 mM, 100 µL) werd toegevoegd en 10 s geschud. Deze finale oplossing werd een groeioplossing genoemd. De zaadoplossing werd als volgt gesynthetiseerd. In een 20 mL glazen vial werden chloorzuurgoud trihydraat (10 mM, 250 µL) en CTAB (100 mM, 9,75 mL) gemengd. Vervolgens werd ijs-koud, vers bereide natriumborohydride (10 mM, 600 µL) toegevoegd en 2 minuten gevorteld. De oplossing werd een zaadoplossing genoemd. De zaadoplossing (12 µL) werd gemengd met een eerder gesynthetiseerde groeioplossing. UV-zichtbare spectra werden verkregen over het bereik van 400~900 nm.

Chitosan-capping van nanosferen, nanosterren en nanostaven

Chitosan-capping werd toegepast om de colloidale stabiliteit en biocompatibiliteit van AuNPs te vergroten. Chitosan werd opgelost in 1% azijnzuur, en de finale concentratie werd aangepast tot 0,01%. Vervolgens werd sonicatie uitgevoerd om chitosan volledig op te lossen; deze oplossing werd gebruikt als een voorraadoplossing voor chitosan-capping in de volgende procedure. Zowel nanosferen als nanosterren die eerder waren gesynthetiseerd, werden gecapt met de chitosan-voorraadoplossing (0,01%). De chitosan-voorraadoplossing (30%, v/v) werd gemengd met de AuNP-oplossing (70%, v/v). Het mengsel werd 2 uur geroerd bij 900 toer/min om chitosan-capping te voltooien. Voor nanostaven werd overtollig CTAB gebruikt, en dus werd centrifugatie (14.000 toer/min, 15 min, 25 °C) uitgevoerd om CTAB te verwijderen. De nanostaven werden hersteld uit het pellet, en de chitosan-capping werd uitgevoerd zoals hierboven vermeld. Vervolgens werden UV-zichtbare spectra verkregen.

Beoordeling van colloidale stabiliteit

De colloidale stabiliteit van nanodeeltjes is een belangrijk aspect voor diagnostische en therapeutische toepassingen. Zes verschillende oplossingen werden getest voor colloidale stabiliteit: (i) gedemineraliseerd water, (ii) NaCl (5%), (iii) PBS (pH 7,4), (iv) BSA (5%), (v) DMEM, en (vi) vol medium. Het vol medium was DMEM met 10% foetale runderserum (FBS). Een milliliter van elk type AuNP-oplossing werd gemengd met de testoplossing zoals hierboven vermeld (0,5 mL). Het mengsel werd geïncuubeerd bij 25 °C gedurende 30 min, en UV-zichtbare spectra werden verkregen.

Celcultuur en cytotoxiciteit

De volgende kankercellijnen werden gekocht van de Korean Cell Line Bank (Seoul, Republiek Korea): AGS, HeLa, HepG2 en HT29. De MTT-assay werd uitgevoerd om de in vitro cytotoxiciteit van AuNPs te evalueren. DMEM met natriumpyruvaat werd gebruikt. Celcultuurmedium bevatte 10% foetale runderserum, 2 mM L-glutamine, 1% penicilline (100 eenheden/mL) en streptomycine (100 eenheden/mL). Cellen werden gekweekt in 100 mm cultuurschalen en onderhouden bij ongeveer 70% confluentie. Voor celcultuur werden de AuNPs van drie verschillende vormen onderworpen aan vacuümverdamping om een finale Au-concentratie van 5 mM te verkrijgen. Op 96-put plaatjes werden de cellen gezaaid met een dichtheid van 5,0 × 10³ cellen/put, en incubatie werd 24 uur uitgevoerd in een oven bij 37 °C onder een CO₂ (5%) atmosfeer. Vervolgens werden vijf verschillende concentraties van AuNPs (500 µM, 250 µM, 125 µM, 62,5 µM en 31,25 µM) behandeld en geïncuubeerd in de oven voor nog eens 24 uur bij 37 °C onder een CO₂ (5%) atmosfeer. Vervolgens werd MTT-reagens (5 µL, 5% in gedemineraliseerd water) toegevoegd en geïncuubeerd in een 37 °C oven onder een CO₂ (5%) atmosfeer voor een additionele 3 uur. De absorbantie werd gemeten bij 570 nm met een fluorescente multi-detectie-reader (Synergy HT, Bio Tek Instruments, Winooski, VT, VS). Onbehandelde cellen werden gebruikt als controle.

Cellulaire opname

De cellulaire opname van elk type AuNP werd kwantitatief gemeten met HepG2-cellen. Op 24-put plaatjes werden de cellen gezaaid met een dichtheid van 5,0 × 10⁴ cellen/put, en incubatie werd 24 uur uitgevoerd in een oven bij 37 °C onder een CO₂ (5%) atmosfeer. Vervolgens werd 5 µM (finale concentratie) van elk type AuNP-oplossing behandeld en geïncuubeerd in de oven voor een additionele 24 uur bij 37 °C onder een CO₂ (5%) atmosfeer. Na incubatie werd de oplossing met overtollige AuNPs verwijderd, en de cellen werden behandeld met trypsine. De Au-concentratie in de getrypsineerde cellen werd kwantitatief gemeten door ICP-OES en LA-ICP-MS, wat de concentratie van Au-opname in de cellen opleverde. De controle was 5 µM van de oorspronkelijke colloidale oplossing van elk type AuNP, wat ook geanalyseerd werd door ICP-OES en LA-ICP-MS om de Au-concentratie te verkrijgen.

Resultaten en discussie

UV-zichtbare spectra

UV-zichtbare spectra worden gemeenschappelijk verkregen om de synthese van AuNPs te bevestigen. De karakteristieke SPR van AuNPs kan waargenomen worden over het zichtbaar-nabij-infrarood golflengtebereik. Bovendien induceert het cappen van AuNPs doorgaans een bathochromische (of rode) of hypsochromische (of blauwe) verschuiving. Verder wordt een hypochrome verschuiving doorgaans geïnduceerd samen met rode en blauwe verschuivingen. Zoals getoond in Fig. 1b, werden UV-zichtbare spectra gemonitord over een bereik van 300~800 nm. Nanosferen toonden een karakteristieke SPR van 532 nm met een diepe bordeauxkleur. Na de chitosan-capping van nanosferen, werd de maximale SPR rood-verschuift naar 537 nm samen met een hypochrome verschuiving (Fig. 1b). Een wijd bereik van SPR-golflengtes (600~800 nm) met een donkerblauwe oplossing werden waargenomen voor de nanosterren (Fig. 2b). De chitosan-capping van de nanosterren toonde een hypochrome verschuiving, waarbij de absorbantie lager was dan die van AuNPs zonder chitosan-capping (Fig. 2b). Nanostaven toonden twee distincte SPR-golflengtes van 514 nm en 815 nm, met de vorming van een licht-roze oplossing (Fig. 3b). De chitosan-capping van nanostaven induceerde een blauwe verschuiving naar 797 nm samen met een hypochrome verschuiving (Fig. 3b). Overwegend al deze resultaten, veranderde het cappen van AuNPs met chitosan de SPR-golflengte en induceerde verschuivingen. Nauwkeurige examen van de UV-zichtbare spectra demonstreerde dat de drie typen AuNPs succesvol met chitosan waren gecapt.

Hydrodynamische grootte en zeta-potentialen

Vervolgens werden de hydrodynamische grootte en zeta-potentialen gemeten; de resultaten zijn getoond in Tabel 1. Zonder chitosan-capping waren de hydrodynamische groottes van nanosferen en nanosterren 28,4 en 97,8 nm, respectievelijk. De hydrodynamische grootte van de nanostaven werd niet gemeten omdat de hydrodynamische grootte goed was aangepast aan de sferische vormen van de nanodeeltjes. Met chitosan-capping nam de hydrodynamische grootte toe tot 190,7 nm voor nanosferen en tot 123,9 nm voor nanosterren. Chitosan-capping werd bevestigd door een toename in hydrodynamische grootte. De verandering in zeta-potentialen weerspiegelde ook chitosan-capping op het oppervlak van AuNPs. Chitosan is een positief geladen polysacharide; dus resulteerde chitosan-capping in positieve zeta-potentialen voor alle drie typen AuNPs. Voor de nanosferen werd het zeta-potentiaal gewijzigd van −12,73 tot 42,28 mV. Het zeta-potentiaal van de nanosterren werd gewijzigd van −42,46 tot 47,44 mV. In het geval van de nanostaven werd CTAB (een kationisch surfactant) gebruikt voor synthese. Dus was het oorspronkelijke zeta-potentiaal 27,96 mV zonder capping. De chitosan-capping van nanostaven verhoogde het zeta-potentiaal tot 33,23 mV. Daarom duidde de verandering in zeta-potentialen van negatieve naar positieve waarden voor de nanosferen en nanosterren duidelijk op succesvolle capping met chitosan. Verder nam het zeta-potentiaal van de nanostaven toe, wat suggereert dat het oppervlak met chitosan was gecapt.

HR-TEM-afbeeldingen

Microscopie is cruciaal voor nanodeeltjesonderzoek, wat essentiële informatie levert over de grootte en vorm van nanodeeltjes. Microscopie-tools leveren een reeks gedetailleerde informatie, zoals de dispersietoestand, twee- en driedimensionale morfologie en topografie, en relatieve zachtheid/hardheid van materialen. De nanosferen maakten 8,7 ± 1,7 nm, gebaseerd op het gemiddelde van 75 willekeurig geselecteerde discrete nanodeeltjes in HR-TEM-afbeeldingen (Fig. 4). De meest voorkomende grootte was 8~9 nm (29,3%), gevolgd door 9~10 nm (12,0%). Met chitosan-capping werd de vorm van de nanosferen behouden zonder enige vormverandering (Fig. 4c, d). De kristallijne aard van de deeltjes werd duidelijk aangegeven door de roosterstructuren getoond in Fig. 4d. De afstand tussen burende roosters werd gemeten op 0,24 nm (Fig. 4d). Bovendien werd de chitosan-laag ook gevisualiseerd, zoals aangegeven door de rode pijlen in Fig. 4d. Nanosterren werden gevisualiseerd door HR-TEM, zoals getoond in Fig. 5. De nanosterren maakten 99,0 ± 47,0 nm, wat het gemiddelde van 19 discrete nanodeeltjes vertegenwoordigt. De roosterstructuur wordt aangegeven in een vergrote afbeelding (Fig. 5c). Zoals getoond, werd de afstand tussen burende roosters gemeten op 0,24 nm (Fig. 5c). De rode pijlen in Fig. 5c duiden de chitosan-laag na capping aan. Nanostaven werden gevisualiseerd zoals getoond in Fig. 6. De gemiddelde deeltjeslengte en -breedte waren 60,4 nm en 16,4 nm, respectievelijk, volgens metingen voor 28 deeltjes. De aspectratio, gedefinieerd als deeltjeslengte gedeeld door deeltjesbreedte, was 3,7. De roosterstructuur wordt getoond in Fig. 6c, wat de kristallijne structuur van de nanostaven bevestigt. De afstand tussen burende roosters werd gemeten op 0,23 nm (Fig. 6c). De rode pijlen duiden de chitosan-laag aan (Fig. 6c).

FT-IR-spectra

Groene thee bevat diverse primaire en secundaire metabolieten. Specifiek zijn de hoofdbestanddelen van groene thee polyphenolen, waaronder epigallocatechine-3-gallate, (-)-epicatechine-3-gallate, (-)-epigallocatechine en (-)-epicatechine [28]. FT-IR-spectra werden verkregen om informatie te verkrijgen over functionele groepen die bijdroegen aan de synthese van AuNPs. We vergeleken het FT-IR-spectrum van nanosferen met het spectrum van de extract (Fig. 7). De belangrijkste functionele groep die meest waarschijnlijk betrokken was bij de reductiereactie van goudzouten was –OH. In de extract traden –OH-functionele groepen op bij 3255 cm⁻¹ (Fig. 7a). Bij synthese verschuifde deze piek naar een hogere golflengte bij 3300~3341 cm⁻¹. Dit resultaat demonstreerde dat –OH-functionele groepen afkomstig van polyphenolen geoxideerd werden tot C=O tijdens het reduceren van goudzouten tot AuNPs. Opvallend was het verschijnen van C=O-functionele groepen bij 1716 cm⁻¹ in nanosferen, wat de oxidatie van –OH-functionele groepen tijdens synthese duidelijk ondersteunde (Fig. 7b).

Beoordeling van colloidale stabiliteit onder verschillende oplossingen

De colloidale stabiliteit van nanodeeltjes is een belangrijk bezorg voor diagnostische en therapeutische toepassingen. Zes verschillende oplossingen werden getest voor colloidale stabiliteit: (i) gedemineraliseerd water, (ii) NaCl (5%), (iii) PBS (pH 7,4), (iv) BSA (5%), (v) DMEM, en (vi) vol medium (DMEM met 10% FBS). Na het mengen van elk type AuNPs met de testoplossing, werden UV-zichtbare spectra verkregen; de resultaten zijn getoond in Tabel 2 en Fig. 8. Een hypochrome verschuiving samen met een lichte rode of blauwe verschuiving werd waargenomen voor alle drie typen AuNPs in de UV-zichtbare spectra (Fig. 8a, c en e). De vorm van de spectra werd behouden, en geen aggregatie van de colloidale oplossing werd waargenomen (Fig. 8b, d en f). Dit resultaat demonstreerde dat de colloidale stabiliteit behoorlijk goed behouden werd in de bovengenoemde testoplossingen.

In Tabel 2 wordt de hypochrome verschuiving uitgedrukt als het percentage behouden absorbantie, met de absorbantie van de oorspronkelijke oplossing ingesteld op 100%. In alle drie AuNPs werd colloidale stabiliteit het best behouden in vol medium, dat gebruikt werd voor de daaropvolgende cytotoxiciteitsexperimenten: nanosferen (65,3%), nanosterren (93,4%) en nanostaven (80,2%). De eiwitoplossing, BSA (5%), leverde ook redelijke colloidale stabiliteit: nanosferen (61,8%), nanosterren (70,2%) en nanostaven (72,0%). Deze resultaten gaven aan dat de eiwitten die de nanodektjes bedekken, verdere gunstige effecten hebben op de colloidale stabiliteit van de AuNPs samen met de chitosan-capping. De colloidale stabiliteit van de nanosferen zonder chitosan-capping werd ook beoordeeld (Fig. 8g, h). Alle oplossingen induceerden een hypochrome verschuiving. Onder de geteste oplossingen toonde alleen de NaCl (5%)-oplossing een grote rode verschuiving samen met een hypochrome verschuiving.

Cytotoxiciteit

Een MTT-assay werd uitgevoerd om cytotoxiciteit te meten tegen vier kankerceltypen (Fig. 9): AGS, HeLa, HepG2 en HT29. De cytotoxiciteit van alle drie typen AuNPs was afhankelijk van de Au-concentratie. Onder de vier celtypen werd de hoogste cytotoxiciteit waargenomen voor HepG2-cellen. Verder toonden nanostaven de hoogste toxiciteit tegen de vier celtypen, gevolgd door nanosterren en tenslotte nanosferen. Specifiek toonden nanostaven een zeer hoge toxiciteit; dus werd de cytotoxiciteit van nanostaven met een laag bereik aan Au-concentraties ook geëvalueerd (Fig. 9e). Bij concentraties zo laag als 8 µM Au toonden nanostaven concentratie-afhankelijke cytotoxiciteit. Tegen HepG2-cellen was de IC₅₀-waarde 127,1 µM Au voor nanosferen, 81,8 µM Au voor nanosterren en 22,7 µM Au voor nanostaven. Dus waren nanostaven de meest cytotoxische, gevolgd door nanosterren, en nanosferen de minst cytotoxische tegen HepG2-cellen.

Er is gerapporteerd dat de cytotoxiciteit van AuNPs beïnvloed wordt door grootte, vorm en oppervlaktelading [29, 30]. Favi en medewerkers onderzochten de cytotoxiciteit van Au-nanosferen (61 nm) en Au-nanosterren (34 nm) tegen twee celtypen (humane huidfibroblasten en rat vetpad endotheelcellen) [31]. In beide celtypen werd een letale concentratie waargenomen bij 40 µg/mL voor nanosferen en bij 400 µg/mL voor nanosterren. Hun resultaten suggereerden dat nanosferen meer cytotoxisch waren dan nanosterren, wat suggereert dat grootte, vorm en oppervlaktechemie waarschijnlijk invloedrijk zijn op de cytotoxiciteit van AuNPs. Woźniak en medewerkers rapporteerden de cytotoxiciteit van AuNPs met diverse vormen tegen zowel HeLa als HEK293T (humane embryonale niercellen), namelijk nanosferen (~ 10 nm), nanoflowers (~ 370 nm), nanostaven (~ 41 nm), nanoprismen (~ 160 nm) en nanosterren (~ 240 nm) [30]. Interessant genoeg, nanosferen en nanostaven waren meer cytotoxisch dan nanoflowers, nanoprismen en nanosterren. De auteurs verklaarden dat de kleine grootte van de nanodeeltjes en het aggregatieproces de belangrijkste drijvende krachten waren voor de cytotoxiciteit van nanosferen en nanostaven in hun werk. Inderdaad hebben veel studies het grootte-effect van AuNPs op cytotoxiciteit behandeld [32, 33]. Naarmate AuNPs kleiner worden, neemt hun opname door cellen toe. Deze hogere opname resulteert in een hogere concentratie van AuNPs in de cel, wat leidt tot hogere cytotoxiciteit tegen cellen. Echter, een lage concentratie van AuNPs in de cel toont ook hoge cytotoxiciteit [34]. De concentratie van AuNPs in de cel beïnvloedt cytotoxiciteit; het is echter vitaal om de kenmerken van AuNPs te overwegen en te begrijpen. De cytotoxiciteit van AuNPs van twee verschillende vormen (nanosferen 43 nm, nanostaven 38 × 17 nm) werd geëvalueerd in epitheelecellen door Tarantola en medewerkers [35]. Nanosferen bleken meer cytotoxisch dan nanostaven. Bovendien induceerden nanosferen een dysfunctioneering in epitheelecelmembranen, wat gemeten werd door elektrische-cel-substraat-impedantie-sensing [35]. Zoals eerder besproken, onderzoeken veel studies momenteel de cytotoxiciteit van verschillende vormen van AuNPs in diverse cellen. Hoewel de vormen van AuNPs hetzelfde kunnen blijven, beïnvloeden veel factoren nog steeds de cytotoxiciteit van AuNPs. Bij het beoordelen van cytotoxiciteit moeten factoren zoals grootte, vorm, fysicochemische oppervlakte-eigenschappen, concentratie, blootstellingstijd en celtype ook worden overwogen [34, 36,37,38]. Naast de kenmerken van AuNPs zijn cytotoxische mechanismen waaronder ontwrichting van de celmembraan, oxidatieve stress, vernietiging van het cytoskelet en verlies van mitochondriale functie ook belangrijk [38, 39]. Momenteel zijn autofagie en lysosomale dysfunctionerend opkomende verklaringen voor de cytotoxiciteit van nanomaterialen [40]. In lysosomen induceren nanomaterialen cytotoxiciteit door lysosomale-ijzer-gemedieerde oxidatieve stress en de vrijgave van cathepsines en andere geassocieerde lysosomale hydrolasen, wat mitochondriale dysfunctionering en celdood veroorzaakt. In het huidige rapport waren nanostaven de meest cytotoxische tegen de vier geteste kankerceltypen. Dus zal ons toekomstige werk de gedetailleerde mechanismen van cytotoxiciteit onderzoeken.

Cellulaire opname op HepG2-cellen

HepG2-cellen toonden de hoogste cytotoxiciteit onder de vier kankerceltypen; dienovereenkomstig selecteerden we deze celtype voor het evalueren van cellulaire opname. Twee instrumenten, ICP-OES en LA-ICP-MS, werden gebruikt om de concentratie van Au in cellen kwantitatief te analyseren, en de resultaten zijn getoond in Fig. 10. Een Au-concentratie van 5 µM werd gebruikt voor het evalueren van cellulaire opname omdat geen toxiciteit werd waargenomen bij deze concentratie onder de vier kankerceltypen. De opname was het hoogst voor nanosferen (58,0%), gevolgd door nanostaven (52,7%) en nanosterren (41,5%). Zoals aangegeven in de vorige sectie, was de cytotoxiciteit afhankelijk van deeltjesvorm (nanostaven > nanosterren > nanosferen). Echter, de orde van cellulaire opname (nanosferen > nanostaven > nanosterren) matchte niet met de orde van cytotoxiciteit. De cellulaire opname van nanosferen was het hoogst; de cytotoxiciteit van deze deeltjes was echter het laagst. Deze resultaten suggereren dat hoge cellulaire opname niet altijd hoge cytotoxiciteit induceert. Zoals eerder vermeld, zijn diverse factoren waaronder grootte, vorm, fysicochemische oppervlakte-eigenschappen, concentratie, blootstellingstijd en celtype belangrijk bij het beïnvloeden van cytotoxiciteit.

De verschillende graden van opname van de drie typen AuNPs (41,5~58,0%) hangen waarschijnlijk af van de concurrentie tussen inwikkelen (d.w.z. hoe een membraan een nanodeeltje omsluit) onder een thermodynamische dryvende kracht en receptor-diffusie-kinetiek [41, 42]. Chithrani en Chan vergeleken de cellulaire opname van transferrine-gecapte Au-nanosferen en Au-nanostaven door HeLa-cellen [42]. Bij dezelfde grootte (d.w.z. dezelfde waarde voor de nanosfeer-diameter en nanostaf-breedte) toonden nanosferen hogere opname dan nanostaven. Dit resultaat is consistent met onze waarnemingen in het huidige rapport van hogere opname van nanosferen vergeleken met nanostaven. Voor nanostaf-opname is breedte belangrijker dan lengte, en een toenemende aspectratio verlaagt de opnamesnelheid [42]. De grootte van de nanosterren was 99,0 ± 47,0 nm, wat ze de grootste deeltjes maakt onder de drie typen AuNPs. Voor grote nanodeeltjes (> 50 nm) leiden trage receptor-diffusie-kinetiek tot korte inwikkelingstijden [42]. Dus is de cellulaire opname van grote nanodeeltjes laag, d.w.z. nanosterren in het huidige rapport. Chitosan werd gebruikt voor het cappen van de AuNPs om hun colloidale stabiliteit en biocompatibiliteit te vergroten. Chitosan-capping kan ook een rol spelen in de cellulaire opname van AuNPs door te interacteren met receptoren op het celoppervlak. Een gedetailleerde mechanistische studie is nodig om deze kwestie te verduidelijken.

Conclusie

De voortdurende ontwikkeling van nanotecnologie vereist uitgebreide vorm- en grootte-ontwerpen van nanodeeltjes voor succesvolle toepassingen, inclusief als medicijn-afgifte dragers of voertuigen voor biologisch actieve verbindingen zoals antikanker-middelen. Groene-thee-extract werd gebruikt als een groen reducerend middel voor de synthese van Au-nanosferen en nanosterren. Interessant genoeg was de cytotoxiciteit van nanostaven hoger dan die van nanosferen en nanosterren, terwijl nanosferen de laagste cytotoxiciteit toonden tegen vier typen kankercellen. Cellulaire opname door HepG2-cellen was waarschijnlijk afhankelijk van vorm en grootte; nanosferen toonden de hoogste opname door de cellen, terwijl nanosterren de laagste opname toonden. De optimalisatie van grootte en vorm samen met oppervlaktemodificatie en functionalisatie zal leiden tot de ontwikkeling van nanodeeltjes voor toekomstig gebruik in nanomedicine.

Afkortingen

AFM:

Atomische kracht microscopie

AgNPs:

Zilvernanodeeltjes

AGS:

Humane maagadenocarcinoomcellen

AuNPs:

Goudnanodeeltjes

CTAB:

Cetyltrimethylammoniumbromide

DLS:

Dynamische lichtverstrooiing

DMEM:

Dulbecco's modified Eagle's medium

FBS:

Foetale runderserum

FT-IR:

Fourier-transformatie infraroodspectroscopie

HeLa:

Humane epitheliale baarmoederhalsadenocarcinoomcellen

HepG2:

Humane hepatocellulaire carcinoomcellen

HR-TEM:

Hoge-resolutie transmissie elektronenmicroscopie

HT29:

Humane colorectal adenocarcinoomcellen

ICP-OES:

Geïnductief gekoppelde plasma optische emissiespectroscopie

LA-ICP-MS:

Laser-ablatie geïnductief gekoppelde plasma massa-spectrometrie

SEM:

Scanning elektronenmicroscopie

SPR:

Oppervlakte-plasmon-resonantie