Fluorescerende nano-biomassastippen:ultrasoon ondersteunde extractie en hun toepassing als nanosonde voor Fe3+-detectie

Resultaten en discussie

Morfologie en chemische samenstelling

De NBD's zijn opgesteld via UES-methoden; alle processen worden geïllustreerd in Schema 1. De afmetingen en morfologie van NBD's werden gekenmerkt door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), zoals weergegeven in Fig. 1a en b. De TEM-afbeeldingen laten zien dat de NBD's bijna bolvormig waren. De diameters van de NBD's variëren van 1 tot 3 nm met een gemiddelde diameter van 2,4 nm, en de bijbehorende grootteverdeling wordt weergegeven in Fig. 1c. Roosterranden van de NBD's kunnen niet worden waargenomen aan de hand van het TEM-beeld met hoge resolutie (inzet van figuur 1b), wat de amorfe aard van de NBD's aangeeft. De afbeeldingen van de ringvormige donkerveld scanning transmissie-elektronenmicroscopie (HAADF-STEM) en de bijbehorende elementaire mapping (koolstof, stikstof en zuurstof) van de NBD's worden getoond in Fig. 1d-g. Het is te zien dat de dominante elementen van de NBD's koolstof, stikstof en zuurstof zijn. Bovendien, solid-state ¹³ C nucleaire magnetische resonantie (NMR) metingen van de NBD's worden getoond in Fig. 1h. De signalen variëren van 160-180 ppm, en de pieken bij 164 ppm en 170 ppm komen overeen met C=O-bindingen, die indicatief zijn voor sp ² koolstofatomen [25, 26].

Schematische weergave van het bereidingsproces van de NBD's uit sojabonen

TEM-afbeeldingen van de NBD's (a ) en (b ). c De deeltjesgrootteverdeling van de NBD's. HAADF-afbeelding (d ) en bijbehorende elementaire verdelingstoewijzing van koolstof (e ), stikstof (f ), en zuurstof (g )

Om de structurele kenmerken van de NBD's verder te bestuderen, werd het röntgendiffractiepatroon (XRD) geregistreerd. Zoals weergegeven in figuur 2a, vertoont het typische XRD-patroon een brede piek op ongeveer 21,5 ^o en een schouderpiek rond de 41,0 ^o , wat kan worden toegeschreven aan de amorfe koolstoffase [27]. Verder werden de karakteristieke absorptiepieken van de sojabonen en NBD's onderzocht met fourier-transform infrarood (FTIR) spectroscopie, zoals weergegeven in figuur 2 (b). De absorptiebanden rond 3380 cm ⁻¹ kan worden toegeschreven aan de uitrekkende trillingen van O–H/–N–H, de band rond 2906 cm ⁻¹ op de C–H rektrillingen, en de band op ongeveer 1650 cm ⁻¹ naar de C=O strektrillingen. De pieken op 1400 cm ⁻¹ en 1071 cm ⁻¹ komen overeen met respectievelijk C–H en C–O buigtrillingen [28]. Er is een duidelijk verschil tussen het spectrum van sojabonen en NBD's rond de 1750 cm ⁻¹ , die behoort tot de uitrekkende trillingen van C=O-bindingen van de lipiden in sojabonen [29, 30]. De onoplosbare lipiden in waterige oplossing werden van het monster gescheiden wanneer ze in water weken, wat leidde tot het verdwijnen van de bindingen in het FTIR-spectrum van de NBD's. De gereduceerde C=O-bindingen in het monster komen van de carboxylgroep in het eiwit. De piek gecentreerd op ongeveer 1543 cm ⁻¹ was ook verdwenen, wat kan worden toegeschreven aan de proteolyse in het weekproces van de sojabonen. Terwijl alle pieken voor en na het ultrageluidproces worden vergeleken, is de vorming van –OH-, –C=O (amide I) en –NH-groepen op het oppervlak van de NBD's te zien [31]. De bovenstaande resultaten demonstreren het bestaan ​​van hydroxyl-, amidogeen- en carboxylgroepen op het oppervlak van de NBD's, en deze functionele groepen spelen een belangrijke rol in de hydrofiliciteit en stabiliteit van de NBD's in waterige oplossing. Röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS) -spectra werden uitgevoerd om de componenten van de NBD's verder op te helderen, zoals weergegeven in figuur 2c. Het XPS-spectrum vertoont drie sterke pieken bij 532,0, 401,1 en 286,1 eV, die respectievelijk kunnen worden toegeschreven aan O 1s, N 1s (Fig. 2d) en C 1s (Fig. 2e). Deze resultaten geven aan dat de NBD's voornamelijk C (64,33%), O (32,34%) en N (2,72%), evenals een beperkte hoeveelheid P bevatten, en het P-element kan afkomstig zijn van het fosfolipide van de sojabonen [33] . In het XPS-spectrum met hoge resolutie vertoont het C 1s-spectrum drie pieken bij 287,6, 285,8 en 284,6 eV, die kunnen worden toegewezen aan de C=O, C–O/C–N en C–C/C=C groepen, zoals weergegeven in Fig. 2c. De C=O binding is van de oplosbare carboxylgroepen [24]. De C–O/C=N en C–C/C=C zijn van de nitreuze koolstoffen en sp ² /sp ³ koolstoffen, respectievelijk [34]. Het in Fig. 2d getoonde N 1s-spectrum bevestigt twee hoofdbanden bij 399,5 eV en 401,6 eV, wat het bestaan ​​van pyridine N en pyrrolic N onthult, wat consistent is met de FTIR-analyse. Het O 1s-spectrum gepresenteerd in Fig. 2f heeft twee pieken bij 531,4 eV en 533,0 eV, die respectievelijk kunnen worden toegeschreven aan de groepen C–OH/C–O–C en C=O [9].

een XRD-patroon van de NBD's. b FTIR-spectra van de sojaboon en NBD's. c XPS-enquêtespectrum van de NBD's. XPS-spectra met hoge resolutie van C 1s (d ), N 1s (e ), en O 1s (f )

Een mogelijk mechanisme voor de vorming van NBD's uit sojabonen werd voorgesteld op basis van de bovenstaande analyse. Eerst worden enkele grote deeltjes biomassa die in de oplossing zijn gesuspendeerd, door de ultrasone hersenschudding in nanometergrootte gebroken. Veranderingen in de oplossing voor en na de ultrasone extractiebehandeling worden weergegeven in aanvullend bestand 1:Afbeelding S1. Vervolgens werd het eiwit in de sojabonen gehydrolyseerd tot klein moleculair peptide en aminozuur in het bovenstaande proces, en veel peptideketens met kleine moleculen zijn gehecht aan de biomassa van nanogrootte om de zeer oppervlakte-gefunctionaliseerde biomassa-stippen te vormen. De functionele groepen op het oppervlak van de biomassastippen leveren de belangrijkste bijdrage aan fluorescentie. Volgens het mechanisme werd de mungboon ook gebruikt als voorlopers en werden ook blauwe fluorescerende NBD's verkregen, zoals weergegeven in Aanvullend bestand 1:Afbeelding S2.

Optische eigenschappen

De NBD's vertonen excitatie-afhankelijke fluorescerende eigenschappen, en wanneer de excitatiegolflengte varieert van 320 tot 520 nm, verschuift de emissiepiek geleidelijk naar rood, wat aangeeft dat de emissie van de NBD's kan worden afgesteld door de excitatiegolflengte te veranderen, zoals weergegeven in Fig. 3a. De NBD-waterige oplossing is transparant onder binnenverlichting en vertoont blauwe fluorescentie onder UV-verlichting, zoals weergegeven in de inzet van figuur 3b. Het fotoluminescentie-excitatiespectrum (PLE) van de NBD's wordt weergegeven in aanvullend bestand 1:figuur S3, en de optische excitatiegolflengte ligt in het bereik van 360  tot 420 nm. Om de PL-oorsprong van de NBD's te onderzoeken, zijn de UV-Vis-absorptiespectra van de NBD's met verschillende concentraties opgenomen bij kamertemperatuur (de concentratie van NBD's van onder naar boven is 0,03, 0,06, 0,13, 0,25, 0,25, 0,50, 0,50 , 0,75, 1,00 en 1,50 g/l), zoals weergegeven in Fig. 3b. De UV-Vis-absorptiespectra van de NBD's vertonen twee duidelijke absorptiepieken bij respectievelijk 270 nm en 330 nm. De eerste kan worden toegeschreven aan de π-π ^* overgang van C–C/C=C bindingen, terwijl de laatste naar de n-π ^* overgang van C=O/N bindingen [35, 36]. Deze functionele groepen zijn de belangrijkste chromogene groepen die bijdragen aan de fluorescentie van de NBD's [37, 38]. De PL-spectra van de sojabonen tijdens ultrasone extractie worden weergegeven in aanvullend bestand 1:figuur S4, en de PL-intensiteit neemt met de tijd toe en bereikt dan het maximum. Figuur 3c toont de PL-spectra van de NBD's gemeten van 80 tot 300 ° K. De NBD's vertonen een typisch thermisch uitdovingsgedrag, waarbij alle pieken monotoon in intensiteit afnemen bij toenemende temperatuur. Dit PL-gedrag kan worden toegeschreven aan de toename van niet-stralingsrecombinatie en de afname van stralingsrecombinatie met de toename van temperaturen [39, 40]. Om de stabiliteit van de NBD's te evalueren, zijn de fotostabiliteit en thermostabiliteit van de NBD's gekarakteriseerd, zoals weergegeven in figuur 3d. Voor fotostabiliteit wordt de afbeelding van de meetopstelling weergegeven in Aanvullend bestand 1:Afbeelding S5. De fluorescentie-intensiteitswaarden worden weergegeven in aanvullend bestand 1:Afbeelding S6 en S7. De emissie-intensiteit van de NBD's blijft gedurende 6 h boven de 90% onder de UV-lampverlichting, wat wijst op hun goede fotostabiliteit. Voor thermostabiliteit nemen de fluorescentie-intensiteiten van de NBD's weinig af wanneer de temperatuur varieert van 20 tot 80  ^° C, wat hun hoge thermische stabiliteit onthult.

een Fluorescentiespectra van de NBD's met excitatiegolflengteveranderingen van 320 tot 520 nm. b UV-Vis-absorptiespectra van de NBD's. c Fluorescentiespectra van de NBD's bij verschillende temperaturen, de inzet is de plot van de fluorescentie-intensiteit van de NBD's als functie van de temperatuur. d Fluorescentie-intensiteit en afbeeldingen van de NBD-poeders onder de verlichting van een 365-nm lamp voor verschillende duur en die van de NBD-poeders bij verschillende meettemperaturen

Evaluatie van cytotoxiciteit

De MTT-assays werden gebruikt om de cytotoxiciteit van de NBD's te evalueren. De levensvatbaarheid van HeLa-cellen die zijn geïncubeerd met de NBD's en twee andere soorten CD's die zijn gesynthetiseerd via de hydrothermische methode, zoals weergegeven in Fig. 4. Zoals aangegeven in de afbeelding, neemt de levensvatbaarheid van de cellen weinig af wanneer de NBD-oplossing wordt geïntroduceerd, zelfs wanneer de concentratie van de NBD's bereiken 800 g/ml. Het celoverlevingspercentage was 70% en 67% wanneer de HeLa-cellen werden geïncubeerd met de andere twee soorten cd's in een concentratie van 800 g/ml. Het is duidelijk dat de NBD's een superieure biocompatibiliteit vertonen dan de CD's die zijn bereid uit chemische reagentia.

Levensvatbaarheid van HeLa-cellen na 72   uur incubatie met verschillende concentraties NBD's en CD's

Waarnemingseigenschappen van de NBD's richting Fe ³⁺

Interessant is dat de fluorescentie van de NBD's effectief kan worden gedoofd door Fe ³⁺ , zoals weergegeven in Fig. 5a, en de PL-intensiteit van de NBD's neemt aanzienlijk af met de toename van Fe ³⁺ concentratie. Bovendien kan een goede lineaire relatie worden uitgezet tussen F₀ /F en de Fe ³⁺ concentratie variërend van 0 tot 30 μM (R ² = 0.99), waarbij F₀ en F waren de PL-intensiteit van de NBD's bij ex/em van 370/445 nm in de afwezigheid en aanwezigheid van Fe ³⁺ , zoals weergegeven in Fig. 5b. De uitdovingsefficiëntie werd aangepast door de Stern-Volmer Eq:

een PL-spectra van de NBD's in aanwezigheid van verschillende concentraties Fe ^{3 +} . b Kalibratiecurve van de sensor als functie van Fe ^{3 +} concentratie. c Fluorescentie-intensiteiten van de NBD's in aanwezigheid van verschillende ionen. d Fotografische beelden van de NBD-oplossing met verschillende metaalionen onder binnen- en UV-verlichting

waar K _sv is de uitdovingsconstante van Stern-Volmer en [Q ] is de Fe ³⁺ concentratie. De lineaire regressievergelijking is Y = 0.0072X + 0.99479, R ² = 0,99. De detectielimiet (LOD) van de voorgestelde sensor is vastgesteld op 2,9 M, wat lager is dan het maximaal toegestane niveau van Fe ³⁺ (5,37 M) in drinkwater opgezet door de United States Environmental Protection Agency (USEPA) [24]. Selectiviteit is een andere kritische parameter voor chemische sensoren. Daarom is de fluorescentierespons van de sensor op verschillende storende metaalionen onderzocht, waaronder Ca ²⁺ , Cd ²⁺ , Co ²⁺ , Cu ²⁺ , Cr ³⁺ , Fe ³⁺ , Fe ²⁺ , Hg ²⁺ , Mn ²⁺ , Na ⁺ , Pb ²⁺ , en Zn ²⁺ . Metaalionen elk in een concentratie van 10 ⁻² M werden toegevoegd aan 1 ml NBDs-oplossing met een concentratie van 3 g/l. In Fig. 5c is te zien dat de fluorescentie-intensiteit van de NBD's gevoeliger reageert op Fe ³⁺ dan andere metaalionen. De foto's in Fig. 5d zijn de afbeeldingen van de NBD's met verschillende ionen onder binnen- en UV-verlichting, en de concentratie van metaalionen was 100 M. Het is duidelijk dat de NBD's doven in aanwezigheid van Fe ³⁺ , wat aangeeft dat ze kunnen worden gebruikt voor visuele detectie.

Afschrikmechanisme

Het uitdovingsmechanisme van de NBD's in aanwezigheid van Fe ³⁺ werd besproken op basis van de UV-Vis-absorptiespectra en de fluorescentielevensduur van de NBD's. Uit de UV-Vis-absorptiespectra die worden weergegeven in aanvullend bestand 1:Afbeelding S8, is er geen verandering van de absorptiepieken bij 270 nm en 340 nm met de introductie van Fe ³⁺ , wat aangeeft dat de Fe ³⁺ heeft geen invloed op de structuur van de NBD's [41]. Afgezien van het UV-Vis absorptiespectrum, is het effect van Fe ³⁺ over de levensduur van de NBD werd ook bestudeerd. In Fig. 6a wordt de fluorescentielevensduur korter na toevoeging van Fe ³⁺ , waarbij mogelijk sprake is van gedeeltelijke elektronenoverdracht van de NBD's naar de d orbitaal van Fe ³⁺ , verminderen dus de stralingsrecombinatie van de NBD's [42]. Het fluorescentie-uitdovingsmechanisme van de NBD's veroorzaakt door Fe ³⁺ wordt getoond in Fig. 6b. Het gevoelige fluorescentiedovende effect van de NBD's in aanwezigheid van Fe ³⁺ kan voortkomen uit de sterke interactie tussen Fe ³⁺ en de oppervlaktegroepen van de NBD's. Fe ³⁺ heeft een sterkere bindingsaffiniteit en snellere chelerende kinetiek met amino- en carboxylgroepen op de oppervlakken van NBD's. De speciale coördinatie tussen de Fe ³⁺ ionen en de fenolische hydroxyl/aminegroepen van NBD's is op grote schaal gebruikt voor de detectie van Fe ³⁺ ionen of gekleurde reacties in de traditionele organische chemie [43, 44]. Bovendien zijn de redoxpotentialen van Fe ³⁺ /Fe ²⁺ (Ф = 0,77) bevinden zich tussen de laagste onbezette moleculaire orbitaal (LUMO) en de hoogste bezette moleculaire orbitaal (HOMO) van de NBD's, waardoor foto-geïnduceerde elektronenoverdracht van LUMO naar de complexe toestanden van Fe ³⁺ [45]. Deze resultaten tonen aan dat de NBD's zeer gevoelig zijn voor Fe ³⁺ over de andere metaalionen.

een Fluorescentievervalsporen van de NCD's in de afwezigheid en aanwezigheid van Fe ^{3 +} onder excitatie bij 370 nm en emissie bij 445 nm. b Schematische illustratie van het mogelijke fluorescentie-uitdovingsmechanisme van de NBD's in aanwezigheid van Fe ^{3 +} ionen

Conclusie

Samenvattend zijn luminescente NBD's bereid uit soja via een verwarmingsvrije UES-benadering. De NBD's vertonen helderblauwe fluorescentie met een PL QY van 16,7%, en profiterend van het eetbare biomassa- en verwarmingsvrije syntheseproces, blijft de levensvatbaarheid van de cellen nog steeds 100%, zelfs als de concentratie van de NBD's 800 g/ml bereikt. Bovendien vertoont de fluorescentie van de NBD's een specifieke gevoeligheid voor Fe ³⁺ , en de LOD kan 2,9 M bereiken. De lage toxiciteit en hoge detectielimiet geven aan dat de NBD's naar verwachting potentiële toepassingen zullen vinden in biologische en milieusystemen.

Afkortingen

FTIR:

Fourier-transform infrarood

HAADF-STEM:

Hoge-hoek ringvormige donkerveld scanning transmissie-elektronenmicroscopie

LOD:

Detectielimiet

NBD's:

Nano-biomassastippen

NMR:

Kernmagnetische resonantie

PL:

Fotoluminescentie

QD's:

Kwantumstippen

QY:

Kwantumopbrengst

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie

UES:

Ultrasone extractiestrategie

USEPA:

United States Environmental Protection Agency

XPS:

Röntgenfoto-elektronenspectroscopie

XRD:

Röntgendiffractie