Fluorescerende SnO₂/SiO₂ nano-adsorberende middelen voor hoge-efficiënte GST-getagde proteïne afvang

Samenvatting

We rapporteren een gemakkelijke, hydrothermale gesynthetiseerde thiol-gefuntionaliseerde silica nanobol (SiO₂-SH) platform dat vervolgens versierd wordt met SnO₂ kwantumdots (QDs). De resulterende SnO₂/SiO₂ composiet nanobollen (NSs) vertonen sterke, zichtbaar-licht-responsieve fluorescentie, wat real-time tracking van proteïne afvang mogelijk maakt. Functionalisatie met gereduceerd glutathion (GSH) converteert de NSs in SnO₂/SiO₂-GSH, wat specifiek glutathion S-transferase (GST)-getagde proteïnen bindt. Toegepast op E. coli lysaten, vertonen de nano-adsorberende middelen verwaarloosbare niet-specifieke adsorptie, een proteïne bindingscapaciteit van 7,4 mg g⁻¹, en behouden de redox toestand en peroxidase activiteit van geïsoleerde glutathion peroxidase 3 (GPX3). Deze eigenschappen positioneren SnO₂/SiO₂-GSH NSs als een veelbelovend hulpmiddel voor snelle, hoge-opbrengst zuivering van GST-getagde proteïnen.

Achtergrond

Efficiënte proteïne zuivering is de basis voor vooruitgang in geneesmiddelen metabolisme, structurele biologie en vaccinontwikkeling. Traditionele chromatografische en neerslagmethoden zijn arbeidsintensief en compromitteren vaak de proteïne integriteit. Affiniteit zuivering, die de natuurlijke interactie tussen GST en zijn ligand benut, blijft de gouden standaard voor recombinante proteïnen met een GST tag. Echter, conventionele GST-affiniteit harsen (bijv. Glutathion Sepharose 4B) lijden onder beperkte bindingscapaciteit, hoge kosten en gebrek aan intrinsieke visuele rapportage.

Nanomaterialen kunnen deze beperkingen overwinnen door hoge oppervlakte, instelbare chemie en, wanneer passend ontworpen, optische handtekeningen. SnO₂ QDs zijn aantrekkelijk voor bio-toepassingen: ze zijn chemisch stabiel, biocompatibel en vertonen defect-geïnduceerde fluorescentie die benut kan worden voor imaging. Door SnO₂ QDs op silica nanobollen te ankeren, creëerden we een dubbele-functie platform dat affiniteit afvang koppelt met fluorescentie monitoring.

Experimenteel

Materialen en algemene procedures

Alle reagentia waren analytische graad en werden zonder verdere zuivering gebruikt. Belangrijke reagentia omvatten CTAB, SnCl₄·5H₂O, TEOS, MPS en GSH. De SnO₂ QDs werden bereid via een hydrothermale methode, gevolgd door oppervlaktehechting aan SiO₂-SH NSs en daaropvolgende GSH conjugatie.

Synthese van SnO₂ kwantumdots

SnCl₄·5H₂O (3,5 g) werd opgelost in 50 ml H₂O; ammonia (5 ml) werd toegevoegd om Sn(OH)₄ te neerslaan, dat gewassen en herdispergeerd werd in 30 ml H₂O. De pH werd aangepast tot 12 met 2 M NH₄OH, daarna overgebracht naar een Teflon-uitgeklede autoklaaf en verwarmd bij 150 °C gedurende 24 uur. Het resulterende product werd verzameld, gewassen met ethanol-isopropanol (1:1), en gedroogd om SnO₂ QDs (~5 nm diameter) op te leveren.

Fabricage van SnO₂/SiO₂-SH nanobollen

SnO₂ QDs (0,2 g) en CTAB (0,09 g) werden gedispergeerd in een water-ethanol mengsel (42,5 ml + 7 ml). TEA (2,7 ml) werd toegevoegd, gevolgd door TEOS (3,5 ml) en MPS (0,35 ml) onder roeren bij 60 °C gedurende 5 uur. Het mengsel werd gecentrifugeerd, gewassen met HCl-ethanol en water, en herdispergeerd om SnO₂/SiO₂-SH NSs te produceren (~460 nm diameter).

GSH functionalisatie

SnO₂/SiO₂-SH NSs (4 ml, 0,12 g ml⁻¹) werden geïncubeerd met GSH (16,7 mg ml⁻¹) in PBS (pH 7,4) bij 37 °C gedurende 24 uur. Na centrifugatie en wassen, werden de SnO₂/SiO₂-GSH NSs opgeslagen in 25% ethanol bij 4 °C.

Affiniteit afvang van GST-getagde proteïnen

GST-getagde GPX3, OST1 en ABI2 werden geëxprimeerd in E. coli BL21(DE3) vanuit pGEX-6p1 constructen. Cellysaten (pH 7,4, 0,01 M) werden gemengd met SnO₂/SiO₂-GSH NSs (1 ml) en geroteerd bij 4 °C gedurende 2 uur. Na centrifugatie en wassen, werden gebonden proteïnen geëlueerd met 0,5 M GSH, gekwantificeerd door BCA assay en geanalyseerd door SDS-PAGE.

GPX3 activiteitsassay

Gezuiverde GPX3 werd de-getagd met PreScission protease en getest voor peroxidase activiteit door NADPH verbruik te monitoren bij 340 nm in de aanwezigheid van thioredoxine, thioredoxine reductase en H₂O₂.

Redox toestand analyse

GPX3 monsters werden behandeld met H₂O₂ en DTT, daarna gescheiden op non-reducerend 15% SDS-PAGE om geoxideerde en gereduceerde vormen te differentieren.

Karakterisatie

Morfologie en samenstelling werden onderzocht door TEM (JEM-2010) en SEM (JSM 5600LV). XRD patronen werden opgenomen op een X'Pert Philips diffractometer. Fluorescentiespectra werden gemeten met een FluoroSENS spectrometer (excitatie 260 nm). Proteïne zuiverheid werd beoordeeld door SDS-PAGE (Power PAC 300). BCA assays werden uitgevoerd met de Beijing CoWin kit.

Resultaten en discussie

Morfologie, kristalliniteit en fluorescentie van de nano-adsorberende middelen

De SnO₂ QDs vertoonden een monodisperse, ~5 nm sferische morfologie met een roosterafstand van 0,29 nm (110) vlak, wat hun hoge kristalliniteit bevestigt (Fig. 1). XRD matched met de cassiteriet fase (JCPDS 41-1445). De composiet SnO₂/SiO₂-GSH NSs behielden een sferische vorm (~430 nm) met een matig ruw oppervlak, zoals gezien in SEM en TEM beelden (Fig. 2). De aanwezigheid van SnO₂ QDs op SiO₂ wordt bevestigd door TEM (Fig. 2c,d).

Fluorescentieanalyse onthulde een sterke emissiepiek bij 368 nm, toeschrijfbaar aan zuurstofvacature defecten in SnO₂ (Fig. 3b). Fluorescentie-imaging van de NSs na proteïne afvang (Fig. 3c) toonde intacte luminescentie, wat visuele tracking van gebonden complexen mogelijk maakt.

Proteïne afvang efficiëntie

SDS-PAGE van GST-GPX3 afgevangen door SnO₂/SiO₂-GSH NSs toonde duidelijke verrijking van het doelwit proteïne (Fig. 4a). Toenemende eluatie GSH concentraties (10–100 mM) lieten het gebonden proteïne progressief vrij, wat de specificiteit van de GSH-GST interactie bevestigt. De nano-adsorberende middelen vertoonden verwaarloosbare niet-specifieke binding aan de bulk E. coli lysaat.

Herbruikbaarheidstesten onthulden dat de NSs hun bindingscapaciteit behielden over drie opeenvolgende afvangcycli (Fig. 4b), wat hun robuustheid benadrukt.

Uitbreiding van de benadering naar andere GST-getagde proteïnen (OST1, ABI2) leverde vergelijkbare resultaten op (Fig. 5). Bindingscapaciteiten waren 7,4 mg g⁻¹ (GPX3), 7,1 mg g⁻¹ (OST1) en 6,8 mg g⁻¹ (ABI2), wat commerciële Glutathion Sepharose 4B (7,1, 6,9, 5,6 mg ml⁻¹, respectievelijk) overtreft.

Behoud van GPX3 redox toestand en activiteit

Na GST verwijdering, behield GPX3 zowel geoxideerde als gereduceerde vormen, zoals bewijzen door duidelijke migratie op non-reducerend SDS-PAGE (Fig. 6a). De peroxidase activiteitsassay (Fig. 6b) toonde aan dat GPX3 geïsoleerd via SnO₂/SiO₂-GSH NSs activiteit vertoonde vergelijkbaar met die verkregen met commercieel hars, wat bevestigt dat de nano-adsorberende middelen de enzymatische functie behouden.

Conclusies

We hebben een fluorescerende, silica-beschermde SnO₂ kwantumdot nano-adsorberend middel ontwikkeld dat GST-getagde proteïnen afvangt met hoge specificiteit en capaciteit, terwijl hun native redox toestand en enzymatische activiteit behouden blijven. Het platform's robuuste herbruikbaarheid, superieure bindingsprestaties en intrinsieke fluorescentie maken het een aantrekkelijke alternatief voor conventionele affiniteit harsen voor snelle proteïne zuivering.

Afkortingen

ABI2:

ABA insensitive 2

CTAB:

Hexadecyltrimethyl ammonium bromide

DTT:

Dithiothreitol

GPX3:

Glutathion peroxidase 3

GSH:

Gereduceerd glutathion

GST-getagd:

Glutathion S-transferase-getagd

MPS:

3-Mercaptopropyl-trimethoxysilaan

NADPH:

Dihydronicotinamide adenine dinucleotide fosfaat

OST1:

Open stomata 1

QDs:

Kwantumdots

SDS-PAGE:

Natrium dodecylsulfate polyacrylamide gel electroforese

SEM:

Scanning elektronenmicroscopie

SiO₂-SH NSs:

Thiol-gefuntionaliseerde silica nanobollen

SnCl₄:

Tin (IV) chloride

TEA:

Triethylamine

TEM:

Transmissie elektronenmicroscopie

TEOS:

Tetraethyl orthosilicaat

XRD:

Röntgendiffractie