Efficiënte Chlorin e6 opname en verbeterde energie-overdracht in PS-PPO-PNIPAM hybride nanodeeltjes

Samenvatting

Polystyreen (PS) nanodeeltjes gedopt met difenyloxazol (PPO) en afgekapt met een gekruisde poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAM) schil vormen PS-PPO-PNIPAM hybride nanosystemen (NS). Fluorescentiestudies van chlorin e₆ toegevoegd aan deze NS tonen efficiënte elektronische excitatie-energie-overdracht (EEET) van zowel de PS kern als de ingebedde PPO naar de chlorin e₆ acceptor. EEET efficiëntie neemt scherp toe binnen het eerste uur na chlorin e₆ toevoeging, wat aangeeft dat PNIPAM de sensitizer gedurende deze tijd blijft incorporeren. Verhitting van de PS-PPO-PNIPAM-chlorin e₆ NS van 21 °C tot 39 °C verhoogt EEET verder, consistent met de thermisch geïnduceerde instorting van het PNIPAM netwerk dat de donor-acceptor afstanden verkort. Niettemin, associeert slechts een bescheiden fractie van vrij chlorin e₆ met PNIPAM, wat suggereert dat additionele optimalisatie gewenst is.

Achtergrond

De primaire beperking van fotodynamische therapie (PDT) voor kanker is de ondiepe penetratie van het excitatielicht in weefsel. Röntgen-gedreven fotodynamische therapie (X-PDT) biedt een oplossing, aangezien röntgenstraling diep penetreert en sensitizers kan activeren die enkeltozuurstof genereren bij röntgen-excitatie. De sleutel tot X-PDT is efficiënte elektronische excitatie-energie-overdracht (EEET) tussen een scintillerend component en een sensitizer. Strategieën om optimale donor-acceptor nabijheid te behouden omvatten chemische conjugatie, electrostatische aantrekking, surfactantlagen of polymerschillen. In eerdere werk onderzochten we EEET in PS-PPO-chlorin e₆ nanodeeltjes, waar chlorin e₆ gehecht was aan PS-PPO via een natrium dodecyl sulfaat schil.

Poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAM) is een stimulus-responsief polymeer dat een conformationele overgang ondergaat boven zijn lagere kritische oplossingstemperatuur (LCST) van 32 °C, wordt meer hydrofoob en krimpt. Voor gekruisde PNIPAM is de LCST hoger, wat temperatuur-gedreven grootteveranderingen bij fysiologische temperaturen toestaat. We produceerden PS-PPO nanodeeltjes omhuld door een gekruisde PNIPAM schil, wat resulteerde in PS-PPO-PNIPAM hybride NS. We onderzochten of deze schil chlorin e₆ kan ankeren en of de temperatuur-afhankelijke instorting van PNIPAM de donor-acceptor afstanden kan verkleinen, waardoor EEET en tumorcel-dodende efficiëntie verhoogd worden.

Experimenteel

Materialen

Styreen (ST, Oekraïne) van p.a. kwaliteit werd gezuiverd via standaardmethoden vóór polymerisatie. N-Isopropylacrylamide (NIPAM, Sigma-Aldrich Inc.), N,N'-methylenebisacrylamide (BIS, Sigma-Aldrich Inc.), kaliumpersulfaat (K₂S₂O₈, KPS, Oekraïne), natriumfosfaat monobasisch dehydraat (NaH₂PO₄ × 2H₂O, Oekraïne) en anionisch surfactant natrium dodecyl sulfaat (SDS, Sigma-Aldrich Inc.) waren reagentgraad en werden zonder verdere zuivering gebruikt. Chlorin e₆ (Frontier Scientific Inc.) werd vriendelijk geleverd door T.Y. Ohulchanskyy (Instituut voor Lasers, Fotonië en Biofotonica, State University of New York te Buffalo). Een 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7,2) diende als oplosmiddel.

Synthese en karakterisatie van nanosystemen

PS-co-PNIPAM kern nanodeeltjes gedopt met PPO werden eerst bereid door microemulsie polymerisatie. Kort: 0,2 g NIPAM, 0,2 g SDS en 0,01 g NaH₂PO₄ × H₂O werden opgelost in 90 g H₂O. Vervolgens werd 0,09 g PPO opgelost in 1,8 g styreen en druppelgewijs toegevoegd over 30 min. Het mengsel werd gerold bij 700 toer/min, gespuugd met Ar gedurende 30 min, en vervolgens verwarmd tot 70 °C. 0,01 g K₂S₂O₈ opgelost in 1 ml H₂O initieerde de polymerisatie. Na 4 uur bij 70 °C werd een kruislingstap uitgevoerd door 0,69 g NIPAM en 0,06 g BIS in aqueous oplossing toe te voegen, gevolgd door 3 uur bij 70 °C en 1 uur bij 90 °C. Het product werd afgekoeld tot kamertemperatuur en 48 uur gedialyseerd tegen een celluloses membraan (MWCO 3500 Da).

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) beelden (Fig. 2) bevestigen dat de hybride NS bestaan uit meerdere PS-PPO kernen gebonden door een gekruisde PNIPAM netwerk.

Spectrale metingen en monsterbereiding

Absorptiespectra werden opgenomen met een Specord M40 spectrofotometer (Carl Zeiss, Duitsland). Fluorescentie excitatie- en emissiespectra werden verkregen met een Cary Eclipse fluorimeter (Varian, Australië). Alle metingen werden uitgevoerd in 1 × 1 cm kwarts cellen bij kamertemperatuur. De PS-PPO-PNIPAM oplossing werd 100-voudig gedilueerd in Tris-HCl buffer. Een 10 mM chlorin e₆ voorraad in DMF werd gedilueerd tot 1 mM in buffer, en 2 µM eindconcentratie chlorin e₆ werd toegevoegd aan de NS oplossing (DMF ≤ 0,02%). Fluorescentie excitatie- en emissiespectra werden verzameld op 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 en 100 min na toevoeging, met verzadiging bereikt na ≈ 80 min.

Voor temperatuur-afhankelijke studies werd de NS oplossing met chlorin e₆ in een thermostate houder geplaatst (T = 23 °C). Na ≈ 88 min verzadiging werd het monster verwarmd tot 39 °C (boven de LCST van gekruisde PNIPAM). Fluorescentie excitatiespectra (chlorin e₆ emissie bij 680 nm) werden op intervallen na verwarmen opgenomen. De conformationele overgang van PNIPAM begon ≈ 3 min na verwarmen, met coagulatie na ≈ 18 min – reversibel bij afkoeling. Experimenten werden driemaal herhaald met consistente resultaten.

Resultaten en discussie

Absorptie, fluorescentie excitatie- en emissiespectra van de PS-PPO-PNIPAM NS in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7,2) worden getoond in Fig. 3. Het absorptieprofiel toont styreen (≈ 260 nm) en PPO (≈ 307 nm) banden. Fluorescentie excitatie bij 250 nm (styreen absorptie) levert PPO emissie op bij 367 nm, wat nabije-complete EEET van styreen naar PPO bevestigt. Het excitatiespectrum van PPO (380 nm emissie) illustreert verder de bijdrage van de styreenband. Vibratie structuur in de PPO emissie, afwezig in aqueous PPO, bevestigt de incorporatie in de PS matrix.

Na toevoeging van chlorin e₆ (2 µM), blijft het absorptiespectrum grotendeels onveranderd (Fig. 4), behalve voor een lichte reductie in piekoptische dichtheid. Integenstelling, chlorin e₆ toevoeging induceert een duidelijke kwelling van PPO fluorescentie, die intensifieert over ongeveer één uur (Fig. 5). Deze kwelling resulteert uit zowel EEET (donor-naar-acceptor energieoverdracht) als herabsorptie (donor emissie overlappend met acceptor absorptie). Initieel domineert herabsorptie, maar naarmate de tijd vordert, wordt EEET de primaire bijdrager.

Chlorin e₆ emissie verschijnt bij PS excitatie bij 250 nm, verschuift naar langere golflengtes over tijd en bereikt verzadiging na ≈ 60 min (Fig. 6). Deze rode verschuiving geeft de invloed van de PNIPAM omgeving op gebonden chlorin e₆ moleculen aan. Excitatie bij chlorin e₆'s eigen Soret band (400 nm) produceert slechts kleine veranderingen in emissie, wat benadrukt dat een klein fractie van chlorin e₆ vrij in oplossing blijft.

Het excitatiespectrum van chlorin e₆ (emissie bij 680 nm) toont een zwakke PS-PPO band initieel die intensifieert over tijd (Fig. 7), wat de toegenomen EEET van de donor naar de acceptor weerspiegelt. De PS-PPO band blijft zwak in het excitatiespectrum opgenomen bij chlorin e₆ emissie (660 nm) zelfs na 100 min, wat bevestigt dat de meeste energieoverdracht plaatsvindt via de PS-PPO donor.

Samen tonen deze resultaten aan dat chlorin e₆ het PNIPAM netwerk penetreert, wat EEET van PS en PPO naar de sensitizer mogelijk maakt. EEET efficiëntie stijgt tijdens het eerste uur van incubatie en kan verder verhoogd worden door het systeem te verwarmen boven de LCST van gekruisde PNIPAM, wat het polymere netwerk inkrimpt en de donor-acceptor afstanden verkort.

Eerdere studies hebben getoond dat PS-PPO nanodeeltjes PPO fluorescentie emitteren onder röntgen-excitatie, wat suggereert dat de hier waargenomen EEET onder UV-verlichting ook zou opereren onder röntgenbestraaling. Echter, het detecteren van röntgen-geïnduceerde emissie vereist meestal hoge NP concentraties; het incorporeren van zware-atomen-bevattende moietes kan de röntgenabsorptie verhogen en de gevoeligheid verbeteren.

In het temperatuur-afhankelijke experiment (Fig. 8-9), verwarmen van 23 °C tot 39 °C (na verzadiging) veroorzaakte eerst een bescheiden daling in de I_ex320/I_ex404 ratio (van 0,90 tot 0,85), mogelijk weerspiegeld verminderde chlorin e₆-PNIPAM affiniteit. Vervolgens steeg de ratio tot 1,02, samenvallend met verhoogde lichtverstrooiing – indicatief voor PNIPAM instorting en nader donor-acceptor nabijheid, waardoor EEET verhoogd wordt.

Samenvattend, de PS-PPO-PNIPAM hybride NS faciliteren chlorin e₆ opname en EEET, met efficiëntie toenemend over ~1 uur incubatie en verder stijgend bij verwarmen boven LCST. Niettemin, bindt slechts een beperkt fractie van chlorin e₆ aan PNIPAM, wat de noodzaak voor toekomstige optimalisatie benadrukt.

Conclusies

Fluorescentieanalyse bevestigt dat chlorin e₆ geïncorporeerd is in PS-PPO-PNIPAM hybride NS en dat EEET van de PS matrix en ingebedde PPO naar chlorin e₆ optreedt. Opname verzadigt na ongeveer één uur. Verhitting van het systeem van 21 °C tot 39 °C verhoogt EEET verder, consistent met de thermisch gedreven instorting van de gekruisde PNIPAM schil, die donor en acceptor dichter bij elkaar brengt. Hoewel slechts een bescheiden hoeveelheid chlorin e₆ gebonden blijft aan PNIPAM, ondersteunen deze bevindingen het potentieel van dergelijke hybride NS in röntgen-gedreven fotodynamische therapie en rechtvaardigen verder onderzoek om sensitizer lading te verbeteren.

Afkortingen

EEET:

Elektronische excitatie-energie-overdracht

LCST:

Lagere kritische oplossingstemperatuur

NS:

Nanosysteem

PNIPAM:

Poly-N-isopropylacrylamide

PPO:

Difenyloxazol

PS:

Polystyreen

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie