Kinetiek en specificiteit van HEK293T extracellulaire vesikelopname met behulp van Imaging Flow Cytometry

Resultaten

CD63-eGFP–Tagged HEK293T Extracellulaire Vesicle-eigenschappen

Om fluorescent gelabelde EV's te genereren voor het analyseren van de kinetiek en opname van extracellulaire blaasjes, werden HEK293T-cellen getransfecteerd met een plasmide dat CD63-eGFP-fusie-eiwit draagt. CD63 is een tetraspanine-eiwit dat gewoonlijk is verrijkt in het membraan van exosomen, waardoor het een optimaal doelwit is voor EV-fluorescerende tagging [46, 47]. Gebruikte media werden verzameld uit HEK293T-celkweek en EV's werden geïsoleerd zoals eerder gemeld [8]. We vergeleken de grootte en distributie van EV's geïsoleerd uit CD63-eGFP-getransfecteerde HEK293T-cellen met niet-getransfecteerde HEK293T-cellen. Controle en CD63-eGFP-getransfecteerde HEK293T EV's vertoonden een gemiddelde mediane diameter van respectievelijk 110,28 nm en 103,616 nm, zoals gemeten door nanotracking-software (Fig. 1a), wat consistent is met de gerapporteerde grootte van HEK293T EV's [13, 15, 27 , 48]. Geen significante verschillen in mediane diameter (p = 0.1615) en distributie (p =-0,4225) van EV's geïsoleerd uit niet-getransfecteerde en CD63-eGFP-getransfecteerde HEK293T-cellen werden waargenomen. eGFP-labeling veranderde de grootte van HEK293T EV's niet (Fig. 1b).

Karakterisering van HEK293T EV's gelabeld met CD63-eGFP. EV's werden geïsoleerd uit HEK293T (controle) en HEK293T die CD63-eGFP-celkweekmedia tot expressie brengen. een Representatieve EV-grootteverdeling vastgelegd via nanotracking-software. b Kwantificering van de gemiddelde diameterverdeling van getransfecteerde versus niet-getransfecteerde HEK293T EV's. c IFC-afbeeldingen van negatieve controleparels, HEK293T-controle-EV's en CD63-eGFP-gelabelde EV's. BF betekent helder veld, GFP betekent groen fluorescerend eiwit (488 nm excitatielaser) en SSC betekent zijverstrooiing. Positieve eGFP in GFP-kanaal betekent fluorescerende HEK293T EV's. d Op flowcytometrie gebaseerde MACSPlex-oppervlaktemarkerexpressie van niet-getransfecteerde HEK293T EV's en HEK293T CD63-eGFP EV's. Beide EV-bronnen zijn positief voor CD29, CD9, CD63 en CD81, gemeten in relatieve fluorescentie (aangegeven met X voor positief). Staven vertegenwoordigen gemiddelde  ± SEM; N = 3; ongepaarde T-test. NS. betekent p> 0,05

IFC-assay werd uitgevoerd om te bepalen of de CD63-eGFP was geassocieerd met EV's. Als een fluorescerende negatieve controle misten 1,34  μM-korrels in bufferoplossing (Fig. 1 c, boven) fluorescentie bij blootstelling aan de excitatiegolflengte van 488 nm, maar waren zichtbaar in helder veld (BF) en zijverstrooiing (SSC). Niet-gelabelde HEK293T EV's waren negatief in de BF, GFP en SSC, wat wijst op een kleine omvang onder de BF-drempel en gebrek aan fluorescentie (figuur 1d, midden). De afwezigheid in BF betekent een EV-grootte die kleiner is dan 300 nm, wat wijst op een minimale zwerm EV's. Ten slotte zijn CD63-eGFP-gelabelde EV's negatief in BF en positief in het GFP-kanaal, wat wijst op positieve fluorescentie van de HEK293T EV's (Fig. 1c, onderaan). Het positieve signaal in het GFP-kanaal kan indicatief zijn voor een enkele EV of een groep fluorescerende EV's. Gezamenlijk laten deze resultaten zien dat de geïsoleerde HEK293T EV's standaardgrootte- en eiwitmarkerprofielen hebben die consistent zijn met eerdere rapporten van HEK293T-exosomen, en eGFP-labeling verandert de grootte van HEK293T EV's niet [5, 27].

Met behulp van een in de handel verkrijgbare op flowcytometrie gebaseerde methode om veelvoorkomende EV-markers te meten, hebben we het algehele EV-tetraspanineprofiel bepaald [5]. Geïsoleerde HEK293T EV's van controle en CD63-eGFP tot expressie brengende HEK293T-cellen waren positief voor standaard EV-markers, waaronder CD9, CD63 en CD81, zoals gemeten in relatieve fluorescentie-eenheden (figuur 1d). Zoals eerder gemeld, werd CD29 ook gevonden op het oppervlak van HEK293T EV's en CD63-eGFP-getransfecteerde HEK293T EV's [5]. Deze resultaten geven aan dat de isolatie- en tagging-methoden voor HEK293T EV resulteren in EV's met gemeenschappelijke HEK293T exosoommarkers.

Actieve opname van HEK293T EV's

Er werden twee remmende internalisatie-assays uitgevoerd. HEK293T EV's werden samen gekweekt met ontvangende cellen bij 4 ° C (koud) of met ontvangende cellen die eerder waren gefixeerd met paraformaldehyde (gefixeerd). De behandelingen verminderden de aanwezigheid van eGFP-gelabelde EV's in de ontvangende cellen in vergelijking met ontvangende cellen die samen met EV's waren gekweekt onder fysiologische omstandigheden (Fig. 2a). Koude en vaste remmende testen verminderden het aantal vlekken (koud:p = 0.0127, vast:p = 0,0078), intensiteit (koud:p = 0.0105, vast:p = 0.0374) en maximale pixel (koud:p = 0.0159, vast:p = 0,0149) van fluorescentiesignalen in ontvangende cellen zonder behandelingen, wat wijst op remming van EV-opname. Deze resultaten leiden af ​​dat eGFP-lokalisatie en verhogingen van outputparameters betekenen dat HEK293T EV's worden geïnternaliseerd voor de volgende opnametests.

EV internalisatie remmingstesten. HEK293T-cellen werden onder verschillende omstandigheden samen gekweekt met HEK293T EV's. Controle (37°C) verwijst naar co-cultuur in een fysiologische omgeving van 37°C. Koud verwijst naar co-cultuur in een omgeving van 4 °C. Vaste remming verwijst naar een test waarbij ontvangende cellen voorafgaand aan co-kweek PFA werden gefixeerd. een Representatieve IFC-beelden van ontvangende cellen. Kolom 1, BF, betekent helder veld. Kolom 2, GFP, betekent groen fluorescerend eiwit (488 nm excitatielaser) en kolom 3 betekent een samenvoeging van BF en GFP. Controle toont positieve GFP die EV-internalisatie vertegenwoordigt. b –d Kwantificering van remmingsassays in vergelijking met controles via spottelling, gemiddelde fluorescentie-intensiteit en maximale pixel. Staven vertegenwoordigen gemiddelde  ± SEM; N = 3; one-way ANOVA gevolgd met Tukey's post hoc test vergeleken met controle. *p < 0,05; ***p < 0.01

Dosisafhankelijke HEK293T EV-opname

Om een ​​standaarddosiscurve voor het IFC-platform te ontwikkelen, werden HEK293T EV's samen gekweekt met HEK293T-ontvangercellen in toenemende doses variërend van 0 tot 20.000 EV's per cel bij 37 ° C. Representatieve IFC-afbeeldingen vertoonden een visuele toename van eGFP-fluorescentie met verhoogde doses EV's (figuur 3a). Het laagste aantal EV's dat kon worden gedetecteerd, was 6000 EV's per samengekweekte HEK293T-cel. Op dit niveau telt het aantal spots (p = 0,0012), intensiteit (p = 0.0075), en maximale pixel (p =-0,0005) metingen waren significant groter dan ontvangende cellen zonder EV's (Fig. 3b-d). Daarom zijn doses van 6000 HEK293T EV's de lage drempel voor opname in onze experimentele toestand. Evenzo hadden doses van 10.000 en 20.000 EV's een hoger aantal spots (10.000:p = 0,0009; 20.000:p < 0.0001), intensiteit (10.000:p < 0.0001; 20.000:p < 0.0001) en maximale pixel (10.000:p < 0.0001; 20.000:p < 0,0001) vergeleken met cellen zonder EV's. In vergelijking met de hogere doses zijn er geen significante verschillen in het aantal vlekken (6000 vs. 10.000:p = 0,999, 10.000 vs. 20.000:p = 0,0927), intensiteit (6000 vs. 10.000:p = 0,8482, 10.000 vs. 20.000:p = 0,999), en maximaal aantal pixels (6000 vs. 10.000:p = 0,6056, 10.000 versus 20.000:p = 0,5281) tussen 6000 en 10.000, samen met 10.000 versus 20.000. Evenzo is er bij een vergelijking tussen 6000 en 20.000 geen statistisch verschil in aantal spots (p = 0.0787) en intensiteit (p = 0,8083). Er is een significant verschil in maximale pixel tussen 6000 en 20.000 (p = 0,0140). Over het algemeen vertoont de opbrengstcurve een significante dosisafhankelijkheid in alle parameters (spot, intensiteit, max pixel, p < 0,0001). Deze resultaten geven aan dat de opname van HEK293T EV dosisafhankelijk is met een minimumdrempel van 6000 HEK293T EV's per cel.

HEK293T EV-opname heeft een dosiseffect met een minimumdrempel van 6000 EV's. HEK293T-cellen werden samen gekweekt met HEK293T EVS in toenemende doses van 0 tot 20.000/cel. een Representatieve IFC-beelden van ontvangende cellen met respectieve EV-doses. GFP-lokalisatie betekent HEK293T EV-opname. b –d Kwantificering van dosisassays vergeleken met controles en elke groep via het aantal vlekken, gemiddelde fluorescentie-intensiteit en maximale pixelverhoudingen. Staven vertegenwoordigen gemiddelde  ± SEM; N = 3; eenrichtings-ANOVA volgde met de post-hoctest van Tukey. *p < 0,05; ***p < 0.01

HEK293T EV tijdelijke opname

Met behulp van 6000 EV's per cel werden HEK293T EV's samen met HEK293T-cellen gekweekt voor toenemende tijdsduur voorafgaand aan IFC, variërend van 5 min tot 24 h. De lengte van de EV-blootstelling speelde een sleutelrol in de hoeveelheid zichtbare fluorescentie in de ontvangende cellen, die na 12 h afnam (figuur 4a). Aanvankelijk vertoonde 30 min co-cultuur een significante toename van het aantal spots (p = 0,0081) wat een mogelijke trend naar EV-opname suggereert, maar niet in andere opnameparameters (intensiteit:p = 0.3073, max pixel:p = 0.0952) (Fig. 4b-d). Bij 2  uur co-cultuur, aanzienlijk hoger aantal vlekken (p = 0,0028), intensiteit (p = 0.0420), en maximale pixel (p = 0,0006) werden geregistreerd in vergelijking met de ontvangende cellen zonder EV's. Nogmaals, bij 4 uur co-cultuur waren alle parameters groter dan de controles (aantal vlekken:p = 0.0003, intensiteit:p < 0.0001, max pixel:p < 0,0001). Intensiteit en maximale pixel bleven hoger dan controles bij 4, 12 en 24 h co-cultuur. Er waren geen verschillen in opnameparameters tussen 4  en 12  uur co-cultuur (spot:p = 0.999, intensiteit:p = 0,5797; maximale pixel:p = 0,2489). Echter, intensiteit (p = 0.0191) en maximale pixel (p =-0, 0027) nam af tussen 12 en 24  h van co-cultuur (Fig. 4 c, d). Net als de dosiscurve is de HEK293T EV-opname tijdsafhankelijk met een consistente EV-opname bij 4 uur incubatie en een piek bij 12 uur. Gezamenlijk is een dosis van 6000 EV's per gezaaide cel en een co-cultuur van 4 h gestandaardiseerd voor de volgende opname-assays.

HEK293T EV-opname is tijdsafhankelijk. HEK293T-cellen werden gedurende langere tijd samen gekweekt met 6000 HEK293T EV's/cel. een Representatieve IFC-afbeeldingen van respectievelijk ontvangende cellen. GFP-lokalisatie betekent verhoogde opname van HEK293T EV. b –d Kwantificering van tijdsverloop-assays vergeleken met controles en elke groep via spottelling, gemiddelde fluorescentie-intensiteit en maximale pixelverhoudingen. Staven vertegenwoordigen gemiddelde  ± SEM; N = 3; eenrichtings-ANOVA volgde met de post-hoctest van Tukey. *p < 0,05; ***p < 0.01

Vergelijkende opname van HEK293T EV's door meerdere cellijnen

De hypothese dat EV-opname een selectief proces is waarbij EV's bij voorkeur worden opgenomen door cellen van hun eigen oorsprong, werd getest met behulp van IFC. HEK293T EV's werden samen gekweekt met HEK293T-cellen of andere cellijnen:epitheel (C3A-levercellen), endotheel (menselijke endotheelcellen van de navelstrengader) en neurale (SH-SY5Y-glioblastoomcellen). eGFP-fluorescentie is overvloediger in HEK293T-cellen in vergelijking met de andere celtypen (Fig. 5a). Vergeleken met C3A en HUVEC's hadden HEK293T-cellen een significant hogere fluorescentie-intensiteit (C3A:p = 0.0321; HUVEC:p =-0,0055) (Fig. 5c), wanneer ze samen worden gekweekt met HEK293T EV's. Bovendien hadden HEK293T-cellen een hogere maximale pixel (C3A:p = 0,0221; HUVEC:p = 0,0079; SH-SY5Y:p =-0,0486) (Fig. 5d) in vergelijking met alle andere ontvangende cellijnen (Fig. 5b). Wat de intensiteit betreft, waren SH-SY5Y-cellen significant hoger dan HUVEC's wanneer ze samen werden gekweekt met HEK293T EV's (p = 0.0304). Deze resultaten ondersteunen de selectieve opname van HEK293T EV door HEK293T-cellen in vergelijking met andere cellijnen in vitro.

HEK293T EV's vertonen opnamevoorkeur voor HEK293T-cellen. HEK293T EV's werden samen gekweekt met HEK293T-cellen, C3A-epitheelcellen, humane navelstrengendotheelcellen (HUVEC) en SY5Y neurale cellen. een Representatieve IFC-beelden van ontvangende cellen die samen zijn gekweekt met HEK293T EV's. b –d Kwantificering van EV-opnamevoorkeursassays vergeleken met controles en elkaar via spottelling, gemiddelde fluorescentie-intensiteit en maximale pixelverhoudingen. Staven vertegenwoordigen gemiddelde  ± SEM; N = 3; eenrichtings-ANOVA volgde met de post-hoctest van Tukey. *p < 0,05; ***p < 0.01

Differentiatiestatus van neurale cellen en HEK293T EV internalisatie

Omdat EV's zijn betrokken voor therapeutische en afleveringsdoeleinden gericht op neurale ziekten, werden menselijke neurale stamcellen (hNSC's) en volwassen menselijke neuronen gebruikt als ontvangende cellijnen in ons systeem om te onderzoeken of de differentiatiestatus van de ontvangende cel een rol speelt bij selectieve opname van EV's. Representatieve afbeeldingen van IFC vertoonden visueel bewijs van opname in beide celtypen, maar met de grootste eGFP-lokalisatie in hNSC's (Fig. 6a). hNSC's die samen met HEK293T EV's zijn gekweekt, hebben een hoger aantal spots (p = 0,0082) en max. pixel (p = 0,0083) in vergelijking met volwassen neuronen. Samen suggereren deze resultaten dat de differentiatiestatus van neurale cellen de opname van HEK293T EV's beïnvloedt.

Neurale differentiatiestatus beïnvloedt HEK293T EV-opname. HEK293T EV's werden samen gekweekt met volwassen menselijke neuronen en menselijke neurale stamcellen. een Representatieve IFC-beelden van ontvangende cellen die samen zijn gekweekt met HEK293T EV's. b –d Kwantificering van EV-opnamevoorkeursassays vergeleken met controles en elkaar via spottelling, gemiddelde fluorescentie-intensiteit en maximale pixelverhoudingen. Staven vertegenwoordigen gemiddelde  ± SEM; N = 3; ongepaarde T test. *p < 0,05; ***p < 0,01 vergeleken met 0 EV's (controle)