Snelle on-site detectie van rongalite in voedsel met een aptamer-gebaseerde sandwich laterale stroomstrooktoets

Samenvatting

We presenteren een snelle, gebruiksvriendelijke laterale stroomstrooktoets (LFSA) die twee hoogst specifieke aptamers - A09 en B09 - functioneel maakt met goudnanodeeltjes (AuNPs) om rongalite te detecteren, een gevaarlijk reagent dat incidenteel als voedseladditief gebruikt wordt. De biotine-gemarkeerde A09-aptamer wordt geïmmobiliseerd op een streptavidine-gecoate nitrocellulose-membraan als de vangstprobe, terwijl de AuNP-geconjugeerde B09-aptamer fungeert als de signaleringsprobe. De toets levert een duidelijke rode lijn op de testzone voor rongalite-concentraties zo laag als 1 µg mL⁻¹, waarneembaar met het blote oog binnen 15 minuten, wat het ideaal maakt voor on-site screening van landbouw- en voedselproducten.

Achtergrond

Rongalite (natriumhydroxymethylsulfinate) wordt breed toegepast in industriële verfverving en polymerechemie als reducerend middel. Echter, de ongewilde of opzettelijke toevoeging aan voedselproducten heeft ernstige gezondheidsbezorgdheden veroorzaakt, waaronder formaldehydevrijlating en nadelige effecten gerapporteerd in China. Betrouwbare, snelle detectiemethoden zijn daarom essentieel om voedselveiligheid en volksgezondheid te beschermen.

Aptamers - enkelstrengs DNA- of RNA-moleculen - bieden duidelijke voordelen ten opzichte van antilichamen: ze worden chemisch gesynthetiseerd met hoge batch-consistentie, vertonen lage immunogeniciteit en kunnen gemakkelijk gemodificeerd worden voor diverse sensing-platforms. Hoewel electrochemische en enzyme-gekoppelde aptamertoetsen voor rongalite bestaan, vereisen ze vaak complexe instrumentatie en langdurige analysetijden. Integenstelling, laterale stroomstrooktoetsen (LFSAs) bieden een single-stap, draagbare en laag-kost oplossing geschikt voor point-of-care testen.

Tot nu toe hebben slechts een handvol aptamer-gebaseerde chromatografische strooktoetsen rongalite getarget. Gegeven de groeiende regulatorische controle en de prevalentie van illegale additieven, hebben we een sandwich-formaat LFSA ontwikkeld dat de specificiteit van twee aptamers en de optische helderheid van AuNPs benut, wat snelle, on-site detectie van rongalite in diverse voedselmatrices mogelijk maakt.

Methoden

Materialen en reagentia

Rongalite werd bezorgd door Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Goud(III)chloride trihydraat (HAuCl₄) en natriumcitraat werden gekocht van Sigma-Aldrich (VS). Ondersteunende reagentia (NaCl, BSA, saccharose, PEG₂₀₀₀₀, Tween-20) werden verkregen van Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd. Nitrocellulose (NC) membranen (Pall 90, Pall 170, Millipore 135) werden geleverd door Pall Corporation en Millipore Corporation via Jiening Biotech Company. Voedselmonsters - waaronder rijstkoek (ersi), noedels, tofu, en glucono-δ-lacton tofu - werden verzameld van lokale markten.

Aptamerbereiding via SELEX

Het systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) protocol werd gevolgd om aptamers met hoge affiniteit voor rongalite te isoleren. De initiële 82-mer ssDNA-bibliotheek (5'-GACATATTCAGTCTGACAGCG-N₄₀-GATGGACGAATATCGTCTAGC-3') werd geïncubeerd met rongalite, ongebonden sequenties werden weggewasen, en gebonden aptamers werden geamplificeerd door PCR. Na 12 verrijkingscycli - inclusief counter-selectie tegen structureel gerelateerde verbindingen - leverde klonale sequencing twee hoge-affiniteit aptamers op: A09 en B09. Hun sequenties worden hieronder vermeld en werden gesynthetiseerd door Tsingke Biological Technology.

• Primaire aptamer A09 (biotine-gemarkeerd): 5'-Biotine-GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC
• Secondaire aptamer B09 (biotine-gemarkeerd): 5'-Biotine-GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3'

Productie van AuNPs

Goudnanodeeltjes (~40 nm diameter) werden gesynthetiseerd door citraatreductie van HAuCl₄ volgens een standaardprotocol. Grootte en monodispersiteit werden bevestigd door UV/Vis-spectroscopie (λ_max ≈ 530 nm) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). De secundaire aptamer B09 geconjugeerd aan AuNPs door 1 mL AuNP-oplossing te incuberen met 4 µL van 100 µM B09, gevolgd door zout-geïnduceerde precipitatie, centrifugatie, en heroplossing in 1 mL PBS (pH 7,4) bevattende 5% BSA, 5% saccharose, 1% PEG₂₀₀₀₀, en 0,05% Tween-20.

Laterale stroomstrookontwerp

De LFSA-assemblage omvatte een monsterpad, goudconjugaatpad, NC-membraan (Pall 90) en absorberend pad op een rugkaart. Het monsterpad was voorbehandeld met PBS + 3% BSA + 0,05% Tween-20 en gedroogd bij 37 °C gedurende 2 uur. Het goudconjugaatpad ontving de B09-AuNPs. De testlijn op het NC-membraan werd gecreëerd door 1 µL biotine-A09 (10 µM) gemengd met 10 µL streptavidine (1 mg mL⁻¹) te spotten gedurende 1 uur bij 4 °C, terwijl de controllijn bestond uit alleen streptavidine. Na drogen werd de strook in 40 mm secties gesneden en overnacht opgeslagen bij 37 °C.

Specificiteitstoets

Teststrips werden geconfronteerd met 80 µL van 10 µg mL⁻¹ rongalite, formaline, of gedemineraliseerd water. Het verschijnen van een duidelijke rode testlijn bevestigde specificiteit, terwijl de controllijn zichtbaar bleef onder alle condities.

Dose-afhankelijke toets

Rongalite-concentraties (0, 0,8, 1, 5, 10 µg mL⁻¹) werden bereid in PBS en 80 µL werd toegepast op het monsterpad. Een zichtbare rode lijn binnen 15 min definieerde de detectielimiet, die waargenomen werd bij 1 µg mL⁻¹.

Voedselmonstertoets

Vijf voedselmonsters verdacht van rongalite-bevatting werden geëxtraheerd (1 g + 10 mL water). Na filtratie werd 80 µL van elk extract getest op de LFSA. Resultaten wurden gekruisvalideerd door hoge-prestatie vloeistofchromatografie (HPLC).

Resultaten en discussie

Affiniteit en specificiteit van aptamers

Niet-lineaire regressie van verzadigingscurven leverde dissociatieconstanten van 61,1 ± 16,4 nM voor A09 en 39,8 ± 12,7 nM voor B09 op, wat sterke, specifieke binding aan rongalite bevestigt.

Toetsprestaties

De sandwich LFSA produceert een rode testlijn wanneer AuNP-B09 rongalite bindt en gevangen wordt geïmmobiliseerd A09. De controllijn, gevormd door streptavidine die excess AuNP-B09 bindt, bevestigt de toetsintegriteit. Specificiteitstoetsing tegen formaline en gedemineraliseerd water leverde geen false-positieven op, en de detectielimiet werd vastgesteld op 1 µg mL⁻¹ - goed onder de niveaus gerapporteerd in gecontamineerde voedselmonsters.

Voedselmonsteranalyse bevestigde de aanwezigheid van rongalite in diverse producten, bevestigd door HPLC (Tabel 1). De robuustheid van de toets werd toegeschreven aan de geoptimaliseerde buffer (PBS pH 7,4 + 5% BSA + 5% saccharose + 1% PEG₂₀₀₀₀ + 0,05% Tween-20) en de selectie van Pall 90 NC-membraan, wat optimale stroom en minimale niet-specifieke binding bood.

Vergeleken met chromatografische methoden (GC, HPLC), biedt de LFSA vergelijkbare gevoeligheid terwijl de noodzaak voor geavanceerde instrumentatie en uitgebreide verwerkingstijden wordt geëlimineerd. De lage kost, single-stap operatie en visuele uitlezing maken het ideaal voor on-site voedselveiligheidsinspecties en regelgevingscompliance.

Conclusies

We hebben een betrouwbare, kosteneffectieve sandwich-formaat LFSA ontwikkeld die rongalite in voedselmatrices detecteert met een limiet van 1 µg mL⁻¹. De toets benut de specificiteit van dubbele aptamers en de optische helderheid van AuNPs, wat directe, on-site screening mogelijk maakt. Dit platform kan een cruciale rol spelen in het mitigeren van voedselbedingde rongalite-contaminatie en het beschermen van de volksgezondheid.

Afkortingen

AuNPs:

Goudnanodeeltjes

HPLC:

Hoge-prestatie vloeistofchromatografie

LFIA:

Laterale stroom immunoassay

LFSA:

Laterale stroomstrooktoets

NC-membraan:

Nitrocellulose-membraan

POCT:

Point-of-care testen

SELEX:

Systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie