Snelle detectie van Rongaliet via een Sandwich Lateral Flow Strip-assay met behulp van een paar Aptameren

Abstract

Een sandwich laterale flowstrip-assay (LFSA) met behulp van een aantal aptameren gefunctionaliseerd met gouden nanodeeltjes (AuNP's) werd ontworpen om de aanwezigheid van rongalite in agrovoedingsproducten te beoordelen. Meer specifiek werden een biotine-gelabeld primair A09-aptameer geïmmobiliseerd op een met streptavidine gecoat membraan en een secundair B09-aptameer geconjugeerd met AuNP's ontwikkeld als respectievelijk vang- en signaleringsprobes. Dit systeem maakt de succesvolle en directe detectie van rongalite in voedselmonsters met concentraties van slechts 1 μg/ml mogelijk, simpelweg door de kleurverandering van de LFSA-controle- en testlijn te observeren.

Achtergrond

Rongaliet (natriumhydroxymethylsulfinaat) is een industrieel reagens dat doorgaans wordt gebruikt voor het verven van vaten [1] of voor emulsiepolymerisatie [2] als reductiemiddel. Rongaliet kan ook worden gevonden in waterconditioner (bijv. vermindering van chloor en chlooramine) [3], in commerciële cosmetische haarkleurverwijderaars ondanks de vorming van formaldehyde (een bekend carcinogeen voor de mens), of zelfs in farmaceutische formuleringen als antioxidant [4] . Deze verbinding veroorzaakte ook nadelige effecten in China na verwerking in verschillende agrofoodproducten [5]. Deze ontwikkelde test biedt een betrouwbaar on-site rongalite-detectieplatform en kan bijdragen aan het oplossen van voedselzekerheidsproblemen.

Aptameren, enkelstrengs oligonucleotiden en oligopeptiden worden beschouwd als perfecte alternatieven voor antilichamen vanwege hun hoge specificiteit, gemakkelijke en reproduceerbare productie, gemakkelijke modificatie en minder immunogene respons [6]. Recente studies hebben het sterke potentieel van aptameren als bioprobes voor het richten van medicijnen, biosensing en de ontwikkeling van nieuwe medicijnen onthuld [7]. Elektrochemische [8] en enzymgekoppelde aptamer [9]-assays waarbij een aantal aptameren betrokken zijn, zijn ontwikkeld als een veelbelovend hulpmiddel voor de detectie van rongalite. Deze methoden hebben echter meestal te lijden van lange analysetijden en complexe procedures, die hun toepassingen belemmeren [10].

Lateral Flow Strip Assay (LFSA, ook wel striptest genoemd) werd voor het eerst ontwikkeld in 1956 als een logische uitbreiding van de latexagglutinatietesttechnologie [11]. Als een eenstapsbenadering heeft LFSA veel aandacht getrokken voor de detectie van meerdere analyten ter plaatse vanwege het gebruiksvriendelijke formaat, de lage productiekosten, het tijdbesparende gebruik en de stabiliteit op lange termijn onder een breed scala van omstandigheden [ 12]. Ondanks deze positieve eigenschappen zijn de praktische toepassingen van het op aptamer gebaseerde laterale stroomstripplatform nog niet gecommercialiseerd en zijn er slechts enkele op aptameer gebaseerde chromatografische stripassays gerapporteerd voor de detectie van rongalite in voedselmonsters [13] . Gezien het veelvuldig voorkomen van voedselveiligheidskwesties en het algemeen gebruik van rongalite als illegaal voedseladditief, is het noodzakelijk om een op aptameren gebaseerde LFSA te ontwikkelen voor de snelle detectie van deze verbinding ter plaatse in voedselmonsters.

Er kunnen twee typen aptamer-sensoren voor laterale stroomstroken worden ontwikkeld, namelijk competitieve en sandwich-type [14]. Het sandwich-type platform is zeer geschikt wanneer een paar aptameren beschikbaar zijn voor een specifiek doelmolecuul. In het huidige werk werden specifieke gouden nanodeeltjes (AuNP's), waarvan bekend is dat ze de meest veelbelovende nanomaterialen zijn voor de ontwikkeling van aptamersensoren (bijv. Fysisch-chemische eigenschappen), gebruikt voor de ontwikkeling van een aptamer-detecterende sonde met laterale stroom sandwichstrip. Ondertussen zijn aptamer-conjugatieprocessen eerder aangetoond op AuNP's via chemisorptie of fysieke adsorptie, wat een eenvoudig maar gevoelig platform biedt voor de aptamer-sensor die later werd gebruikt als een signaleringssonde in deze studie [15]. Vanwege de voordelen die zijn afgeleid van het gebruik van AuNP's en aptameren, werd een zichtbare, snelle, eenstaps en on-site laterale stroomtest ontwikkeld voor de analyse van rongalite in voedselmonsters. Om deze aptamersensor van het sandwichtype te bereiken, werden twee aptamer-sondes (A09/B09) gebruikt die dienst deden als invang- en signaleringssondes. De positieve resultaten van deze biosensor werden verder bevestigd door hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).

Methoden

Materialen en reagentia

Rongalite werd geleverd door Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. HAuCl₄ (trinatriumcitraatdehydraat) werd gekocht bij Sigma Aldrich (VS). NaCl, BSA, sucrose, formaline, PEG20000 en Tween20 waren van Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd.

NC-membranen (d.w.z. pall 90, pall 170 en Millipore 135) zijn van Pall Corporation en Millipore Corporation, afzonderlijk, en gekocht bij Jiening Biotech Company.

Voedselmonsters, ersi (dun gesneden vierkante rijstwafels in China), noedels, tofu en glucono-δ-lacton-tofu, werden gekocht op de nabijgelegen markten.

Aptameervoorbereiding via systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX)

Het SELEX-proces omvat de volgende stappen (Fig. 1):(i) incubatie van het doelwit met een willekeurige DNA-bibliotheek, (ii) isolatie van het aan het doelwit gebonden DNA, (iii) DNA-amplificatie door polymerasekettingreactie (PCR) , (iv) bereiding van enkelstrengs DNA's voor de bibliotheek van de volgende ronde, (v) herhaling van stappen i-iv gedurende 5-15 cycli met intervaltellerscreening met niet-doelstoffen om de niet-specifieke ssDNA's te verwijderen, en (vi) definitieve klonering en sequentiebepaling van de verrijkte bibliotheek [16].

Typisch aptamer selectie (SELEX) proces

De aptameren werden gescreend volgens de eerder beschreven stappen. In het kort werd een initiële ssDNA-aptameerbibliotheek gesynthetiseerd, bestaande uit 82-meer-nucleotiden met een centrale 40-gebaseerde lange gerandomiseerde sequentie van elk aptameer (Tsingke Biological Technology). De gerandomiseerde sequentie van de ssDNA-aptameerpool is 5′-GACATATTCAGTCTGACAGCG-N40-GATGGACGAATATCGTCTAGC-3′, waarbij N een gerandomiseerde nucleotide van A, G, C of T betekent.

In dit onderzoek werden primer 1 (5'-GACATATTCAGTCTGACAGC-3′) en primer 2 (5'-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3′) gebruikt voor amplificatie van de bibliotheek.

Om aptameren te screenen die specifiek binden aan rongalite, werd de gesynthetiseerde willekeurige ssDNA-bibliotheek met rongalite aan de plaat toegevoegd. Vervolgens werd het ongebonden ssDNA door wassen verwijderd; het gebonden ssDNA werd gewonnen en geamplificeerd door middel van PCR. De bindingsaffiniteit van aptameren nam geleidelijk toe naarmate de selectieronde toenam.

De specificiteit en K _d waarde van individuele aptameren werd op dezelfde manier bepaald als de methoden van Tang [17].

De aptamer-sequenties die in dit werk werden gebruikt, waren als volgt:

Primaire aptameer A09,

5′-Biotine-GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC
Secundaire aptameer B09,

5′-Biotine-GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3′

Deze aptamersequenties (A09 en B09) werden gesynthetiseerd en gekocht bij Tsingke Biological Technology.

Productie van AuNP's

AuNP's werden gesynthetiseerd via de citraatreductie van HAuCl₄ protocol [18]. Monodisperse productie van AuNP's met voldoende grootte werd bevestigd door UV/Vis-spectrofotometrie (Thermo Scientific™ Evolution 60S). Sferisch gevormde (ongeveer 40 nm in diameter) en dieprood gekleurde AuNP's werden gesynthetiseerd. De grootte van deze ongewijzigde AuNP's werd geschat met behulp van de wet van Beer-Lambert bij 530 ± 2 nm en transmissie-elektronenmicroscopie (Fig. 2) (JEOL Ltd. JEM-1011).

Het secundaire aptameer B09 geconjugeerd met AuNP's werd bereid door gerapporteerde protocollen te volgen [18]. In het kort werd 1 ml van de als voorbereide AuNP's geïncubeerd met 4 μL van de secundaire aptamer B09-oplossing (100 μM) en het mengsel werd gedurende ten minste 16 uur in een lade bij kamertemperatuur bewaard. Eén molair NaCl werd vervolgens druppelsgewijs aan het flesje toegevoegd door zachtjes met de hand te schudden totdat een eindconcentratie van 0,1 M in het mengsel werd bereikt. De injectieflacons werden vóór gebruik minimaal 1 dag in een lade bewaard. De ongeconjugeerde gethioleerde aptameren werden verwijderd door centrifugatie bij 12.000g gedurende 20 min bij 4 °C. De buisjes werden uit de centrifuge gehaald en er werd een heldere bovendrijvende vloeistof verkregen, waarbij de nanodeeltjes zich op de bodem van de buisjes bevonden. Het mengsel werd nog 5 minuten gecentrifugeerd in het geval van een rode kleursupernatant. Het supernatant werd voorzichtig afgepipetteerd en de nanodeeltjes werden uiteindelijk gedispergeerd in 1 ml 0,01 M PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) buffer (pH = 7.4) met 5% BSA, 5% sucrose, 1% PEG20000 en 0,05% Tween20.

Lateraal stroomstrookontwerp

De LFSA is ontworpen zoals weergegeven in figuur 3. In het kort bevatte de strip verschillende overlappende pads op een achtergrondkaartmonster (GF-08, 20 × 300 mm), goudconjugaat, nitrocellulose (NC) membraan (Pall 90, 60 × 300 mm) en absorptiekussens (H-5076, 20 × 300 mm). De lengte van de overlapping was 2 mm. Het monsterkussen werd ondergedompeld in een 0,01 M PBS-buffer (pH =-7,4) die 3% BSA en 0,05% Tween20 bevatte en vervolgens 2 uur bij 37 °C gedroogd. Het gouden conjugaatkussentje werd behandeld met een 0,01 M PBS-buffer (pH = 7.4) die 5% BSA, 5% sucrose, 1% PEG20000 en 0,05% Tween20 bevatte. De functionele AuNP's werden vervolgens met een sproeier (XYZ3010-1429) op het behandelde gouden conjugaatkussentje gespoten. Eén microliter biotine-A09-aptameer (10 M) werd gedurende 1 uur bij 4 ° C geïncubeerd met 10 μL streptavidine (1 mg / ml). Het met aptamer geconjugeerde streptavidine werd vervolgens bekleed met een dispenser (XYZ3010-1429) op een NC-membraan om de testlijn te vormen, terwijl streptavidine (1 mg/ml) werd bekleed met het instrument om de controlelijn te vormen. Daarna werd het behandelde NC-membraan 2 uur bij 37 ° C gedroogd voor immobilisatie. Ten slotte werden de stroken geassembleerd en werd de LFSA in stroken van 40 mm breed gesneden en tot gebruik een nacht bij 37 °C bewaard.

TEM-afbeeldingen van AuNP's (40 nm)

Typische configuratie van teststrips voor laterale stroming (sandwichformaat)

Specificiteitstest

Tachtig microliter van een rongalite-oplossing (10 μg / ml) werd toegevoegd aan het monsterkussen van de geassembleerde strips. Deze stap werd herhaald voor de andere tegendoelen, waaronder formaline en gedeïoniseerd water voor de specificiteitstesten. Als controle werd gedeïoniseerd water gebruikt. Er zou een rode lijn moeten verschijnen in het verwachte lijngebied. Elke controle werd twee keer herhaald.

Dosisafhankelijke test

Net als bij de specifieke test werden rongalite-oplossingen met verschillende concentraties (0,8, 1, 5 en 10 g/ml) bereid. Tachtig microliter van de rongalite-oplossing werd toegevoegd aan het monsterkussen van de geassembleerde strips. De waarneming van rode kleur binnen 15 min op de testlijn werd beschouwd als de criteria voor het bepalen van de detectielimiet.

Voedselmonstertest

Om de bruikbaarheid en nauwkeurigheid van deze nieuwe LFSA te evalueren, werden vijf voedselmonsters verzameld met mogelijk toegevoegde rongalite van een markt rond het instituut. Eén gram monster werd geëxtraheerd met 10 ml water. Vervolgens werd 80 L van elke monsterextractoplossing aangebracht op de op aptamer gebaseerde laterale stroomstrip voor de detectie van rongalite. Deze resultaten werden bevestigd door high-performance vloeistofchromatografie (HPLC).

Resultaten en discussie

De specificiteits- en dissociatieconstanten (K _d ) van de geselecteerde Aptamers

Verschillende concentraties A09- en B09-aptameren werden geïncubeerd met een vaste hoeveelheid rongalite. Verzadigingscurven die de gemeten absorptie bij 450 nm uitzetten tegen de overeenkomstige input-aptameerconcentratie worden getoond in figuur 4a. Niet-lineaire regressieanalyse werd gebruikt voor K _d waarde berekening. De K _d waarde van A09 is 61,12 ± 16,36 nM en B09 is 39,81 ± 12,73 nM. Zoals weergegeven in figuur 4b, is de bindingsaffiniteit tussen A09/B09 en rongalite hoog.

een Meting van de K _d waarde van A09 en B09. GraphPad Prism werd gebruikt om niet-lineaire uithardingsaanpassingsanalyses uit te voeren voor K _d berekening. b De specifieke bindingsaffiniteit tussen A09/B09 en rongalite

Specificiteit en gevoeligheid

Het aptameer A09 gelabeld met biotine (dat aptamer opvangt) werd gebonden aan streptavidine dat aanvankelijk op het membraan was aangebracht. Deze lijn werd gekozen als testlijn. Ondertussen werd streptavidine uitgelijnd op de controlezone.

Zoals getoond in Fig. 5a, zodra het AuNP secundaire aptameer (als een signaleringsprobe) is gebonden aan rongalite, wordt het primaire aptameer dat op de testzone is aangebracht, gebonden aan een andere plaats van deze verbinding. Een rode lijn gegenereerd door AuNP's zou op de testzone moeten verschijnen in geval van positieve analyse. Met betrekking tot het controle-experiment vangt het streptavidine op de controlezone het resterende AuNP-gelabelde B09-aptameer op dat is gemodificeerd met biotine, waardoor het te allen tijde een controlesignaal levert.

Specificiteit (a ) en gevoeligheid (b ) van LFSA voor rongalite. een 80 L van een rongalite-oplossing (10 μg/ml) werd toegevoegd aan het monsterkussen van de geassembleerde strips. Deze stap werd herhaald voor de andere tegendoelen, inclusief formaline voor de specificiteitstesten. Als controle werd gedeïoniseerd water gebruikt. b Rongalite-standaardoplossingen met verschillende concentraties (0, 0,8, 1, 5 en 10 g / ml) werden bereid. 80 μL van de standaardoplossingen werd naar het monsterkussentje gepipetteerd en de waarneming van rode kleur binnen 15 min op de testlijn werd beschouwd als de criteria voor het bepalen van de detectielimiet

Zoals weergegeven in figuur 5b, laat het resultaat zien dat rongalite gemakkelijk met het blote oog werd gedetecteerd bij concentraties van slechts 1 μg/ml.

Deze voedselmonsters zijn geanalyseerd via de hierin ontwikkelde LFSA, en de resultaten zijn weergegeven in Tabel 1.

Interessant is dat de controlelijn niet na elke LFSA werd gehandhaafd. Hoge concentraties rongalite of zoutionen kunnen resulteren in een zwak signaal op de controlezone. Daarom heeft de samenstelling van de resuspenderende buffer een kritische invloed op de prestatie van de striptest. Volgens de verkregen resultaten werd een 0,01 M PBS-buffer (pH = 7,4) gekozen die 5% BSA, 5% sucrose, 1% PEG20000 en 0,05% Tween20 bevatte als de resuspenderende buffer.

De samenstelling van de verschillende pads heeft een dramatisch effect op de prestaties van de stripassay. Van de verschillende alternatieven bleek NC-membraan de meest geschikte vaste drager te zijn voor de adsorptie en hybridisatie van nucleïnezuren. NC is op grote schaal gebruikt als signaalpad in laterale stroomstrips, omdat het voldoende stroomsnelheden biedt [19]. Verschillende soorten NC-membranen met respectieve stroomsnelheden kunnen geschikt zijn voor deze testen. In dit werk werden drie veelgebruikte NC-membranen (d.w.z. pall 90, pall 170 en Millipore 135), gekocht bij Jiening Biotech Company, getest. Pall 90 werd hierin gekozen als het meest geschikte NC-membraan voor LFSA.

Er was een groot aantal technologieën ontwikkeld voor de detectie van rongalite. Er zijn er echter maar weinig die op grote schaal zijn toegepast bij de detectie ter plaatse, voornamelijk vanwege de bijbehorende hoge kosten en complexe protocollen, zoals GC en HPLC, die omslachtig zijn voor de dagelijkse operator. LFSA, een eenstapsbenadering, is een perfect platform geworden dankzij het gebruiksvriendelijke formaat, de lage productiekosten en het gemak. Ondanks de slechtere gevoeligheid dan chromatograafstrips, zou LFSA een veelbelovende methode zijn op het gebied van point-of-care-tests.

LFSA heeft nog steeds een lagere gevoeligheid dan chromatograafstrips. Bovendien vertonen LFSA-technologieën die gebruik maken van aptameren enkele inherente voordelen ten opzichte van laterale-flow-immunoassay (LFIA, op antilichamen gebaseerde methode) en dit ongeacht de recente vorderingen op dit gebied. Hoewel vergelijkbare testen ook kunnen worden ontworpen met behulp van antilichamen, bieden aptamer-sensoren stabiliteit en goedkope voordelen. Bovendien zijn aptameren flexibeler voor het ontwikkelen van verschillende formaten omdat ze zijn samengesteld uit nucleïnezuren met intra- en intermoleculaire hybridisatie, enzymatische replicatie en gemakkelijke sequentiebepalingskenmerken. Dankzij deze positieve eigenschappen zijn er talrijke aptamer-sensoren ontwikkeld voor multiplex-assays.

Bovendien kan LFSA verschillende labels gebruiken, waaronder recent ontwikkelde quantum dots [20] en upconverting fosfors [21]. Van alle gerapporteerde labels worden AuNP's echter het meest gebruikt voor LFSA. De meest opmerkelijke eigenschap van het Au-label ligt in het vermogen om het NC-membraan te kleuren, waardoor directe observatie met het blote oog mogelijk is. Dit kenmerk onderscheidt LFSA van de huidige dure laboratoriummethoden, waardoor deze technologie een handig analytisch hulpmiddel is.

Point-of-care testen (POCT) is voorgesteld als een ideaal hulpmiddel om de kosten van deze testen te verlagen. Het LFSA-biosensorplatform, de meest bekende test, wordt momenteel gebruikt voor POCT [22]. Het LFIA-biosensorplatform omvat voornamelijk sandwich- en competitieve (of inhibitie) formaten. In het algemeen zijn de sandwichformat-assays ontworpen in het geval van doelmoleculen met ten minste twee epitopen. Hierin werd een tweevoudig aptameer dat op twee verschillende bindingsplaatsen aan rongalite is gebonden, ontwikkeld dat invang- en signaleringsprobes bevat die zijn samengesteld in het sandwich-type formaat.

Conclusies

Een gemakkelijke en goedkope LFSA met een sandwich-formaat is met succes ontwikkeld voor een snelle detectie van rongalite ter plaatse. De test omvatte een aantal aptameren geconjugeerd met AuNP's. Na het optimaliseren van enkele belangrijke parameters, leverde de ontwikkelde test een hoge gevoeligheid op met detectiegrenswaarden van slechts 1 μg/ml. Deze technologie zou gemakkelijk kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de besmetting van voedselmonsters met rongalite. Deze test biedt een betrouwbaar on-site rongalite-detectieplatform en kan bijdragen aan het oplossen van voedselzekerheidsproblemen.