Lage-intensiteit gefocuste ultrageluid-versterkte multifunctionele nanodeeltjes voor integratie van echografie en synergetische therapie van gemetastaseerde borstkanker

Resultaten

Karakterisering van CPDP-NP's en efficiëntie bij het vrijgeven van geneesmiddelen

Een dubbele emulsiemethode werd toegepast bij het fabriceren van CPDP NP's, die zowel faseverschuivingsmateriaal PFP, sonosensitizer Ce6 en chemodrug DTX tegelijkertijd inkapselden. Wanneer gedispergeerd in PBS of gedeïoniseerd water, vertoonde de oplossing een lichtgrijs uiterlijk. CPDP NP's vertoonden een homogene bolvorm en een duidelijke kern-schilstructuur, of ze nu werden waargenomen via optische microscopie of transmissie-elektronenmicroscopie (Fig. 1a, b). De gemiddelde diameters van CPDP NP's en PDP NP's waren 249,5 ± -77,46 nm en 246,6 ± -81,01 nm, en de gemiddelde oppervlakte-zeta-potentialen waren respectievelijk − 18,47 ± -0,55 mV en − 3,987 ± -0,66 mV (Fig. 1c, d). De grootte van CPDP NP's garandeerde dat het passief kon worden geaccumuleerd in de tumorplaats via het EPR-effect [40]. De verschillende lading tussen CPDP NP's en PDP NP's is voornamelijk te wijten aan de negatief geladen Ce6 [41]. Bovendien duidde het negatieve zeta-potentieel van CPDP-NP's op een lagere plasma-eiwitadsorptie, wat de relatieve stabiliteit van nanodeeltjes bevestigt. De deeltjesgrootteverdelingen werden in 7 dagen tussen 249,5 en 385,1 nm gehouden (figuur 1e), wat de relatieve stabiliteit van CPDP-NP's aantoont. Volgens de standaardcurve was de inkapselingsefficiëntie van DTX en Ce6 respectievelijk 83,84 ± 1.39% en 60,54 ± 3.79%.

een TEM (schaalbalk:500 nm) en b lichtmicroscoopbeeld van CPDP NP's (schaalbalk:20 m). c Maatverdeling en d zeta-potentiaal van PDP NP's en CPDP NP's. e De grootteverdeling van CPDP-NP's binnen zeven dagen. v De afgiftesnelheid van Ce6 en g de afgiftesnelheid van DTX onder verschillende omstandigheden (pH 7,4 en pH 5,6, n = 3). u Het UV-Vis-spectrum van respectievelijk Ce6, DTX, PFP/PLGA en CPDP NP's. De pijlen van CPDP NP's tonen de karakteristieke pieken van Ce6 en DTX, wat de effectieve inkapseling van beide materialen aangeeft. ik Het TEM-resultaat van twee nanodeeltjes. Het PFP/PLGA-nanodeeltje vertoont de dunne schil en de ronde kern (links). Het CPDP-nanodeeltje ingekapseld in zowel Ce6 als DTX toont de veel dikkere schaal en de ovaalvormige kern (rechts)

Zoals de efficiëntie van het vrijgeven van geneesmiddelen van Ce6 en DTX van CPDP NP's aangegeven in figuur 1f, g, werd een bijna tweevoudige toename van de DTX-vrijmakende index geregistreerd bij pH 5,5 vergeleken met nanodeeltjes opgelost in pH 7,4, wat de redelijke medicijnafgifte aangaf snelheid van DTX effectief kan worden bereikt in een micro-omgeving van een zure tumor. De bovenstaande resultaten toonden allemaal aan dat de delicate ontworpen CPDP NP's een gestage en tijdige afgifte van chemotherapeutische geneesmiddelen in de zure tumoromgeving kunnen bewerkstelligen, en ook fundamenteel wenselijk zijn om voorbereid te zijn op SDT.

Zoals de UV-Vis vertoonde, vertoonden DTX en Ce6 unieke absorptiepieken in respectievelijk 229 nm en 403 nm, en integendeel, PFP / PLGA vertoonde geen van de pieken. Opgemerkt moet worden dat het spectrum van CPDP NP's de vergelijkbare pieken vertoonde, beide in de buurt van de bovengenoemde twee golflengten, terwijl de rest dezelfde neiging van het PFP / PLGA-spectrum vertoonde, wat wijst op de succesvolle inkapseling van de verschillende materialen (figuur 1h). Om de effectieve inkapseling verder te verifiëren, gaf figuur 1i aan dat het PFP / PLGA-nanodeeltje een veel dunnere schaal en de ronde kern bezit, terwijl het CPDP-nanodeeltje een relatief dikkere schaal en de ovaalvormige kern onthult vanwege de inkapseling van zowel DTX als Ce6.

In vitro echografie

Er wordt benadrukt dat PFP een uitstekend faseverschuivingsvermogen bezit. De transformatie van vloeistof naar gas helpt niet alleen nanodeeltjes te aggregeren binnen de tumorplaats, maar geeft ook recht op het vermogen om de efficiëntie van ultrasone beeldvorming te verbeteren [42]. Om dat aan te tonen, werd LIFU-bestraling toegepast als een trigger om de fasetransformatie van PFP te induceren, namelijk het akoestische druppelverdamping (ADV) effect [43]. De resultaten toonden aan dat de grijswaardenintensiteiten op een relatief laag niveau werden gehouden vóór LIFU-bestraling, terwijl nadat de intensiteit en bestralingstijd van LIFU toenam, de neiging van verbeterde ultrasone beeldvorming zowel in 2D als in CEUS werd onthuld (Fig. 2a). De akoestische analyse van ImageJ overtuigde het resultaat verder door een verhoogde grijsschaalwaarde (Fig. 2b, c), wat consistent was met de bevindingen van de beeldvorming. Opgemerkt moet worden dat het meest significante resultaat van 2D en CEUS werd behaald toen de LIFU-intensiteit 2 W/cm ² bereikte en duurde 120 s. De bovenstaande resultaten toonden aan dat PFP met succes was ingekapseld in CPDP NP's en dat de mogelijkheid tot echografie aanzienlijk was bevorderd bij een hogere intensiteit en een langere tijd van LIFU-toediening.

een Echografiebeelden van zowel 2D als CEUS onder verschillende LIFU-intensiteiten en duurtijden. b De bijbehorende grijswaardenintensiteit bij verschillende intensiteiten en tijdstippen van 2D-beeldvorming en c CEUS-beeldvorming (**p < 0.01, n = 3)

Cellulaire opname en in vitro ROS-generatie van CPDP-NP's door LIFU-bestraling

Zoals het CLSM-resultaat liet zien in figuur 3, vertoonde de cellulaire opname van CPDP-NP's een verbeterde trend in verschillende tijdsintervallen, waarbij de meest significante aggregatie werd bereikt bij de 8-uur durende co-incubatie.

De 4T1-cellulaire opname van CPDP-NP's gedurende verschillende tijdsintervallen (blauw:DAPI-gekleurde 4T1-cellen. Rood:DiR-gelabelde CPDP-NP's, de schaalbalk is 50 μm)

De belangrijkste strategie van sonodynamische therapie (SDT) is het genereren van ROS - een reeks producten voor reductie van één elektron - om apoptose van kankercellen te induceren en celproliferatie te remmen [44]. Er wordt benadrukt dat de sonosensitizer bij blootstelling aan echografie de ROS-productie kan veroorzaken; ondertussen komt er tijdens het hele proces behoorlijk wat energie vrij [45]. Aangezien zowel echografie als sonosensitizer overbodige elementen zijn om SDT te bevorderen, werd de intracellulaire ROS-generatie ontworpen en geanalyseerd om de verschillen tussen verdeelde groepen te onderzoeken. Volgens figuur 4a was de hoeveelheid ROS die werd gegenereerd door de vrije Ce6 plus LIFU-bestralingsgroep verwaarloosbaar, wat mogelijk komt doordat het snelle metabolisme van vrij Ce6 tot een onbevredigende ROS-productie leidt. Integendeel, de sterkste fluorescentie-intensiteit werd onthuld door de CPDP NPs + LIFU-groep. Er werd aangenomen dat het ingekapselde Ce6 goed beschermd was en dus niet gemetaboliseerd kon worden. Als gevolg hiervan werd Ce6 na LIFU-stimulatie vrijgegeven om overvloedige ROS te produceren. Ter vergelijking:er werden geen significante fluorescerende signalen gevonden in andere groepen (Fig. 4b).

een CLSM-beelden van ROS-generatie met verschillende behandelingen en b de bijbehorende FL-intensiteitsanalyse (****p < 0.0001, n = 3). De schaalbalken zijn 50 μm

In vitro cytotoxiciteit en gecoördineerde behandelingscapaciteit van CPDP-NP's

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay werd geïntroduceerd om de in vitro cytotoxiciteit van CPDP NP's te testen. Hiervoor zijn verschillende groepen ontworpen met of zonder LIFU-bestraling in verschillende concentraties. De resultaten gaven aan dat na een co-incubatie van 24 uur zonder blootstelling aan LIFU er geen duidelijk effect was van het overlevingspercentage van CPDP NP's, zelfs niet bij de hoogste concentratie (0,8 mg / ml), wat de gewenste bioveiligheid van CPDP NP's aantoont (Fig. 5a). By contrast, it showed that there was a striking decrease of cell viability after LIFU irradiation, showing the combination of CPDP NPs and LIFU has remarkably triggered 4T1 cell death, which was consistent with the in vitro ROS generation.

een Relative cell viability with or without LIFU irradiation under different CPDP NPs concentrations. b 4T1 tumor cell apoptosis and necrosis by flow cytometry assay and c the data of corresponding necrosis and apoptosis rate analysis (****p  < 0.0001, ***p  < 0.001, n = 3)

To further evaluate SDT efficacy, a flow cytometry assay was introduced. As the results shown in Fig. 5b, c, the index of cell necrosis and apoptosis was highest observed in CPDP NPs + LIFU group, while other groups showed no obvious and necrosis and apoptosis. Notably, the necrosis and apoptosis rate of CPDP NPs + LIFU group was threefold higher than that of CPDP NPs only group, which ensured the significant tumor cell death efficiency of SDT from another respect. Intriguingly, compared with PDP NPs + LIFU group, cell necrosis and apoptosis rate in CPDP NPs + LIFU group was significantly increased, exhibiting the synergistic therapy efficiency of SDT and chemotherapy.

In Vitro Inhibition of Cell Metastasis

The invasive and migration capability of tumor cells are indispensable in tumor progression [46, 47]. As shown in Fig. 6a, the closure between the physical gap of CPDP NPs + LIFU group was significantly wider than other groups, indicating a relatively slower speed of migrating efficiency. According to the ImageJ software analysis (Fig. 6c), the migration rate of CPDP NPs + LIFU group was also remarkably reduced compared with other groups.

een The wound healing and b The transwell assay after various treatments. c The corresponding migration rate of wound-healing assay. d The corresponding migration number of tranwell assay (****p  < 0.0001, n = 3)

Similarly in the transwell assay, compared with the swift migration speed of other groups, CPDP NPs + LIFU group revealed a significant reduction of cell number (Fig. 6b), which demonstrated an excellent anti-migration capability of the synergistic therapy. Specifically, with the absence of SDT (CPDP NPs only and LIFU only group), the number of tumor cells was mildly decreased (Fig. 6d). On the whole, due to the combination of SDT as well as chemotherapy, metastasis of 4T1 cells has been remarkably inhibited in vitro.

In Vivo Ultrasound Imaging

Since PFP was encapsulated in CPDP NPs, it is also necessary to evaluate the characteristic ultrasound imaging capability in vivo. After the injection via the tail vein of CPDP NPs, LIFU was then applied to the tumor site to acquire both 2D and CEUS imaging (Fig. 7a). The clear graphic difference between the two groups indicated that after LIFU irradiation, the corresponding intensity of CPDP NPs was elevated obviously compared with the pre-irradiation group. Further data of the average echo intensity also confirmed this result, which was also consistent with the in vitro imaging result previously (Fig. 7b, c).

een 2D and CEUS images with and without LIFU irradiation. b , c The corresponding grayscale intensity analysis measured by ImageJ (**p < 0.01, *p  < 0.05, n = 3)

In Vivo Synergistic Therapeutic Efficiency of CPDP NPs

Seeing from Fig. 8a, b, the tumor volume of CPDP NPs + LIFU group was significantly smaller after 18 days of treatment than that of other groups, which may attribute to the effectiveness of ROS originated from SDT treatment as well as chemotherapy to exert a valid synergistic therapy efficiency. Similarly, photographs of mice-bearing tumors (Fig. 8a) also showed the same trend, verifying the cooperative treating efficacy of CPDP NPs triggered by LIFU exposure. Furthermore, there was no obvious weight reduction of mice between different groups (Fig. 8c). The results above all indicated a much higher inhibition rate of CPDP NPs + LIFU group, revealing that the synergistic therapy could significantly prevent tumor growth.

een Images of tumor-bearing mice under various treatments within the certain 18 days (n = 3). b Tumor volume analysis according to various treatments (**p < 0.01). c Weights of tumor-bearing mice under various treatments (ns no significance, n = 3). d H&E, PCNA and TUNEL results under various treatments (scale bar:200 μm). e  Analysis of PCNA proliferation index of tumors under various treatments. f Analysis of TUNEL apoptotic index of tumors under various treatments (****p <0.0001, n =3)

To further testify the therapeutic results of all groups, both H&E, PCNA, and TUNEL staining were utilized (Fig. 8d). The proliferate rate of PCNA in CPDP NPs + LIFU group was only 20.50%, which was fourfold lower than control group, threefold lower than LIFU and CPDP NPs only group and twofold lower than PDP + LIFU group, respectively, demonstrating a significant anti-tumor proliferation rate (Fig. 8e). As it is shown in Fig. 8d, f, the TUNEL results indicated CPDP NPs + LIFU group exhibited an obvious apoptosis index of 72.86%, which was much higher than control (9.66%), LIFU (12.86%), CPDP NPs (19.59%), and PDP NPs + LIFU (37.06%) group. The results above all demonstrated the effectiveness of synergistic therapy exerted in vivo, which was also proved consistent with the previous in vitro results.

Biosafety of CPDP NPs In Vivo

Despite the effective therapeutic outcome, it is of great importance to explore the biosafety of the novel established nanoparticles as well. On behalf of the safe distribution of CPDP NPs in vivo, the metabolic safety was conducted. The results showed that instead of apparent body weight loss, the mice body weight elevated gradually in all the groups of mice (Fig. 9a), which indicated a negligible negative influence of CPDP NPs. In addition, as various organs and the blood samples exhibited in Fig. 9b, no significant changes were observed in blood cell, biochemistry analysis index, and H&E staining (Fig. 9c) among different treating groups, indicating the excellent biosafety of CPDP NPs in vivo.

een The weights of healthy Kunming mice under various concentrations of CPDP NPs (n = 3). b The blood biochemistry and blood routine examination under various concentrations of CPDP NPs within a certain period of 30 days (n = 3). c H&E results of different organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of mice under the same treatment (scale bar:50 μm)

In vivo Inhibition of Lung Metastasis

It is well established that the lung is the main target organ for distant metastasis of breast cancer [48]. In order to evaluate the suppressing efficiency of metastasis, lung tissues of mice were utilized for anti-metastatic investigation. As seen from Fig. 10a, b, compared with control, LIFU, CPDP NPs, and PDP + LIFU group, the CPDP NPs + LIFU group exhibited the most remarkable decrease of lung nodules, which suggested its desirable lung metastatic inhibition efficiency. A similar trend of decreasing also further indicated by H&E staining (Fig. 10c), which in all demonstrated this synergistic therapy strategy could exert effective effort in eliminating lung metastasis in mice.

een Images of the general appearances of lung tissues. b The analysis of the metastatic lung nodules between various treatments (**p  < 0.01, n = 3). c Corresponding images of lung metastatic H&E staining results (scale bar:50 μm)