Vormafhankelijke cytotoxiciteit en cellulaire opname van gouden nanodeeltjes gesynthetiseerd met behulp van groene thee-extract

Resultaten en discussie

UV-zichtbare spectra

UV-zichtbare spectra worden vaak verkregen om de synthese van AuNP's te bevestigen. De karakteristieke SPR van AuNP's kan worden waargenomen over het zichtbare-nabij-infrarode golflengtebereik. Bovendien induceert de capping van AuNP's in het algemeen een bathochrome (of rode) of een hypsochrome (of blauwe) verschuiving. Verder wordt in het algemeen een hypochrome verschuiving samen met rood- en blauwverschuivingen geïnduceerd. Zoals weergegeven in figuur 1b, werden UV-zichtbare spectra gevolgd over een bereik van 300 ~ 800 nm. Nanosferen vertoonden een karakteristieke SPR van 532 nm met een diepe bordeauxrode kleur. Na de chitosan-capping van nanosferen werd de maximale SPR rood verschoven naar 537 nm samen met een hypochrome verschuiving (figuur 1b). Een breed scala aan SPR-golflengten (600 ~ 800 nm) met een donkerblauwe oplossing werd waargenomen voor de nanosterren (figuur 2b). De chitosan-capping van de nanosterren vertoonde een hypochrome verschuiving, waarbij de absorptie lager was dan die van AuNP's zonder chitosan-capping (figuur 2b). Nanostaafjes vertoonden twee verschillende SPR-golflengten van 514 nm en 815 nm, met de vorming van een lichtroze oplossing (figuur 3b). De chitosan-capping van nanostaafjes induceerde een blauwverschuiving naar 797 nm samen met een hypochrome verschuiving (figuur 3b). Gezien al deze resultaten, veranderde het afdekken van AuNP's met chitosan de SPR-golflengte en veroorzaakte het verschuivingen. Zorgvuldig onderzoek van de UV-zichtbare spectra toonde aan dat de drie typen AuNP's met succes werden afgedekt met chitosan.

Hydrodynamische grootte en zeta-potentialen

Vervolgens werden de hydrodynamische grootte en zeta-potentialen gemeten; de resultaten worden weergegeven in tabel 1. Zonder chitosan-capping waren de hydrodynamische afmetingen van nanosferen en nanosterren respectievelijk 28,4 en 97,8 nm. De hydrodynamische grootte van de nanostaafjes werd niet gemeten omdat de hydrodynamische grootte goed was aangepast aan de bolvorm van de nanodeeltjes. Met chitosan-capping werd de hydrodynamische grootte verhoogd tot 190,7 nm voor nanosferen en tot 123,9 nm voor nanosterren. Chitosan capping werd bevestigd door een toename in hydrodynamische grootte. De verandering in zeta-potentialen weerspiegelde ook chitosan-afdekking op het oppervlak van AuNP's. Chitosan is een positief geladen polysacharide; dus chitosan-capping resulteerde in positieve zeta-potentialen voor alle drie soorten AuNP's. Voor de nanosferen was de zeta-potentiaal gewijzigd van -12,73 tot 42,28 mV. Het zeta-potentieel van de nanosterren werd gewijzigd van -42,46 in 47,44 nm. In het geval van de nanostaafjes werd CTAB (een kationische oppervlakteactieve stof) gebruikt voor de synthese. De oorspronkelijke zeta-potentiaal was dus 27,96 mV zonder aftopping. De chitosan-capping van nanostaafjes verhoogde het zeta-potentieel tot 33,23 nm. Daarom duidde de verandering in zeta-potentialen van negatieve naar positieve waarden voor de nanosferen en nanosterren duidelijk op succesvolle capping met chitosan. Bovendien nam het zeta-potentieel van de nanostaafjes toe, wat suggereert dat het oppervlak was afgedekt met chitosan.

HR-TEM-afbeeldingen

Microscopie is cruciaal voor nanodeeltjesonderzoek en levert essentiële informatie over de grootte en vorm van nanodeeltjes. Microscopietools leveren een reeks gedetailleerde informatie, zoals de dispersietoestand, twee- en driedimensionale morfologie en topografie, en relatieve zachtheid/hardheid van materialen. De nanosferen maten 8,7 ± 1,7 nm, gebaseerd op het gemiddelde van 75 willekeurig geselecteerde discrete nanodeeltjes in HR-TEM-afbeeldingen (Fig. 4). De meest voorkomende grootte was 8~9 nm (29,3%), gevolgd door 9~10 nm (12,0 %). Met chitosan-afdekking werd de vorm van de nanosferen behouden zonder enige vormverandering (figuur 4c, d). De kristallijne aard van de deeltjes werd duidelijk aangegeven door de roosterstructuren getoond in figuur 4d. De afstand tussen aangrenzende roosters werd gemeten als 0,24 nm (figuur 4d). Verder werd ook de chitosanlaag gevisualiseerd, zoals aangegeven door de rode pijlen in figuur 4d. Nanosterren werden gevisualiseerd door HR-TEM, zoals weergegeven in figuur 5. De nanosterren maten 99,0 ±   47.0 nm, wat het gemiddelde van 19 discrete nanodeeltjes vertegenwoordigt. De roosterstructuur wordt aangegeven in een vergroot beeld (Fig. 5c). Zoals weergegeven, werd de afstand tussen aangrenzende roosters gemeten als 0,24 nm (figuur 5c). De rode pijlen in Fig. 5c geven de chitosanlaag aan. Nanostaafjes werden gevisualiseerd zoals weergegeven in Fig. 6. De gemiddelde deeltjeslengte en -breedte waren respectievelijk 60,4 nm en 16,4 nm, volgens metingen gedaan voor 28 deeltjes. De aspectverhouding, gedefinieerd als deeltjeslengte gedeeld door deeltjesbreedte, was 3,7. De roosterstructuur wordt getoond in Fig. 6c, wat de kristallijne structuur van de nanostaafjes bevestigt. De afstand tussen aangrenzende roosters werd gemeten als 0,23 nm (figuur 6c). De rode pijlen geven de chitosanlaag aan (Fig. 6c).

HR-TEM-beelden van gouden nanosferen. De schaalbalken vertegenwoordigen a 5 nm, b 20 nm, c 20 nm, en d 5 nm. Afbeeldingen a en b werden verkregen zonder chitosan-capping, en c en d werden verkregen met chitosan-afdekking. De afstand tussen aangrenzende roosters werd gemeten als 0,24 nm. Rode pijlen geven de chitosan-laag aan na het afdekken

HR-TEM-beelden van gouden nanosterren. De schaalbalken vertegenwoordigen a 200 nm, b 50 nm en c 5 nm. d Een schematische weergave van nanosterren met een gemiddelde grootte van 99,0 ± 47,0 nm. Afbeelding a werd verkregen zonder chitosan-capping, en b en c werden verkregen met chitosan-afdekking. De afstand tussen aangrenzende roosters werd gemeten als 0,24 nm. Rode pijlen geven de chitosan-laag aan na het afdekken

HR-TEM-beelden van gouden nanostaafjes. De schaalbalken vertegenwoordigen a 100 nm, b 200 nm en c 5 nm. d Een schematische weergave van nanostaafjes met een gemiddelde lengte en breedte van respectievelijk 60,4 nm en 16,4 nm. Afbeelding a werd verkregen zonder chitosan-capping, en b en c werden verkregen met chitosan-afdekking. De afstand tussen aangrenzende roosters werd gemeten als 0,23 nm. Rode pijlen geven de chitosan-laag aan na het afdekken

FT-IR-spectra

Groene thee bevat diverse primaire en secundaire metabolieten. De belangrijkste bestanddelen van groene thee zijn polyfenolen, waaronder epigallocatechin-3-gallate, (-)-epicatechin-3-gallate, (-)-epigallocatechine en (-)-epicatechin [28]. FT-IR-spectra werden verkregen om informatie te verkrijgen over functionele groepen die hebben bijgedragen aan de synthese van AuNP's. We vergeleken het FT-IR-spectrum van nanosferen met het spectrum van het extract (Fig. 7). De belangrijkste functionele groep die hoogstwaarschijnlijk betrokken was bij de reductiereactie van Au-zouten was -OH. In het extract verschenen –OH functionele groepen bij 3255 cm ⁻¹ (Fig. 7a). Na synthese werd deze piek verschoven naar een hoger golfgetal bij 3300~3341 cm ⁻¹ . Dit resultaat toonde aan dat -OH-functionele groepen afkomstig zijn van polyfenolen die zijn geoxideerd tot C =O terwijl Au-zouten worden gereduceerd tot AuNP's. Opmerkelijk is dat het uiterlijk van C=O functionele groepen op 1716 cm ⁻¹ in nanosferen ondersteunde duidelijk de oxidatie van -OH-functionele groepen tijdens synthese (Fig. 7b).

FT-IR-spectra van a groene thee-extract gebruikt voor synthese en b gouden nanobolletjes

Beoordeling van colloïdale stabiliteit onder verschillende oplossingen

De colloïdale stabiliteit van nanodeeltjes is een belangrijk aandachtspunt voor diagnostische en therapeutische toepassingen. Zes verschillende oplossingen werden getest op colloïdale stabiliteit:(i) gedeïoniseerd water, (ii) NaCl (5 %), (iii) PBS (pH 7,4), (iv) BSA (5 %), (v) DMEM en (vi ) vol medium (DMEM met 10% FBS). Na het mengen van elk type AuNP's met de testoplossing, werden UV-zichtbare spectra verkregen; de resultaten worden getoond in Tabel 2 en Fig. 8. Een hypochrome verschuiving samen met een lichte rode of blauwe verschuiving werd waargenomen voor alle drie typen AuNP's in de UV-zichtbare spectra (Fig. 8a, c en e). De vorm van de spectra bleef behouden en er werd geen aggregatie van de colloïdale oplossing waargenomen (Fig. 8b, d en f). Dit resultaat toonde aan dat de colloïdale stabiliteit vrij goed behouden bleef in de bovengenoemde testoplossingen.

Beoordeling van colloïdale stabiliteit. een en b nanobolletjes met chitosan-capping, c en d nanosterren met chitosan-topping, e en f nanostaafjes met chitosan-topping, g en h nanosferen zonder chitosan-capping. DW staat voor gedeïoniseerd water

In tabel 2 wordt de hypochrome verschuiving uitgedrukt als het percentage behouden absorptie, waarbij de absorptie van de oorspronkelijke oplossing is ingesteld op 100 %. In alle drie de AuNP's werd de colloïdale stabiliteit het best behouden in volledig medium, dat werd gebruikt voor de daaropvolgende cytotoxiciteitsexperimenten:nanosferen (65,3%), nanosterren (93,4%) en nanostaafjes (80,2%). De eiwitoplossing, BSA (5 %), bood ook een redelijke colloïdale stabiliteit:nanosferen (61,8 %), nanosterren (70,2 %), en nanostaafjes (72,0 %). Deze resultaten gaven aan dat de eiwitten die de nanodeeltjes bedekken, samen met de chitosan-capping verdere gunstige effecten hebben op de colloïdale stabiliteit van de AuNP's. De colloïdale stabiliteit van de nanosferen zonder chitosan-capping werd ook beoordeeld (Fig. 8g, h). Alle oplossingen veroorzaakten een hypochrome verschuiving. Van de geteste oplossingen vertoonde alleen de NaCl-oplossing (5%) een grote roodverschuiving samen met een hypochrome verschuiving.

Cytotoxiciteit

Er werd een MTT-assay uitgevoerd om de cytotoxiciteit te meten tegen vier soorten kankercellen (Fig. 9):AGS, HeLa, HepG2 en HT29. The cytotoxicity of all three types of AuNPs was dependent on the Au concentration. Among the four cell types, the highest cytotoxicity was observed for HepG2 cells. Furthermore, nanorods showed the highest toxicity against the four cell types, followed by nanostars and finally by nanospheres. Specifically, nanorods showed a very high toxicity; thus, the cytotoxicity of nanorods containing a low range of Au concentrations was also evaluated (Fig. 9e). At concentrations as low as 8 μM Au, nanorods showed concentration-dependent cytotoxicity. Against HepG2 cells, the IC₅₀ value was 127.1 μM Au for nanospheres, 81.8 μM Au for nanostars, and 22.7 μM Au for nanorods. Thus, nanorods were the most cytotoxic, followed by nanostars, and nanospheres were the least cytotoxic against HepG2 cells.

Cytotoxicity assessed by MTT assay (31.25~500 μM Au concentration). een AGS, b HeLa, c HepG2, and d HT29. e Low Au concentrations (8~125 μM) were evaluated on HepG2 cells

It has been reported that the cytotoxicity of AuNPs is affected by size, shape, and surface charge [29, 30]. Favi and co-workers investigated the cytotoxicity of Au nanospheres (61 nm) and Au nanostars (34 nm) against two types of cells (human skin fibroblasts and rat fat pad endothelial cells) [31]. In both cell types, a lethal concentration was observed at 40 μg/mL for nanospheres and at 400 μg/mL for nanostars. Their results suggested that nanospheres were more cytotoxic than nanostars, suggesting that size, shape, and surface chemistry are most likely influential to the cytotoxicity of AuNPs. Woźniak and co-workers reported the cytotoxicity of AuNPs with diverse shapes against both HeLa and HEK293T (human embryonic kidney cells), namely, nanospheres (~ 10 nm), nanoflowers (~ 370 nm), nanorods (~ 41 nm), nanoprisms (~ 160 nm), and nanostars (~ 240 nm) [30]. Interestingly, nanospheres and nanorods were more cytotoxic than nanoflowers, nanoprisms, and nanostars. The authors explained that the small size of the nanoparticles and the aggregation process were the main driving forces for the cytotoxicity of nanospheres and nanorods in their work. Indeed, many studies have addressed the size effect of AuNPs on cytotoxicity [32, 33]. As AuNPs become smaller, their uptake by cells increases. This higher uptake results in a higher concentration of AuNPs in the cell, which leads to higher cytotoxicity against cells. However, a low concentration of AuNPs in the cell also shows high cytotoxicity [34]. The concentration of AuNPs in the cell affects cytotoxicity; however, it is vital to consider and understand the characteristics of AuNPs. The cytotoxicity of AuNPs of two different shapes (nanospheres 43 nm, nanorods 38 × 17 nm) was evaluated in epithelial cells by Tarantola and co-workers [35]. Nanospheres were determined to be more cytotoxic than nanorods. Furthermore, nanospheres induced a dysfunction in epithelial cell membranes, which was measured by electric-cell substrate impedance sensing [35]. As previously discussed, many studies are currently investigating the cytotoxicity of different shapes of AuNPs in various cells. Although the shapes of AuNPs may remain the same, many factors still affect the cytotoxicity of AuNPs. When assessing cytotoxicity, factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type should also be considered [34, 36,37,38]. In addition to the characteristics of AuNPs, cytotoxic mechanisms including disruption of the cell membrane, oxidative stress, destruction of the cytoskeleton, and loss of mitochondrial function are also important [38, 39]. Currently, autophagy and lysosomal dysfunction are emerging as explanations of the cytotoxicity of nanomaterials [40]. In lysosomes, nanomaterials induce cytotoxicity by lysosomal-iron-mediated oxidative stress and the release of cathepsins and other associated lysosomal hydrolases, which causes mitochondrial dysfunction and cell death. In the current report, nanorods were the most cytotoxic against the four types of cancer cells tested. Thus, our future work will examine the detailed mechanisms of cytotoxicity.

Cellular uptake on HepG2 cells

HepG2 cells showed the highest cytotoxicity among the four types of cancer cells; accordingly, we selected this cell type for evaluating cellular uptake. Two instruments, ICP-OES and LA-ICP-MS, were used to quantitatively analyze the concentration of Au in cells, and the results are shown in Fig. 10. A Au concentration of 5 μM was used for evaluating cellular uptake because no toxicity was observed at this concentration among the four types of cancer cells. The uptake was the highest for nanospheres (58.0 %), followed by nanorods (52.7 %) and nanostars (41.5 %). As indicated in the previous section, the cytotoxicity was dependent on particle shape (nanorods> nanostars> nanospheres). However, the order of cellular uptake (nanospheres> nanorods> nanostars) did not match the order of cytotoxicity. The cellular uptake of nanospheres was the highest; however, the cytotoxicity of these particles was the lowest. These results suggest that high cellular uptake does not always induce high cytotoxicity. As mentioned previously, diverse factors including size, shape, physicochemical surface properties, concentration, exposure time, and cell type are important in influencing cytotoxicity.

Cellular uptake by HepG2 cells

The different degrees of uptake of the three types of AuNPs (41.5~58.0 %) possibly depend on the competition between wrapping (i.e., how a membrane encloses a nanoparticle) under a thermodynamic driving force and receptor diffusion kinetics [41, 42]. Chithrani and Chan compared the cellular uptake of transferrin-coated Au nanospheres and Au nanorods by HeLa cells [42]. At the same size (i.e., the same value for the nanosphere diameter and nanorod width), nanospheres showed higher uptake than did nanorods. This result is consistent with our observations in the current report of higher uptake of nanospheres compared with nanorods. For nanorod uptake, width is more important than length, and an increasing aspect ratio decreases the uptake rate [42]. The size of the nanostars was 99.0 ± 47.0 nm, making them the largest particles among the three types of AuNPs. For large nanoparticles (> 50 nm), slow receptor diffusion kinetics lead to short wrapping times [42]. Thus, the cellular uptake of large nanoparticles is low, i.e., nanostars in the current report. Chitosan was used for capping the AuNPs to increase their colloidal stability and biocompatibility. Chitosan capping can also play a role in the cellular uptake of AuNPs by interacting with receptors on the cell surface. A detailed mechanistic study is necessary to elucidate this issue.