“Testen, testen, testen!” is een veelgeprezen slogan voor het beheersen van de COVID-19-pandemie. De Wereldgezondheidsorganisatie en andere federale/overheidsinstanties over de hele wereld hebben allemaal deze bekende slogan gepubliceerd. Het snel testen van menselijke populaties is inderdaad de hoeksteen voor het beheersen van een pandemie als COVID-19.

Uitgebreide tests bieden een rationele basis voor het implementeren van volksgezondheidsstrategieën die verdere verspreiding van de ziekte kunnen voorkomen. Het stelt autoriteiten in staat om weloverwogen beslissingen te nemen over het verminderen van beleid zoals sociale afstand, thuisblijven en, in extreme gevallen, avondklok. In de nasleep van een door de lucht overgedragen ziekte zoals COVID-19, zijn deze cruciale volksgezondheidsinitiatieven van vitaal belang om de druk op de gezondheidszorgstelsels te verminderen en mensenlevens te redden.

Op genoom gebaseerde analyse is de sleutel tot het ontwerpen van een testkit die specifiek is voor SARS-CoV-2. Dit is het geval, of we nu op DNA gebaseerde kits ontwerpen (PCR, isotherme amplificatie, CRISPR) of antigenen genereren voor serologische detectie . Een wereldwijde non-profitorganisatie heeft een lijst samengesteld van alle SARS-CoV-2-tests die in de handel verkrijgbaar zijn. Hier bespreken we de twee belangrijkste technieken die momenteel in gebruik zijn:DNA-gebaseerd testen en testen op basis van antilichamen.

DNA-gebaseerd testen

Huidige tests voor COVID-19 die worden uitgevoerd op viraal genetisch materiaal van neus- en keeluitstrijkjes, maken gebruik van een veelgebruikte moleculair-biologische techniek genaamd Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Een andere test maakt gebruik van de recentere isothermische nucleïnezuuramplificatietechnologie die is ontwikkeld door Abbot Labs ¹ . Beide tests zijn zeer gevoelig. Ze werken door een gebied van het genoom te versterken dat specifiek is voor het SARS-CoV-2-virus. Deze amplificatie wordt op gang gebracht door een paar oligonucleotiden (ook wel primers genoemd) die complementair zijn aan de virale sequenties.

De huidige RT-PCR-methode omvat extractie van viraal RNA uit neus- en keeluitstrijkjes en het omgekeerd transcriberen van het RNA naar DNA, gevolgd door een PCR-reactie. De PCR-methode maakt gebruik van een temperatuurcyclusstrategie waarbij de sjabloon wordt gedenatureerd en korte primers worden geanneald met complementaire sequenties op de sjabloon. Uitbreiding van het primer-sjablooncomplex, mogelijk gemaakt door het polymerase-enzym, leidt tot exponentiële amplificatie van de doelamplicons. De resultaten worden binnen enkele uren verkregen. Gedetailleerde protocollen over de PCR-methode worden gedeeld door de WHO en CDC. Integendeel, de isotherme methode van Abbott Labs wordt niet beperkt door de beperking van thermische cycli en de positieve resultaten voor COVID-19 worden verkregen in 5 minuten, terwijl negatieve resultaten worden verkregen in 13 minuten ¹ .

De unieke regio's in SARS-CoV-2 die zijn geïdentificeerd door vergelijkende genoomanalyses, dienen als onderscheidende markers voor het ontwerpen van primers of probes die worden gebruikt in op DNA gebaseerde kits. SARS-CoV-2 is een enkelstrengs RNA-virus met een genoom van bijna 30.000 basen. Het virale genoom codeert voor vier structurele eiwitten, namelijk de envelop (E), het membraan (M), de nucleocapside (N) en de spike (S) eiwitten.

Vergelijkende genoomanalyses hebben verschillende regio's geïdentificeerd die uniek zijn voor SARS-CoV-2. De uniciteit van de sequentie wordt gevalideerd door te zoeken naar vergelijkbare sequenties met behulp van het BLAST-algoritme (Basic Local Alignment Search Tool) in de GenBank-database, een wereldwijde opslagplaats van alle genomen genomen. De unieke regio's in genen zoals ORF1ab, N, RdRp en S worden momenteel gebruikt als primers bij SARS-CoV-2 RT-PCR-diagnose ² , terwijl de ID NOW™ COVID-19-sneltest van Abbott zich richt op het RdRp-gen.

Nieuwe methoden aan de horizon

CRISPR, een populaire technologie voor het bewerken van genen, wordt beschouwd als een schaalbare optie voor populatietests. Deze methode maakt gebruik van het vermogen van CRISPR-machines om specifieke genetische sequenties te herkennen en te knippen. CRISPR snijdt ook een reportermolecuul dat aan de reactie wordt toegevoegd en dat snel de aanwezigheid van viraal genetisch materiaal kan onthullen. De op CRISPR gebaseerde SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing) wordt beschreven als een papieren peilstokmethode die binnen één uur resultaten kan opleveren. SHERLOCK is mede ontwikkeld door Feng Zhang van het Broad Institute of MIT en Harvard ³ . Een andere methode die is ontwikkeld door Jennifer Doudna aan de Universiteit van Californië, Berkeley, maakt gebruik van de isothermische pre-amplificatie met DNA-endonuclease-gerichte CRISPR Trans Verslaggever (DETECTR) voor coronavirus. DETECTR kan binnen 30 minuten resultaten opleveren ⁴ .

Op volgorde gebaseerde methoden leveren cruciale informatie over de aan- of afwezigheid van het virus bij een patiënt, informatie die vooral waardevol is bij het ontwikkelen van beleid voor volksgezondheid en veiligheid. In de VS testen we momenteel alleen mensen die symptomen vertonen voor COVID-19. Bij een ziekte zoals COVID-19 bestaat er echter een ernstige bedreiging dat asymptomatische mensen het virus in de gemeenschap kunnen verspreiden.

Hoe weten we of een persoon de SARS-CoV-2-infectie al heeft gehad en immuniteit heeft ontwikkeld?

Tests op basis van antilichamen

Antilichaamtesten identificeren asymptomatische personen die al een infectie hadden en waarschijnlijk immuun zijn. Het testen van antilichamen is ook de beste strategie om de hele bevolking te screenen en de angst voor verspreiding door de gemeenschap te verminderen. Personen met positieve antilichaamresultaten kunnen ook een potentiële bron van plasma zijn die bij COVID-19-patiënten kan worden geïnjecteerd, een benadering die momenteel in de VS wordt getest.

Antilichaamtesten vereisen enige kennis van de eiwitten die cruciaal zijn voor het virus, bijvoorbeeld het virale manteleiwit. Idealiter zijn de virale eiwitten die het immuunsysteem activeren de beste kandidaten, omdat ze de productie van antilichamen initiëren die het virus markeren of neutraliseren. Het is dan noodzakelijk om die delen of secties van het virale eiwit in het laboratorium te produceren en ze te transfecteren in cellijnen voor opname in een immunoassay zoals ELISA die de aanwezigheid van antilichamen detecteert.

Dergelijke immunoassays kunnen mogelijk de basis vormen voor thuistestkits om immuniteit tegen ziekten zoals COVID-19 te detecteren. Het ontwikkelen van deze kits kost echter tijd. Het meest uitdagende knelpunt in dit proces is het tot expressie brengen van het eiwit of eiwitsegment in de juiste conformatie.

Het SARS-CoV-2-spike-eiwit biedt een mogelijke weg voor de ontwikkeling van diagnostiek, omdat het weinig unieke regio's heeft. Verschillende teams testen het receptorbindende domein van het S-eiwit, terwijl een paar het hele spike-eiwit onderzoeken ² . Andere potentiële kandidaten zijn het nucleocapside-eiwit en het S-eiwit. De FDA beoordeelt verschillende testmethoden voor antilichamen en heeft onlangs de eerste test goedgekeurd, die zal helpen bepalen hoeveel mensen in de bevolking immuniteit hebben ⁵ .

Te midden van de huidige COVID-19-pandemie, maken op DNA gebaseerde en op antilichamen gebaseerde diagnostische tests een cruciaal verschil in de volksgezondheidsinitiatieven die we nemen om het SARS-CoV-2-virus in te dammen en te verminderen. Omdat we ernaar streven om de curve af te vlakken, is snel testen belangrijk.

Neem voor meer informatie contact met ons op:https://www.3dsbiovia.com/about/contact/.