Optimalisatie van imaging flow cytometrie om HEK293T extracellulaire vesikel opname kinetiek en specificiteit te kwantificeren

Samenvatting

Extracellulaire vesikels (EV's) zijn nanosized lipide bilagen-gebonden vesikels die natuurlijk worden gesecreteerd door de meeste celtypen als een communicatiemechanisme om eiwitten, lipiden en genetisch materiaal over te dragen. Ondanks het therapeutische potentieel van EV's, is er beperkte informatie over EV opname kinetiek en specificiteit. Hier optimaliseerden we een imaging flow cytometrie (IFC)-gebaseerd platform om kwantitatief de effecten van dosis, tijd en ontvangercel specificiteit op humane embryonale niercel (HEK293T) EV internalisatie in een hoge-doorvoer manier te beoordelen. We vonden dat HEK293T EV opname een actief proces is dat dosis- en tijdsafhankelijk is. Verder werd de selectiviteit van EV opname kwantitatief in vitro bepaald, en we vonden dat HEK293T EV's in hogere hoeveelheden geïinternaliseerd werden door cellen van dezelfde oorsprong. Ten slotte internaliseerden neurale stamcellen significant meer HEK293T EV's relatief tot volwassen neuronen, wat suggereert dat stamcellen of progenitoren, die metaboler actief zijn dan terminal gedifferentieerde cellen, hogere snelheden van actieve EV internalisatie kunnen hebben. De karakterisering van EV opname, met name specificiteit, dosis- en tijdsafhankelijkheid, en kinetische assays zullen helpen informeren en ontwikkelen gerichte en efficiënte EV-gebaseerde therapeutica.

Inleiding

Extracellulaire vesikel onderzoek is een opkomend veld vanwege het therapeutische en diagnostische nut van natuurlijke en ingenieursgewijze extracellulaire vesikels (EV's). EV's variëren van 50 tot 1000 nm in diameter, worden geproduceerd door alle celtypen en zijn verrijkt met transmembraan eiwitten, waaronder CD63, CD81 en CD9; lipiden; eiwitten; en DNA, RNA, mRNA en microRNA. EV inhoud, met name actieve mRNA en miRNA, is geïmpliceerd in modulatie van ontvangercellen via de novo translatie en post-translationele regulatie van doelcellen. Het begrijpen en vervolgens wijzigen van kinetische EV opname en internalisatie zal uiteindelijk leiden tot geoptimaliseerde aflevering van EV inhoud aan doelcellen met hoge genoeg concentraties om een therapeutisch voordeel te hebben.

Eens gedacht te zijn "het afval van de cellen", zijn EV's benut als een alternatief voor celtherapieën vanwege veel voordelen waaronder hun biocompatibiliteit, lage immunogeniciteit en toxiciteit, capaciteit voor herhaalde dosering, diverse administratieroutes en potentieel om geneesmiddelen en genetische therapieën af te leveren. Onze groep heeft eerder positieve effecten van neurale stamcel-afgeleide EV's in beroerte en traumatische hersenletsels gerapporteerd. In zowel muis als varkens beroerte modellen verbeterden EV's weefsel en functionele herstel na beroerte. We hebben ook getoond dat EV's neurobeschermend zijn met functionele voordelen in een knaagdier traumatische hersenletsels model. Ondanks deze waargenomen effecten en toekomstig potentieel van EV's, is er weinig begrip van EV opname specificiteit en kinetiek, wat de vertaling van EV therapeutica naar de kliniek kan hinderen.

EV's zijn ook geïnjineerd als overdrachtsvectoren en geladen met therapeutische agenten waaronder gentherapieën en chemische verbindingen als alternatief voor nanopartikelt herapeutica en afleveringsvectoren. HEK293T cellen zijn breed gebruikt als EV producer cellen vanwege hun inherent snelle proliferatie, hoge EV opbrengst en gemak van genetische manipulatie. HEK293T EV's leverden gentherapieën waaronder miRNA therapeutica voor borstkanker en zijn gebruikt om chemotherapeutica en therapeutische eiwitconstructies af te leveren in een schwannoom model. Vergelijkbaar met synthetische nanopartikel studies die cytotoxiciteit in vitro beoordelen, toonden MTT toxiciteitsassays lage toxiciteit van ongeladen HEK293T EV's en daaropvolgende hoge cytotoxiciteit toen geladen met chemotherapeutica. Vanwege dit overvloedige gebruik van HEK293T EV's, analyseerden we hun kinetiek en specificiteit in deze studie.

Selectieve of specifieke opname verwijst naar een EV's natuurlijke vermogen om specifieke celtypen te targeten. Er is overvloedig bewijs over de mechanismen van EV internalisatie met weinig consensus over opname specificiteit. Vaak vertonen EV's selectieve opname door vergelijkbare ontvangercellen als hun ouder cellen, epitheele cellen internaliseren meer epitheel-afgeleide EV's dan andere ontvangercellen, en mesenchymale stamcellen (MSC) internaliseren een significant groter bedrag van MSC-afgeleide EV's vergeleken met andere cellijnen in vitro. Echter, andere studies vonden dat EV's geïternaliseerd worden door alle celtypen en een niet-selectieve biodistributie vertonen wanneer geadministreerd in vivo. Ondanks het immense therapeutische potentieel en belang van EV's, is er een tekortkoming in het begrip van EV opname specificiteit. Door EV opname specificiteit beter te begrijpen, kunnen we EV producer cellen die selectief geïternaliseerd worden door ontvangercellen van belang, geschikt kiezen en dus de therapeutische toepasbaarheid van EV's verbeteren.

Een potentiële reden voor conflicterende EV opname resultaten is de gebrek aan standaardisatie in meetplatformen, waaronder analyses van dosis en tijd effecten. Recentelijk publiceerde een International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) groep experts een position paper dat de noodzaak benadrukte voor analyse van dosis en tijd, onder andere verwarrende factoren op EV opname. De groep stelde dat "één dosis past niet voor allen" en dat dosis de EV opname of selectiviteit kan beïnvloeden. Het verhogen van doses HEK293T EV's verschuift het biodistributiepatroon in vivo. Opnameprofielen van serum-afgeleide EV's werden significant gewijzigd door dosis. Daarnaast kan co-incubatietijden van EV's met ontvangercellen variërend van 15 min tot 48 uur de opname metingen veranderen. Als geadopteerd door EV onderzoekers en industrie, kan een kwantificeerbaar en betrouwbaar proces om standaard dosis- en tijdkrommen te bepalen helpen de minimum effectieve dosis te identificeren en leiden tot meer robuuste en nuttige studies.

Eerder hebben onderzoekers standaard flow cytometrie samen met verschillende vormen van lage-doorvoer microscopie waaronder confocal microscopie gebruikt om EV opname te analyseren. Echter, deze technologieën hebben diverse beperkingen. Confocal microscopie kan tijdrovend en subjectief zijn. Traditionele flow cytometers zijn ontworpen om biologische deeltjes in het cellulaire bereik te meten, kunnen EV zwerm of coincidentie niet differentiëren en hebben verhoogde ruis door triggeren. Zoals vermeld door de ISEV groep, is er groeiende bewustwording van de fysieke beperkingen van traditionele flow cytometrie en benadrukken ze de vraag naar gespecialiseerde flow cytometrie met detectielimieten in het 100-nm bereik. Imaging flow cytometrie (IFC) combineert de hoge-doorvoer kwantitatieve aard van flow cytometrie met fluorescente imaging technologie die inherent kleine fluorescente deeltjes kan resolueren, tot 100 nm in diameter. IFC mogelijkheden leiden tot lage ruis/achtergrond, verminderde zwerming en geladen gekoppelde apparaten voor beeldhelderheid. Deze kenmerken helpen bij het ontwikkelen van een gating strategie voor het karakteriseren van EV's en opname met visuele bevestiging in een hoge-doorvoer manier als een nauwkeurig en kwantificeerbaar EV opname platform.

In deze studie werden CD63-eGFP-exprimerende HEK293T cellen gebruikt als de donorcellijnen voor EV productie vanwege hun veelvoorkomend gebruik in therapeutische ontwikkeling. De geïsoleerde fluorescente EV's werden geco-cultuurd met ontvangercellijnen waaronder neurale en endotheliale cellen. Opname werd gekwantificeerd met behulp van IFC, wat resulteerde in een gestandaardiseerd platform om de belangrijke kinetische EV opname en internalisatie kenmerken voor in vitro celsystemen te meten. Verder leveren we data over een proces om opname van fluorescente EV opname in verschillende condities en gecultureerde cellijnen te kwantificeren om selectieve EV opname te verduidelijken.

Materialen en Methodes

Celcultuur

Humane embryonale niercellen (HEK293T) werden gekocht bij ATCC en gecultiveerd in DMEM bevattend 10% fetale boviene serum, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine. Humane neurale stamcellen (hNSC), SH-SY5Y neurale cellen, C3A lever epitheele cellen, humane navelstreng veneuze endotheele cellen (HUVEC) en neuronen werden allemaal gecultiveerd onder standaardcondities bij 37 °C, 5% CO₂ voor extracellulaire vesikel opname assays.

EV Labeling en Isolatie

CD63-eGFP plasmide DNA werd verkregen van Addgene (#62964). CD63-pEGFP C2 was een cadeau van Paul Luzio (Addgene plasmide #62964). HEK293T cellen werden gecultiveerd tot 70% confluentie in 10-cm schalen, en 10 μg plasmide DNA getransfecteerd met Lipofectamine 2000 volgens de fabricanteninstructies. Vierentwintig uur post-transfectie werd het medium veranderd naar standaard HEK293T medium zonder fetale boviene serum en 3 opeenvolgende dagen verzameld. Zoals eerder beschreven, werd HEK293T medium gefilterd door een 0,22-μm filter en verrijkt door ultrafiltratie met behulp van 100-kDa geregenereerde cellulose Amicon centrifugale filtereenheden en tweemaal gewassen met PBS++. EV's geconcentreerd tot 1 mL, en concentratie en grootteverdelingen werden gemeten op Nanosight NS300 volgens het protocol van de fabrikant (Malvern, UK). EV's werden geïsoleerd uit verschillende HEK293T cultuurvaten, elk vat beschouwd als afzonderlijke biologische replicaten, met drie technische replicaten binnen elk biologisch replicaat (minimaal negen monsters in totaal voor elke conditie).

Opname Assays

Ontvangercellijnen werden gezaaid bij 60% confluentie in een 6-putten plaat gedurende 24 u onder standaard cultuurcondities bij 37 °C. Standaard media werden veranderd naar fetale boviene serum-vrije (FBS−) media voor extracellulaire vesikel co-cultuur. Groen fluorescerend eiwit (GFP)-getagde EV's werden aan cellen toegediend bij variërende doses en tijdstippen. Na co-cultuur werden cellen heropgelost in 5% trypsin en geconcentreerd tot ongeveer één miljoen cellen per 50 μL voor flow cytometrie. Zevenendertig graden Celsius is de standaard voor EV opname experimenten in onze assays omdat het de standaard is gebruikt voor zowel celcultuur als in vitro EV opname platforms.

Inhibitieve Assays

Koude Assay

EV's werden geco-cultuurd met ontvangercellen bij 4 °C om effectief de celcultuurgroei te "pauzeren" en actieve processen te remmen. Vier graden Celsius remt alle actieve vormen van EV opname.

Gefixeerde Assay

Ontvangercellen werden gefixeerd in 4% paraformaldehyd gedurende 30 min op ijs en gewassen met PBS direct voor co-cultuur met EV's om alle actieve vormen van EV opname te remmen.

ImageStreamX Verwerving

Verwerving werd uitgevoerd op de ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer (Luminex Corporation, Seattle, Washington) met behulp van de INSPIRE software. Een minimum van 5000–10.000 cellevenementen werden verkregen. Elk biologisch monster werd gerepliceerd in drie technische replicaten putjes en afzonderlijk verkregen op de ISx. Heldere veldafbeeldingen werden verzameld op kanaal één en zijwaartse verstrooiing (785 nm) op kanaal zes. Groen fluorescerend eiwit (GFP) werd geëxciteerd door 488 nm argon laser bij 200 mW, en fluorescentie werd verzameld op kanaal twee (480-560 nm). Een vergroting van 60× werd gebruikt op elk monster samen met een lage verwervingssnelheid voor hoge gevoeligheid.

IDEAS Analyse

Data en afbeeldingsanalyses werden uitgevoerd met behulp van de IDEAS software (Luminex). De gating strategie is het volgende: 1. Focus gate werd bepaald om cellen te elimineren die niet in het fokusveld waren met behulp van de Gradient RMS waarde. 2. De gefocuste cellen werden gegatet om dubbelen en debris te elimineren met behulp van oppervlakte helder veld vs. aspectratio helder veld. Gegate data werden gebruikt om histogrammen te creëren en statistische referenties te genereren die fluorescentie-intensiteit (som van alle pixels in een afbeelding), maximale pixelintensiteit (intensiteit van de helderste pixels in een afbeelding), samen met spot count waarden via interne algoritmes voor elk monster meten. Spot count kenmerken werden gegenereerd met behulp van de toepasselijke IDEAS Wizards. Spot count, gemiddelde intensiteit en maximale pixelverhouding worden berekend door de formule (Uitvoerwaarde met EV's / Uitvoerwaarde zonder EV's).

Statistiek

Alle kwantitatieve data werden geanalyseerd via GraphPad Prism 8.1.2 (San Diego, Californië) en in drievoud gedaan. De data worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Statistische significantie werd bepaald met behulp van een ongepaarde T-toets of een eenrichtings variantieanalyse (ANOVA) met Tukey's of Dunnett's meervoudige vergelijking post hoc vergeleken met controles wanneer toepasselijk. p < 0,05 werd als significant beschouwd.

Resultaten

CD63-eGFP-Getagde HEK293T Extracellulaire Vesikel Eigenschappen

Om fluorescente gelabelde EV's te genereren voor het analyseren van de kinetiek en opname van extracellulaire vesikels, werden HEK293T cellen getransfecteerd met een plasmide dat CD63-eGFP fusie-eiwit draagt. CD63 is een tetraspanine eiwit dat algemeen verrijkt is in de membraan van exosomen wat het een optimale doel maakt voor EV fluorescente tagging. Verbruikt medium werd verzameld uit HEK293T celcultuur en EV's geïsoleerd zoals eerder gerapporteerd. We vergeleken de grootte en distributie van EV's geïsoleerd van CD63-eGFP-getransfecteerde HEK293T cellen met niet-getransfecteerde HEK293T cellen. Controle en CD63-eGFP-getransfecteerde HEK293T EV's vertoonden een gemiddelde mediaan diameter van 110,28 nm en 103,616 nm, respectievelijk, gemeten door nanotracking software, wat consistent is met de gerapporteerde grootte van HEK293T EV's. Er werden geen significante verschillen waargenomen in mediaan diameter (p = 0,1615) en distributie (p = 0,4225) van EV's geïsoleerd van niet-getransfecteerde en CD63-eGFP-getransfecteerde HEK293T cellen. eGFP labeling veranderde de grootte van HEK293T EV's niet.

IFC assay werd uitgevoerd om te bepalen of de CD63-eGFP geassocieerd was met EV's. Als een fluorescente negatieve controle, lieten 1,34 μM kralen in bufferoplossing (Fig. 1c, boven) geen fluorescentie zien wanneer blootgesteld aan de 488-nm excitatiegolfengte, maar waren zichtbaar in helder veld (BF) en zijwaartse verstrooiing (SSC). Ongelabelde HEK293T EV's waren negatief in BF, GFP en SSC, wat een kleine grootte onder de BF drempel en gebrek aan fluorescentie suggereert. De afwezigheid in BF betekent een EV grootte kleiner dan 300 nm, wat minimale zwerming van EV's suggereert. Ten slotte zijn CD63-eGFP-getagde EV's negatief in BF en positief in het GFP kanaal wat positieve fluorescentie van de HEK293T EV's betekent. Het positieve signaal in het GFP kanaal kan wijzen op een enkele EV of een groep fluorescente EV's. Collectief tonen deze resultaten aan dat de geïsoleerde HEK293T EV's standaard grootte en eiwitmarkersprofielen hebben consistent met eerdere rapporten van HEK293T exosomen, en eGFP labeling de grootte van HEK293T EV's niet wijzigt.

Met behulp van een commercieel beschikbare flow cytometrie-gebaseerde methode om algemene EV markers te meten, bepaalden we het algemene EV tetraspanine profiel. Geïsoleerde HEK293T EV's van controle en CD63-eGFP-exprimerende HEK293T cellen waren positief voor standaard EV markers waaronder CD9, CD63 en CD81 gemeten in relatieve fluorescentie-eenheden. Zoals eerder gerapporteerd, werd CD29 ook gevonden op het oppervlak van HEK293T EV's en CD63-eGFP-getransfecteerde HEK293T EV's. Deze resultaten geven aan dat de isolatie- en taggingmethodes voor HEK293T EV resulteren in EV's met algemene HEK293T exosoom markers.

Actieve Opname van HEK293T EV's

Twee inhibitieve internalisatie assays werden uitgevoerd. HEK293T EV's werden geco-cultuurd met ontvangercellen bij 4 °C (koud) of met ontvangercellen die eerder gefixeerd waren met paraformaldehyd (gefixed). De behandelingen verlaagden de aanwezigheid van eGFP-gelabelde EV's in de ontvangercellen vergeleken met ontvangercellen geco-cultuurd met EV's onder fysiologische condities. Koude en gefixeerde inhibitieve assays verlaagden de spot count (koud: p = 0,0127, gefixeerd: p = 0,0078), intensiteit (koud: p = 0,0105, gefixeerd: p = 0,0374) en maximale pixel (koud: p = 0,0159, gefixeerd: p = 0,0149) van fluorescentiesignalen in ontvangercellen zonder behandelingen, wat inhibitie van EV opname aangeeft. Deze resultaten impliceren dat eGFP localisatie en toenames in uitvoerparameters betekenen dat HEK293T EV's geïinternaliseerd worden voor de volgende opname assays.

Dosis-afhankelijke HEK293T EV Opname

Om een standaard dosiskromme voor het IFC platform te ontwikkelen, werden HEK293T EV's geco-cultuurd met HEK293T ontvangercellen bij toenemende doses variërend van 0 tot 20.000 EV's per cel bij 37 °C. Representatieve IFC afbeeldingen toonden een visuele toename van eGFP fluorescentie met verhoogde doses EV's. Het laagste aantal EV's dat gedetecteerd kon worden was 6000 EV's per geco-cultureerde HEK293T cel. Op dit niveau waren spot count (p = 0,0012), intensiteit (p = 0,0075) en maximale pixel (p = 0,0005) metingen significant groter dan ontvangercellen zonder EV's. Daarom is doses van 6000 HEK293T EV's de lage drempel voor opname in onze experimentele conditie. Op dezelfde manier hadden doses van 10.000 en 20.000 EV's hogere spot count (10.000: p = 0,0009; 20.000: p < 0,0001), intensiteit (10.000: p < 0,0001; 20.000: p < 0,0001) en maximale pixel (10.000: p < 0,0001; 20.000: p < 0,0001) vergeleken met cellen zonder EV's. Bij het vergelijken tussen de hogere doses, zijn er geen significante verschillen in spot count (6000 vs. 10.000: p = 0,999, 10.000 vs. 20.000: p = 0,0927), intensiteit (6000 vs. 10.000: p = 0,8482, 10.000 vs. 20.000: p = 0,999) en maximale pixel count (6000 vs. 10.000: p = 0,6056, 10.000 vs. 20.000: p = 0,5281) tussen 6000 en 10.000, samen met 10.000 vs. 20.000. Op dezelfde manier, bij het vergelijken tussen 6000 en 20.000, is er geen statistisch verschil in spot count (p = 0,0787) en intensiteit (p = 0,8083). Er is een significant verschil in maximale pixel tussen 6000 en 20.000 (p = 0,0140). Over het algemeen toont de opbrengtskromme een significante dosisafhankelijkheid in alle parameters (spot, intensiteit, max pixel, p < 0,0001). Deze resultaten geven aan dat HEK293T EV opname dosisafhankelijk is met een minimumdrempel van 6000 HEK293T EV's per cel.

HEK293T EV Temporale Opname

Met 6000 EV's per cel, werden HEK293T EV's geco-cultuurd met HEK293T cellen voor toenemende lengtes van tijd voor IFC, variërend van 5 min tot 24 u. De lengte van EV blootstelling speelde een sleutelrol in de hoeveelheid zichtbare fluorescentie in de ontvangercellen, dalend na 12 u. Initieel toonde 30 min co-cultuur een significante toename in spot count (p = 0,0081) wat een mogelijke trend naar EV opname suggereert, maar niet in andere opnameparameters (intensiteit: p = 0,3073, max pixel: p = 0,0952). Bij 2 u co-cultuur werden significant hogere spot count (p = 0,0028), intensiteit (p = 0,0420) en maximale pixel (p = 0,0006) vastgelegd vergeleken met de ontvangercellen zonder EV's. Opnieuw, bij 4 u co-cultuur waren alle parameters groter dan controles (spot count: p = 0,0003, intensiteit: p < 0,0001, max pixel: p < 0,0001). Intensiteit en maximale pixel bleven hoger dan controles bij 4, 12 en 24 u co-cultuur. Er waren geen verschillen in enige opnameparameters tussen 4 en 12 u co-cultuur (spot: p = 0,999, intensiteit: p = 0,5797; maximale pixel: p = 0,2489). Echter, intensiteit (p = 0,0191) en maximale pixel (p = 0,0027) daalden tussen 12 en 24 u co-cultuur. Vergelijkbaar met de dosiskromme, is HEK293T EV opname tijdsafhankelijk met consistente EV opname bij 4 u incubatie en een piek bij 12 u. Collectief is een dosis van 6000 EV's per gezaaide cel en een co-cultuur van 4 u gestandaardiseerd voor de volgende opname assays.

Vergelijkende Opname van HEK293T EV's door Meerdere Cellijnen

De hypothese dat EV opname een selectief proces is waarbij EV's preferentieel worden opgenomen door cellen van hun eigen oorsprong, werd getest met behulp van IFC. HEK293T EV's werden geco-cultuurd met HEK293T cellen of andere cellijnen: epitheele (C3A levercellen), endotheele (humane navelstreng veneuze endotheele cellen) en neurale (SH-SY5Y glioblastomacellen). eGFP fluorescentie is meer overvloedig in HEK293T cellen vergeleken met de andere celtypen. Vergeleken met C3A en HUVEC's, hadden HEK293T cellen significant hogere fluorescentie-intensiteit (C3A: p = 0,0321; HUVEC: p = 0,0055) toen geco-cultuurd met HEK293T EV's. Daarnaast hadden HEK293T cellen hogere maximale pixel (C3A: p = 0,0221; HUVEC: p = 0,0079; SH-SY5Y: p = 0,0486) vergeleken met alle andere ontvangercellijnen. Wat betreft intensiteit, waren SH-SY5Y cellen significant hoger dan HUVEC's toen geco-cultuurd met HEK293T EV's (p = 0,0304). Deze resultaten ondersteunen HEK293T EV selectieve opname door HEK293T cellen vergeleken met andere cellijnen in vitro.

Differentiatie Status van Neurale Cellen en HEK293T EV Internalisatie

Omdat EV's geïmpliceerd zijn voor therapeutische en afleveringsdoeleinden gericht op neurale ziekten, werden humane neurale stamcellen (hNSC's) en volwassen humane neuronen gebruikt als ontvangercellijnen in ons systeem om te onderzoeken of de differentiatie status van de ontvangercel een rol speelt in selectieve opname van EV's. Representatieve afbeeldingen van IFC toonden visueel bewijs van opname in beide celtypen, maar met de grootste eGFP localisatie in hNSC's. hNSC's geco-cultuurd met HEK293T EV's hebben hogere spot count (p = 0,0082) en max pixel (p = 0,0083) vergeleken met volwassen neuronen. Samen suggereren deze resultaten dat de differentiatie status van neurale cellen de opname van HEK293T EV's beïnvloedt.

Discussie

EV in vitro Opname Standaardisatie Proces

Een groep internationale experts op EV's benadrukte de noodzaak om de minimale effectieve dosis van EV's voor opname assays effectief te bepalen, en hier hebben we een systeem ontwikkeld dat effectief door het veld geadopteerd kan worden. Er zijn uitdagingen bij het analyseren van EV opname. Bijvoorbeeld, zoals we en anderen observeerden, kunnen resultaten verschillen als de EV dosis en blootstellingstijd gewijzigd worden. We hebben HEK293T EV dosis en concentratie als een kinetische variabele adressed. Ook kan een in vitro minimum effectieve dosis meer uniform de in vivo biodistributie van EV's voorspellen en gebruikt worden om meer consistente in vivo doseringsparameters voor EV therapeutica en aflevering te ontwikkelen. In een in vivo muis EV biodistributiestudie resulteerde het verhogen van de dosis HEK293T EV's in een verschuiving van de relatieve EV distributie in organen. Vergelijkbaar met bevindingen in een eerdere in vitro studie met blaaskanker EV's, vertoonden HEK293T EV's een sterke dosisafhankelijkheid met een minimale effectieve dosis van 6000 EV's in onze studie. We zijn de eersten die deeltjes per cel als een gevoelige dosismeting in vitro gebruiken, wat beter correleert met in vivo modellen die deeltjes per lichaamsgewicht gebruiken. Onze data gaven ook een dosissaturatielimiet na 6000 EV's aan, potentieel informerend toekomstige in vivo dosisbereik studies door aan te geven dat hogere doses beperkte voordelen kunnen hebben.

Een andere verwarrende variabele van het meten van EV opname is de potentiële temporele effecten op EV opname. In ons systeem vonden we sterke tijdsafhankelijkheid met opname zo vroeg als 2 u met een potentiële afname tussen 12 en 24 u. Vergelijkbaar met onze bevindingen, werd tijdsafhankelijkheid gerapporteerd in weinig studies met blaaskankercellen, tumorkellen en anderen met opname zo vroeg als 15 min tot 24 u. Zoals gezien met HEK293T EV's, kunnen de lagere waarden bij 24 u co-cultuur een resultaat zijn van celdeling of hergebruik/afbraak van EV's geïinternaliseerd op vroege tijdstippen. Specifiek, aangezien EV's zijn getoond om geïternaliseerd te worden dan afgebroken of geïternaliseerd dan vrijgegeven na 24 u, kunnen langere incubaties onnauwkeurige internalisatie-aflezingen genereren. Onze studie is de eerste die IFC gebruikt om visueel en kwantitatief bewijs van een tijdsafhankelijke opbrengtskromme op HEK293T EV opname te leveren.

Zoals het ISEV position paper suggereert, kan de keuze van een EV label de opname beïnvloeden, wat minder disruptieve technieken noodzakelijk maakt zoals de GFP tagging methodes gebruikt in onze studie. Specifiek claimen 72% van de onderzoekers die deelnamen aan een enquête dat lipide kleurstof experimenten onbetrouwbaar zijn tenzij juiste controles gebruikt worden. EV kleurstoffen correleren niet betrouwbaar met kleine EV inhoud en kunnen zelfs de vesikelgrootte verhogen. Contaminatie van verkeerd gelabelde lipoproteïnen en eiwitinhalte en kleurstofaggregatie droegen bij tot false positieve resultaten. Daarom fuseerden we CD63 met een eGFP om de HEK293T EV's te labelen. Vergelijkbaar met andere rapporten van eiwit tagging, waren HEK293T EV's GFP positief met geen waargenomen verschillen in diameter en standaard EV oppervlakte-eiwitsamenstelling behouden. Ondanks dit is het belangrijk om te noteren dat het labelen van EV's met specifieke EV eiwitten de tracking kan beperken tot slechts een paar subtypes EV's die de respectieve markers expresseren. Andere potentiële beperkingen kunnen zijn dat de fluorescentie-intensiteit afhankelijk is van eiwitexpressieniveau, de efficiëntie van EV membraanlabeling en excitatiekracht van de lichtbron. Echter, IFC is gevoelig, detecterend lage fluorescentie-intensiteit met accurate visualisatie van CD63-GFP deeltjes in het 100-nm bereik.

Selectieve Opname

EV's vertonen eiwitten en andere signalen die selectieve opname kunnen verlenen. Aangezien de eerste stap van EV biogenese de invaginatie van het plasmamembraan is, bevat het EV membraan vergelijkbare eiwitten, receptoren, adhesiemoleculen en integrines vergeleken met het donorcelmembraan. De lipiedsamenstelling en tetraspanine eiwitten op EV membranen gereguleerd door donorcellen kunnen bijdragen aan EV tropismen met ontvangercellen. MSC EV's transporteerden selectief inhoud in MSC's, ondanks naderbijheid aan monocyten. In tegenstelling, rapporteren anderen dat natuurlijke EV's in gelijke mate worden opgenomen door elk celtype, ongeacht EV oorsprong, wanneer gebruikmakend van imaging of functionele knockdown assays. Met behulp van het IFC platform vonden we dat HEK293T extracellulaire vesikels in grotere hoeveelheden worden opgenomen door HEK293T cellen dan andere gerapporteerde cellijnen, wat een inherent EV opname specificiteit suggereert. Door deze uitkomst en de veelzijdigheid van IFC, kunnen EV bronnen geschikt geselecteerd en geanalyseerd worden voor het targeten van specifieke ontvangercellen. Onze kennis naar is dit de eerste studie die imaging flow cytometrie gebruikt om de specificiteit van HEK293T EV's te analyseren.

Naast zelf-selectiviteit, is de differentiatie status van ontvangercellen gehypotheseerd om een rol te spelen in opname van EV's. Zoals onze groep en anderen hebben getoond, hebben EV's therapeutische effecten in het centrale zenuwstelsel en zijn bekend om celfuncties in neurale ontwikkeling en volwassenen te modelleren. Hier voor het eerst beïnvloedde de differentiatie status van neuronen EV opname, waar humane neurale stamcellen significant grotere opname van HEK293T EV's hadden vergeleken met volwassen neuronen. Onvolwassen hNSC's internaliseren exogene EV's actiever dan kwiescente volwassen neuronen. Aangezien hNSC's hoog proliferatieve cellen in cultuur zijn, kunnen ze aspecifiek nutriënten en EV's internaliseren. Op dezelfde manier internaliseerden onvolwassen dendritische cellen EV's op hogere niveaus dan volwassen dendritische cellen. Echter, een andere studie met myeloïde precursorcellen vond dat de volwassen dendritische cellen en macrofagen meer EV's internaliseerden dan onvolwassen dendritische cellen en monocyten. De waargenomen verschillen kunnen worden toegeschreven aan de fagocytische activiteit van verder gedifferentieerde myeloïde cellen. Vanwege het in vitro bewijs ter ondersteuning van selectieve opname, kunnen HEK293T EV's worden gebruikt om ongedifferentieerde neuronen in toekomstige therapeutische toepassingen te modelleren.

Conclusies

Samenvattend, hebben we een kwantitatief en hoog-doorvoer platform verder ontwikkeld voor het kwantificeren van HEK293T EV opname kinetiek. Dit platform kan uitgebreid worden naar andere donorer EV's en ontvangerceltypen en assays voor liposomen en synthetische nanopartikelafleveringsvectoren. Significant vonden we dat HEK293T EV opname een selectief proces is, met specificiteit naar HEK293T cellen. De IFC assays die hier ontwikkeld zijn, kunnen gebruikt worden om parameters die gebruikt worden in in vivo dosisverhoging en biodistributiestudies beter te definiëren en instrumentale informatie te leveren voor een voorspellend model van EV opname resultaten in vivo.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

De datasets gegenereerd en/of geanalyseerd tijdens de huidige studie zijn beschikbaar bij de corresponderende auteur op redelijk verzoek.

Afkortingen

EV:

Extracellulaire vesikels

HEK293T:

Humane embryonale niercellijn

IFC:

Imaging flow cytometrie

hNSC:

Humane neurale stamcel

GFP:

Groen fluorescerend eiwit

BF:

Helder veld

SSC:

Zijwaartse verstrooiing

ISEV:

International Society of Extracellular Vesicles