Enzym-responsieve holle mesoporeuze silica-nanoplatforms met chitosan-cap voor colonspecifieke medicijnafgifte

Abstract

Een enzym-responsief colon-specifiek afgiftesysteem werd ontwikkeld op basis van holle mesoporeuze silicabolletjes (HMSS) waaraan biologisch afbreekbaar chitosan (CS) was gehecht via splitsbare azo-bindingen (HMSS-N=N-CS). Doxorubicine (DOX) was ingekapseld in een niet-kristallijne toestand in de holle holte en mesoporiën van HMSS met een hoge beladingshoeveelheid van 35,2%. In vitro geneesmiddelafgifte bewees dat HMSS-N=N-CS/DOX enzymresponsieve geneesmiddelafgifte uitvoerde. De geënte CS zou de biocompatibiliteit en stabiliteit kunnen verhogen en de eiwitadsorptie op HMSS kunnen verminderen. Gastro-intestinale mucosa-irritatie en celcytotoxiciteitsresultaten wezen op de goede biocompatibiliteit van HMSS en HMSS-N=N-CS. Cellulaire opnameresultaten gaven aan dat de opname van DOX duidelijk was verhoogd nadat HMSS-N =N-CS / DOX was voorgeïncubeerd met een colonenzymmengsel. HMSS–N=N–CS/DOX geïncubeerd met colonenzymen vertoonde verhoogde cytotoxiciteit en de IC₅₀ waarde was drie keer lager dan die van de HMSS-N=N-CS/DOX-groep zonder colonenzymen. Het huidige werk legt de basis voor daaropvolgend onderzoek naar mesoporeuze dragers voor orale colonspecifieke medicijnafgifte.

Inleiding

Onlangs hebben stimuli-responsieve medicijnafgiftesystemen (DDS's) veel aandacht getrokken voor het efficiënt laden en selectief vrijgeven van medicijnen in gerichte zieke weefsels [1]. De ontworpen, op stimuli reagerende systemen kunnen worden afgeleverd op zieke plaatsen en zorgen voor on-demand geneesmiddelafgifte om de therapeutische effecten te verbeteren en voortijdige door lekkage veroorzaakte bijwerkingen te voorkomen. Alle interne en externe stimuli, zoals redoxpotentiaal [2], pH [1], enzymen [3] en temperatuur en licht [4, 5], zijn gebruikt om op stimuli reagerende DDS's te ontwerpen. Onder deze stimuli hebben enzymen, als interne stimuli, brede aandacht gekregen vanwege hun verschillende concentraties in verschillende weefsels [6].

In de afgelopen twee decennia zijn mesoporeuze silicabolletjes (MSS's) met mesoporiën variërend van 2-50 nm in grootte vastgesteld als op stimuli reagerende medicijndragers [7, 8], aangezien MSS's een opmerkelijk groot porievolume en een groot oppervlak hebben voor hoge geneesmiddellaadcapaciteit, goed georganiseerde poriestructuur, een gemakkelijk gefunctionaliseerd oppervlak en goede biocompatibiliteit [9]. Bovendien zijn holle mesoporeuze silicabolletjes (HMSS) nanodeeltjes met een mesoporeuze omhulselstructuur en een holle holte superieur aan conventionele MSS's omdat de holle structuur efficiënt meer medicijnen kan bevatten met een hogere opslagcapaciteit dan MSSs-dragers [10, 11]. Allerlei soorten stimuli-responsieve nanodragers op basis van MSS's werden ontwikkeld om medicijnmoleculen te hosten met behulp van verschillende poortwachters, zoals polymeren [12], anorganische nanodeeltjes [13], dendrimeren, biomacromoleculen [14], macrocyclische verbindingen, peptiden [15] en lipiden [ 16]. Hoewel talrijke DDS's op basis van MSS's met functionele capping afgifte kunnen realiseren als reactie op verschillende externe of interne stimuli, zijn er maar weinig gebruikt bij colonspecifieke gerichte medicijnafgifte.

Het is algemeen bekend dat orale toediening van medicijnen de favoriete en eenvoudige manier is om medicijnen toe te dienen. Colon-specifieke gerichte medicijnafgifte is zeer fascinerend voor de behandeling van darmziekten, waaronder de ziekte van Crohn, colorectale kanker en colitis ulcerosa. Colon-specifieke medicijnafgifte kan echter verschillende problemen opleveren, waaronder dat er minder water is en relatief minder oppervlak voor orale adsorptie dan op andere plaatsen in het maagdarmkanaal [17,18,19]. Bovendien ontmoeten orale DDS's ook een sterk zure omgeving in de maag, wat de afbraak van geladen medicijnen in het maagdarmkanaal zou kunnen versnellen, waardoor het vermogen om gerichte afgifte door de dikke darm te realiseren wordt weggenomen [19]. Om deze reden zijn verschillende pH-afhankelijke DDS's ontworpen om pH-getriggerde geneesmiddelafgifte te realiseren bij de bijna neutrale pH-waarden (6-7) van het maagdarmkanaal, die bestand zijn tegen de zeer zure omstandigheden in het maaggebied [20,21,22 ,23]. Er is slechts een klein verschil in zuurgraad tussen de intestinale (pH 6,8) en colon (pH 7,4) regio's; daarom hebben dergelijke pH-responsieve DDS's moeite om colon-specifieke afgifte te realiseren.

Chitosan (CS), een kationisch en biologisch afbreekbaar natuurlijk aanwezig polysacharide, wordt gevormd door β-(1-4)-gekoppelde glucosamine- en N-acetyl-D-glucosamine-eenheden [24]. CS heeft veel aandacht gekregen in de biologische geneeskunde vanwege zijn fascinerende eigenschappen, waaronder biologische afbreekbaarheid, biocompatibiliteit, mucoadhesiviteit en antibacteriële activiteit [25,26,27,28,29]. Vergeleken met polymeren, polyelektrolyten en supramoleculen die via gecompliceerde processen zijn gesynthetiseerd, is CS relatief goedkoop en gemakkelijk verkrijgbaar door de uitputtende deacetylering van chitine [30,31,32]. Bovendien is gemeld dat CS nauwe verbindingen tussen cellen kan openen, waardoor de absorptie van geneesmiddelen wordt verhoogd [33]. Daarom werd het polymeer CS gekozen als afdekmiddel vanwege zijn goede biocompatibiliteit en geschikte grootte om de mesoporiën van HMSS te bedekken om geneesmiddelafgifte te blokkeren.

In ons werk werd voor het eerst een colonspecifiek enzymresponsief DDS op basis van een HMSS-materiaal (HMSS-N=N-CS) ontworpen zoals weergegeven in Schema 1. In dit systeem werden de HMSS-dragers bereid via een selectieve ets strategie. Het polymeer CS werd door azo-bindingen aan het oppervlak van HMSS bevestigd om als poortwachter te fungeren om de openingen van HMSS te blokkeren. De azo-bindingen tussen HMSS en CS kunnen worden gesplitst door enzymen in colonplaatsen [34, 35], wat resulteert in de scheiding van CS van de openingen van HMSS. DOX werd gebruikt als het modelgeneesmiddel dat in de holte van HMSS moest worden ingebed, en in vitro experimenten met geneesmiddelafgifte werden uitgevoerd om de enzym-responsieve afgifte in de aanwezigheid van colonenzymen te evalueren. Confocale laser scanning microscopie (CLSM) en flowcytometrie (FCM) werden gebruikt om de cellulaire opname door Caco-2-cellen te onderzoeken. Ten slotte werd de cytotoxiciteit van HMSS-N=N-CS/DOX naar Caco-2-cellen gemeten.

Schematische illustratie van a voorbereidingsproces van HMSS–N=N–CS en b de medicijnbelading en enzym-responsieve afgifte van HMSS-N=N-CS/DOX als reactie op colonenzym

Materialen en methoden

Materialen

Tetraethoxysilaan (TEOS); N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide-hydrochloride (EDC); chitosan (DAC 95%); cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB); 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTES); 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT); azobenzeen-3,3a-dicarbonzuur; kaliumbromide (spectrale zuiverheid, ≥ 99,5%); N-hydroxysuccinimide (NHS) en DOX werden gekocht bij Aladdin Chemical Inc. (Shanghai, China). Azobenzeen-3,3′-dicarbonzuur werd geleverd door Inno-chem Technology Co. Ltd. (Beijing, China). Celkweekmedia DMEM, penicilline-streptomycine en foetaal runderserum (FBS) werden geleverd door GIBCO, Invitrogen Co. (Carlsbad, VS). Alle analytische reagentia zijn voor gebruik niet verder gezuiverd.

Voorbereiding van HMSS–N=N–CS

Voorbereiding van HMSS–NH₂

De HMSS-nanodeeltjes werden bereid op basis van het gepubliceerde werk met behulp van een selectieve etsmethode [36]. De vaste silicabolletjes werden eerst gesynthetiseerd met een gemodificeerde Stober-methode. In het kort werd 6 mL TEOS gegoten in het mengsel van 10 mL gedeïoniseerd water, 74 mL ethanol en 3 mL geconcentreerd NH₃ ·H₂ O. Vervolgens werd het mengsel 60 min geroerd om colloïdale silicasuspensies bij omgevingstemperatuur te verkrijgen. De vaste bolletjes werden gecentrifugeerd, gewassen en gedroogd voor verder gebruik. Vervolgens werd de mesoporeuze silicaschil bedekt op vaste silicabolletjes. Driehonderd milligram vast silica werd gedispergeerd in 50 mL gedeïoniseerd water door ultrasonicatie gedurende 45 min. En de silica-suspensies werden gegoten in een mengsel van 60 mL ethanol, 450 mg CTAB, 90 mL water en 1,7 mL NH₃ ·H₂ O. Nadat het mengsel 60 min was geroerd, werd TEOS (0,75 mL) toegevoegd. Vervolgens werden de nanodeeltjes na 6 uur roeren gecentrifugeerd om monsters te verzamelen en vervolgens opnieuw gedispergeerd in 40 mL water. Ongeveer 1,2 g Na₂ CO₃ werd onder krachtig roeren aan de watersuspensie toegevoegd. Nadat het mengsel 12 uur op 55 ° C was gehouden, werden de producten van HMSS-nanodeeltjes verzameld en gewassen met watervrije ethanol. De post-entingsmethode met een verhouding van HMSS en APTES van 4:1 (m/v) om HMSS–NH₂ voor te bereiden bij 80 °C onder N₂ conditie gedurende 8 h, tot CTAB werd verwijderd door reflux [3].

Voorbereiding van HMSS–N=N–COOH

Het azobenzeen-3,3'-dicarbonzuur (50 mg) werd toegevoegd in pH 5,8 PBS. Vervolgens werden (5 mg/mL), EDC en (3 mg/mL) NHS toegevoegd om azobenzeen-3,3′-dicarbonzuur gedurende 1 uur bij 30 °C te activeren. En 10 mL PBS met 15 mg/ml HMSS–NH₂ werd toegevoegd en het mengsel werd 24 uur geroerd. En de resulterende HMSS-N=N-COOH werd gescheiden door centrifugeren en gewassen met ethanol.

Voorbereiding van HMSS–N=N–CS

0,15 g CS en 0,5 mL azijnzuur werden toegevoegd in 50 mL water om CS-oplossing te bereiden. En 100 mg HMSS-N=N-COOH werd gedispergeerd in 25 mL pH 5,0 PBS en gedurende 0,5 h geactiveerd door EDC en NHS. Vervolgens werd CS-oplossing (10 mL) gedurende 1 dag onder continu roeren in de suspensie gegoten. Ten slotte werd de gesynthetiseerde HMSS-N=N-CS gecentrifugeerd en gewassen om de monsters te verzamelen.

Extractie van colonenzymmengsel uit microflora

De colonmicroflora werd verzameld volgens een gepubliceerd werk [37]. Vervolgens werd de kweek geïnoculeerd om een enzymmengsel te verkrijgen dat werd uitgescheiden door colonmicroflora bij 37 ° C. Het gesimuleerde colonmedia met enzymmengsel werd gefiltreerd door een filter van 0,22 m om al het celafval uit de kweekvloeistof te verwijderen. Vervolgens werd het filtraat gevriesdroogd om het enzymmengsel in poedervorm te verkrijgen, dat in de verdere studie werd gebruikt.

Drugslaadproces en enzymresponsieve afgifte

Vijfentwintig milligram DOX werd opgelost in 5 mL pH 3,5 HCl-oplossing. En 100 mg HMSS-N=N-CS werd toegevoegd aan de DOX-oplossing en 12 h bij omgevingstemperatuur geroerd. Vervolgens werd 0,2 M NaOH-oplossing gebruikt om de pH van het mengsel in te stellen op 7,0, en de suspensie werd nog eens 12 u geroerd. Vervolgens werd de met DOX beladen HMSS-N=N-CS (verwezen naar HMSS-N=N-CS/DOX) gecentrifugeerd en gewassen om de geadsorbeerde DOX op het oppervlak van HMSS-N=N-CS te verwijderen. Het supernatant werd bij elke stap verzameld om de DOX-laadefficiëntie (LE) bij 480 nm te meten met UV-Vis-spectrofotometrie. De totale massa van DOX geladen in HMSS-N =N-CS werd berekend door de onbeladen DOX na laadprocessen van het geneesmiddel af te trekken van de aanvankelijke toegevoegde massa DOX. De HMSS/DOX werd bereid als een controle met HMSS als de initiële drager. De LE van DOX werd berekend volgens de vergelijking:

$$ \mathrm{LE}\ \left(\%\right)=\frac{m_A-{m}_B}{m_A-{m}_B+{m}_C} \times 100 $$

Waarin m _A was de toegevoegde massa van DOX, m _B was de massa van DOX in supernatant, en m _C was de totale massa van HMSS–N=N–CS.

In vitro enzym-responsieve afgifte van DOX uit HMSS-N=N-CS/DOX werd als volgt geëvalueerd. Twee milligram HMSS-N=N-CS/DOX en HMSS/DOX nanodeeltjes werden gedispergeerd in pH 7,4 PBS, schuddend bij 125 rpm met verschillende concentraties colonenzymmengsel (0 mg/mL, 0,3 mg/mL en 1 mg/mL) . Op gespecificeerde tijdsintervallen werd 1 mL afgiftemedium verwijderd om de absorptie te meten. De afgifte van DOX werd gemeten bij 480 nm. HMSS/DOX werd gebruikt als controle.

BSA-adsorptie

De hoeveelheid BSA-adsorptie werd geëvalueerd op basis van de gepubliceerde werken [38, 39]. BSA werd toegevoegd in pH 7,4 PBS (0,5 mg/ml). Vijf milligram HMSS en HMSS–NH₂ en HMSS-N =N-CS werden toegevoegd aan 2, 5 mL PBS (pH 7, 4). En de BSA-oplossing met hetzelfde volume werd geleverd en de suspensie werd in een schudder geplaatst bij 100 tpm. Na 6 h werd centrifugeren gebruikt om de bovenste oplossing te verzamelen. Eindelijk werd de BSA-concentratie gemeten bij 595 nm na te zijn gekleurd met Coomassie briljantblauwe oplossing.

Karakterisering

De mesoporeuze netwerkstructuur en morfologie van de HMSS-nanodeeltjes werden geëvalueerd door TEM-afbeeldingen (EM-208S, CSIS, VS). Het oppervlak en de poriegrootteverdeling van nanodeeltjes werden gekarakteriseerd met behulp van stikstofadsorptie-analyse-analysator (V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, China). De ξ-potentialen en deeltjesgroottes werden gekarakteriseerd op een Nano-z90 Nanosizer (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, VK). TGA-analyse werd gemeten op een TGA-50-apparatuur (Shimadzu, Kyoto, Japan) met een verwarmingssnelheid van 10 ° C / min onder een stikstofstroom. Fourier-transformatie infrarood spectrofotometrische (FT-IR) spectra werden gemeten met behulp van een FT-IR-spectrometer (Bruker Tensor27, Zwitserland). Het bereik werd uitgevoerd van 400 tot 4000 cm⁻¹ met behulp van KBr-pellettechniek. Power XRD werd uitgevoerd op een Siemens D5005 röntgendiffractometer (Karlsruhe, Duitsland) met Cu-Kα-straling (λ =1,5418 Å).

Celcultuur en celopname-experiment

Caco-2-cellen werden gekweekt in een medium dat was aangevuld met 10% FBS, 1% niet-essentieel aminozuur, 1% (v/v) pyrodruivenzuurnatrium en 1% streptomycine. NIH-3T3-cellen werden gekweekt in DMEM met 1% streptomycine en 10% FBS. De opname van Caco-2-cellen van de nanodragers werd gekarakteriseerd met behulp van FCM en CLSM. Caco-2-cellen werden uitgezaaid in platen met 24 putjes. Na een nacht kweken werden vrije DOX, HMSS-N=N-CS/DOX en HMSS-N=N-CS/DOX voorgeïncubeerd met nanodeeltjes van het colonenzym (gelijk aan de concentratie van 5 g/mL DOX) toegevoegd aan de overeenkomstige putjes . Na voortgezette incubatie gedurende 2 uur werd het celmedium verwijderd en grondig gewassen met PBS. Vervolgens werden de cellen gefixeerd met 4% formaldehyde en gekleurd door Hoechst 33258 voor CLSM-waarneming. FCM werd gebruikt om een kwantitatieve evaluatie van cellulaire opname te verkrijgen. Caco-2-cellen werden gezaaid in platen met 6 putjes en verder 24 uur geïncubeerd. Na wassen met PBS werden de Caco-2-cellen geïncubeerd met vrije DOX, HMSS-N=N-CS/DOX en HMSS-N=N-CS/DOX voorgeïncubeerd met nanodeeltjes van colonenzymen (gelijk aan de concentratie van 5 μg/ ml DOX) in serumvrij DMEM gedurende 2 uur. Vervolgens werden de Caco-2-cellen gespoeld met koude PBS, getrypsiniseerd en opnieuw gesuspendeerd in 0, 5 mL PBS. De DOX-fluorescentie in cellen werd gemeten met behulp van een FACS Canto-flowcytometer (Becton, Dickinson, VS).

In vitro cellulaire proliferatietest

De cytotoxiciteit van HMSS- en HMSS-N=N-CS-blanco dragers voor NIH-3T3- en Caco-2-cellen werd aangetoond door MTT-assay [40, 41]. In het kort werden Caco-2-cellen en NIH-3T3-cellen afzonderlijk gezaaid in platen met 96 putjes en verder gedurende de nacht geïncubeerd. Het oude celmedium werd vervangen door een serumvrij medium met verschillende concentraties nanodeeltjes. Na incubatie gedurende 2 dagen, 50 μL MTT-oplossing (2 mg mL^–1 ) werd toegevoegd en gedurende 4 uur geïncubeerd om de levende cellen te meten. Vervolgens werd de MTT-oplossing verwijderd en werd 150 μL DMSO toegevoegd om formazan op te lossen. Vervolgens werd de absorptie gemeten op een microplaatlezer (Tecan, Männedorf, Zwitserland) bij 570 nm. De cytotoxiciteit van vrij DOX, HMSS-N=N-CS/DOX en HMSS-N=N-CS/DOX voorgeïncubeerd met enzymmengsels geëxtraheerd uit colonmicroflora werd gemeten met Caco-2-cellen met de overeenkomstige DOX-concentraties van (0,1, 1, 5, 10 en 20 g/ml). De incubatietijd was 48 h en de andere experimentprocessen waren hetzelfde als hierboven beschreven.

Toxiciteitsonderzoeken

De gastro-intestinale mucosa-irritatietests zijn van vitaal belang voor de evaluatie van orale toediening van geneesmiddelen in vivo bioveiligheid. Mannelijke Sprague-Dawley-ratten (180 ± 10 g) werden willekeurig verdeeld in drie groepen (drie ratten voor elke groep). Ratten kregen zoutoplossing, HMSS en HMSS-N =N-CS nanodeeltjes toegediend met een dosis van 100 mg / kg voor elke dag. Na 7 dagen werden alle ratten opgeofferd en werden de weefsels verzameld en onderzocht door histopathologisch onderzoek (H&E). Om de bioveiligheid van HMSS- en HMSS-N=N-CS-nanodeeltjes te evalueren, werden de lichaamsgewichten van BALB/c-muizen (18-20 g) geregistreerd na orale toediening in een dosis van 100 mg/kg om de andere dag. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de Qiqihar Medical University en werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Qiqihar Medical University.

Statistieken

Statistische gegevens werden geanalyseerd met SPSS-software met behulp van twee staarten Student's t -test. Foutbalken die in deze studie worden gepresenteerd, zijn SD. Een p <0,05 wordt als statistisch significant beschouwd.

Resultaten en discussie

Voorbereiding en karakterisering van HMSS–N=N–CS

HMSS werden opgesteld op basis van eerdere werken met kleine wijzigingen [36]. Ten eerste, solide SiO₂ nanosferen werden bereid en een mesoporeuze schaal werd gecoat op het oppervlak van de vaste silica-nanosferen die de CTAB-sjabloon bevatten. Dan, Na₂ CO₃ werd gebruikt om selectief het vaste SiO₂ . te etsen nanosferen terwijl de mesoporeuze schaal werd beschermd door sjabloon CTAB. De bereiding van HMSS-N =N-CS met CS bevestigd als een "poortwachter" door een azo-koppeling wordt beschreven in figuur 1a. Eerst werden de oppervlakken van HMSS-nanodeeltjes gemodificeerd met APTES als een alkylkoppelingsreagens om amino-gefunctionaliseerde HMSS te worden (HMSS-NH₂ ) door een postmodificatiemethode. Vervolgens werd HMSS-N=N-COOH bereid door een amideringsreactie tussen de aminogroepen van HMSS-NH₂ en de carboxylgroepen van azobenzeen-3,3'-dicarbonzuur. Vervolgens werd CS covalent gemodificeerd op het oppervlak van HMSS-nanodeeltjes door een amideringsreactie tussen de carboxylgroepen van HMSS-N=N-COOH en de aminogroepen in CS.

TEM van a HMSS en b HMSS–N=N–CS

Zoals weergegeven in het transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) -beeld in figuur 1a, was de gemiddelde diameter van HMSS 280 nm en hadden de HMSS's een uniforme holle structuur en een sterk geordende mesoporeuze schaal. De gemiddelde dikte van de mesoporeuze schaal was ongeveer 90 nm. Vergeleken met het gladde oppervlak van HMSS, was het oppervlak van het geënte polymeer HMSS-N=N-CS (Fig. 1b) ruw, wat aangeeft dat de CS de HMSS-drager bedekte.

De oppervlaktegebieden en porieverdelingen van mesoporeuze materialen speelden een cruciale rol bij het laden en afleveren van gastheermoleculen voor gecontroleerde afgifte. Poriëngrootteverdelingscurven en isothermen werden gemeten met N₂ adsorptie- en desorptieanalyse (Fig. 2). Gedetailleerde parameters (de Brunauer–Emmett–Teller (BET) oppervlakte (S _BET ), totaal porievolume (V _P ), en poriegrootteverdeling (D _P )) worden weergegeven in Tabel 1. De S _BET en V _P van pure HMSS waren 810.7 m² /g en 0,969 cm³ /g, respectievelijk, en de D _P was ongeveer 3,8 nm. De D _P van HMSS–NH₂ was bijna hetzelfde als die van HMSS na aminering, wat aangeeft dat de mesoporiën niet geblokkeerd waren na aminofunctionalisering. De S _BET en V _P van HMSS-N=N-CS waren aanzienlijk verminderd na modificatie door de azo-verbinding en CS-coating, wat aangeeft dat CS het oppervlak van de HMSS had gecoat [1].

een De stikstofadsorptie/desorptie-isothermen en b poriegrootteverdelingen van HMSS, HMSS–NH₂ , en HMSS–N=N–CS

De succesvolle enting van HMSS-N =N-CS werd geverifieerd door verschillende methoden. Het ξ potentieel van HMSS–NH₂ onderging een grote verandering na functionalisering, variërend van − 27,9 tot + 31,4 mV, zoals weergegeven in Fig. 3a, die werd toegeschreven aan de toevoeging van de aminegroepen aan het oppervlak van HMSS. Na HMSS–NH₂ reageerde met azobenzeen-3,3′-dicarbonzuur om HMSS-N=N-COOH te vormen, de ξ-potentiaal nam verder af tot − 2.0 mV vanwege de carboxylgroepen op het oppervlak van de HMSS. Nadat het CS-polymeer verder op het oppervlak van de HMSS was geënt om HMSS-N=N-CS te vormen, keerde de ξ-potentiaal terug naar + 32,4 mV. Het resultaat werd toegeschreven aan de amino-overvloedige positief geladen CS-coating op het oppervlak van de HMSS [1]. Thermogravimetrische analyse (TGA) curven van HMSS, HMSS–NH₂ , HMSS-N =N-COOH en HMSS-N =N-CS-soorten worden getoond in Fig. 3b. Vergeleken met HMSS-N=N-COOH, verloor HMSS-N=N-CS een extra gewicht van ongeveer 19%, wat te wijten was aan het verwijderen van CS-ketens. Het enten van azo-bindingen op het oppervlak van HMSS werd ook bevestigd door een kleurverandering tijdens de bereiding van HMSS-N =N-COOH, zoals weergegeven in de inzet in figuur 3b. De reactant HMSS–NH₂ is wit, terwijl het product HMSS-N=N-COOH geelbruin was nadat het azobenzeen-3,3′-dicarbonzuur met de aminogroepen van HMSS reageerde. De hydrodynamische diameter (D _H ) en polydispersiteitsindex (PDI) waarden van HMSS, HMSS–NH₂ en HMSS-N =N-CS werden bepaald in gedestilleerd water, zoals weergegeven in figuur 3c. De HMSS had een diameter van 309 nm en een PDI van 0,190. Na de toevoeging van aminegroepen op de oppervlakken van HMSS om HMSS-NH₂ te vormen , de D _H verhoogd tot 324 nm. De diameter van HMSS-N=N-CS was 342 nm, wat groter was dan die van HMSS-NH₂ vanwege de geënte CS-ketens. De PDI van HMSS-N=N-CS (0,177) was kleiner dan die van HMSS-NH₂ , wat aangeeft dat de gemiddelde deeltjesgrootte nog groter was geworden na het enten van CS. Vergeleken met de diameters verkregen uit TEM, waren de diameters van HMSS en HMSS-N=N-CS gemeten door DLS groter. De D _H van de nanodeeltjes werd gemeten in een waterige omgeving met een hydratatielaag, terwijl de grootte van de door TEM geleverde nanodeeltjes werd verkregen uit droge nanodeeltjes [3]. FT-IR-spectra van HMSS–NH₂ , HMSS-N =N-COOH, HMSS-N =N-CS en CS worden getoond in figuur 4d. Vergeleken met de pieken voor HMSN–NH₂ , een toename van de adsorptiepieken bij 2853 en 2925 cm⁻¹ werd toegeschreven aan de trilling van − CH₂ bij het enten van carboxy-terminale azo-bindingen. Nadat CS was toegevoegd aan het oppervlak van HMSS-N=N-COOH, waren er verhogingen van de adsorptiepieken bij 1660 cm⁻¹ en 3435 cm⁻¹ , die werden toegeschreven aan υ_(C=O) in de amideband en de vibratie van N–H in de CS. Alle resultaten bewezen de succesvolle voorbereiding van HMSS-N=N-CS.

een De overeenkomstige ξ-potentialen van HMSS, HMSS–NH₂ , HMSS-N=N-COOH en HMSS-N=N-CS; b De TGA-curven van HMSS–NH₂ , HMSS–N=N–COOH en HMSS–N=N–CS (de inzet:de foto van (a ) HMSS–N=N–COOH en (b ) HMSS–NH₂ ); c Grootteverdeling van HMSS, HMSS–NH₂ , en HMSS-N =N-CS inzet:de overeenkomstige PDI-waarden van nanodeeltjes; en d FT-IR-spectra van HMSS–NH₂ , HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS en CS

XRD-patronen van DOX, HMSS–N=N–CS, HMSS–N=N–CS/DOX en PM

Drugstatus en laadefficiëntie

DOX werd gekozen om het laad- en afgiftegedrag van HMSS-N=N-CS te onderzoeken. Toen de pH-waarde van de HMSS-N=N-CS nanodeeltjessuspensie werd ingesteld op pH 3,5, werd het CS-biopolymeer positief geladen (de pK_a van CS was 6,3) vanwege de geprotoneerde aminogroepen in de zure omgeving [24]. Het CS-polymeer werd positief geladen en zwol op, wat leidde tot de opening van mesoporiën van HMSS, toegeschreven aan de afstotende interactie tussen CS-ladingen. DOX kreeg dus toegang tot de mesoporiën van HMSS-N =N-CS door diffusie. Nadat het met geneesmiddel beladen mengsel echter was aangepast tot 7,4, deprotoneerden de CS-ketens en stortten ze in om de voortijdige afgifte van DOX te belemmeren.

De LE van HMSS-N=N-CS/DOX was 35,2%, wat veel groter was dan die van andere met DOX beladen mesoporeuze silica-afgiftesystemen [3, 16]. De hoge LE van DOX in HMSS-nanodragers werd toegeschreven aan de holle holte, het grote oppervlak en het mesoporeuze netwerk, dat als medicijnreservoir kon worden gebruikt. De fysieke toestand van DOX in HMSS-N=N-CS/DOX werd geëvalueerd door middel van krachtige röntgendiffractie (XRD). Zoals getoond in de XRD-profielen (Fig. 4), vertoonde onbewerkte DOX karakteristieke en intense kristallijne diffractiepieken van het geneesmiddel. Het fysische mengsel (PM) van HMSS-N=N-CS en DOX vertoonde ook duidelijke kristallijne diffractiepieken. HMSS-N=N-CS/DOX vertoonde echter geen duidelijke kristallijne pieken, wat aantoonde dat de fysieke toestand van DOX in HMSS-N=N-CS/DOX niet-kristallijn was vanwege de beperkingen van de mesoporeuze structuur van HMSS.

In vitro enzymresponsieve afgifte in gesimuleerde colonomgeving

Om de enzym-responsieve afgifte van HMSS-N=N-CS te onderzoeken, werden HMSS-N=N-CS/DOX en HMSS/DOX nanodeeltjes toegevoegd aan pH 7,4 PBS met verschillende concentraties colonenzymmengsel. Zoals weergegeven in Fig. 5a, vertoonde HMSS-N =N-CS / DOX de langzame afgifte van DOX in PBS bij pH 7,4, en het cumulatieve afgiftepercentage was slechts ongeveer 10% binnen 24 h, wat wijst op een goed capping-vermogen van de CS polymeren en azobindingen. Zoals verwacht was in het geval van verdund enzym in PBS bij pH 7,4 de cumulatieve afgifte van DOX binnen dezelfde periode verbeterd tot meer dan 20%. Bovendien werd de afgiftehoeveelheid van DOX dramatisch verhoogd tot bijna 40% in aanwezigheid van geconcentreerd enzym. Vergeleken met de enzym-responsieve afgifte van HMSS-N=N-CS/DOX, had de afgifte van DOX uit HMSS/DOX vergelijkbare trends in de aanwezigheid of afwezigheid van geconcentreerd enzym. Het relatief lage geneesmiddelafgiftepercentage was te wijten aan de elektrostatische interactie tussen de negatief geladen HMSS en de positief geladen DOX [42]. De bovenstaande resultaten toonden aan dat de afgifte van DOX uit HMSS-N=N-CS/DOX aanzienlijk werd versneld door enzymen die werden geëxtraheerd uit microflora in colongebieden. Het enzym-responsieve afgiftemechanisme zou kunnen zijn dat de azo-bindingen in HMSS-N=N-CS worden afgebroken door het enzym, waardoor CS loskomt van het oppervlak van HMSS en de snelle afgifte van HMSS. Van azo-bindingen is gemeld dat ze worden gesplitst door enzymen die worden uitgescheiden door microflora in de dikke darm [34, 35].

een Cumulatieve afgifteprofielen van HMSS/DOX en HMSS-N=N-CS/DOX in pH 7,4 PBS in aanwezigheid van geconcentreerd en verdund colonenzymmengsel; en b in vitro pH-responsief afgiftegedrag van DOX van HMSS–N=N–CS in de afgiftemedia van verschillende pH-waarden

Om de enzym-responsieve afgifte van HMSS-N =N-CS / DOX in de mimetische GIT-omgeving verder te evalueren, werden de HMSS-N =N-CS / DOX-nanoplatforms aanvankelijk gedurende 2 uur in SGF gedispergeerd en vervolgens verder gedispergeerd in SIF gedurende 6 h, en ten slotte werden de dragers toegevoegd aan pH 7,4 PBS die 1 mg / ml geëxtraheerd enzym bevatte. Zoals getoond in Fig. 5b, was de afgifte van DOX in gesimuleerd maagsap relatief snel en bereikte de cumulatieve hoeveelheid 15% binnen 2 uur. De relatief snelle afgifte was te wijten aan de zwakkere interactie tussen HMSS-N=N-CS en DOX onder zure omstandigheden dan onder neutrale omstandigheden [1]. Vervolgens werd de afgifte van DOX gedurende 2-8 uur in SIF vertraagd. Nadat de HMSS-N =N-CS / DOX was geïncubeerd met geëxtraheerde enzymen in pH 7, 4 PBS, bleef de afgifte van DOX echter aanzienlijk toenemen en bereikte de cumulatieve afgiftehoeveelheid meer dan 50% binnen 24 h. De onvolledige DOX-afgifte van HMSS-N=N-CS/DOX was te wijten aan de sterke interactie tussen de positief geladen DOX en de negatief geladen HMSS.

De eiwitadsorptie door en stabiliteit van HMSS–N=N–CS

Voor orale toediening zullen de oppervlakte-eigenschappen van nanodragers onvermijdelijk het afgiftegedrag en de bioadsorptie van geneesmiddelen beïnvloeden [43]. Een bepaling van eiwitadsorptie op het oppervlak werd gebruikt om het effect van geënte CS op het oppervlak van HMSS te evalueren. Zoals weergegeven in Fig. 6a, hadden kale HMSS-nanodragers een dramatische BSA-adsorptie van maximaal 16,5%, wat werd toegeschreven aan het grote oppervlak en de holle holte van HMSS, sterk adsorptievermogen en niet-specifieke interacties tussen silanolgroepen van HMSS en BSA [ 38, 39]. Bovendien, HMSS–NH₂ had eveneens een relatief hoog geadsorbeerd BSA-gehalte van 10,2%. Desalniettemin nam het percentage geadsorbeerde BSA op het oppervlak aanzienlijk af tot 2,5% nadat het polymeer CS als afdekking was toegevoegd, waardoor het effect op het in vivo gedrag van HMSS-N=N-CS drastisch werd verminderd. Om de stabiliteit van de HMSS-N =N-CS- en HMSS-monsters verder te observeren, werd 20 mg HMSS-N =N-CS en HMSS toegevoegd aan pH 7, 4 PBS en gedeïoniseerd water. As displayed in Fig. 6b, although HMSS–N=N–CS and HMSS were relatively stable in water, HMSS quickly flocculated in pH 7.4 PBS. By contrast, the dispersity of HMSS–N=N–CS was obviously enhanced after the polymer CS was grafted onto the surfaces of HMSS. Additionally, HMSS–N=N–CS carriers can remain stable for more than 12 h without precipitation in pH 7.4 PBS. These results proved that covering with the hydrophilic CS polymer could improve the dispersity and decrease protein adsorption on the surface of HMSS–N=N–CS.

een BSA adsorbance amounts of HMSS and HMSS–NH₂ and HMSS–N=N–CS (n =3, *p <0,05). b Photograph images of HMSS–N=N–CS and HMSS dispersed in water and PBS with a concentration of 4 mg/mL

Cellular Uptake

Caco–2 cells, as human epithelial colorectal adenocarcinoma cells, are widely used as model cells in oral drug delivery. As shown in Fig. 7a, Caco–2 cells incubated with free DOX showed a relatively strong fluorescence signal resulting from DOX because positively charged DOX could enter the cell and then the nucleus. Compared with the free DOX group, the HMSS–N=N–CS/DOX group showed a weaker fluorescence signal intensity due to incomplete drug release from HMSS–N=N–CS/DOX. However, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, it showed a markedly increased fluorescence signal. This was attributed to the azo bonds being cleaved by the enzyme mixture, which led to the removal of the CS from the surfaces of HMSS, thus significantly accelerating the DOX release from HMSS–N=N–CS/DOX. To quantitatively evaluate the cellular uptake differences for HMSS–N=N–CS/DOX and HMSS–N=N–CS/DOX incubated with extracted enzymes, FCM was used. As shown in Fig. 7b, the mean fluorescence intensity (MFI) for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 124.7, which was weaker than that of the free DOX group, with a p value less than 0.001. Excitingly, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, the MFI markedly increased to 357 and even exceeded that of the free DOX group owing to the accelerated drug release from HMSS–N=N–CS/DOX after the breakage of azo bonds. All these results indicated that the azo bonds in HMSS–N=N–CS/DOX could be cleaved in the presence of colonic enzymes, which led to the shedding of CS from the surface of HMSS and accelerated the DOX release from HMSS.

een CLSM of Caco-2 cells incubated with different samples. b The MFI of DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX treated by enzyme measured by FCM in Caco-2 cells (n =3, ***p <0.001)

In Vitro Cell Viability Evaluation

To prove the enzyme-responsive release effect of HMSS–N=N–CS/DOX in simulated colonic conditions, an in vitro cell viability assay was carried out using Caco-2 cells. The classic anticancer drug DOX was used in the cell viability assay. Prior to this assay, different concentrations of blank HMSS and HMSS–N=N–CS were employed to ascertain the biocompatibility of the nanoplatform towards Caco-2 cells and normal NIH-3T3 (mouse embryo fibroblast) cells at various concentrations from 10 to 250 μg/mL by MTT assay [44, 45]. As displayed in Fig. 8a, b, HMSS and HMSS–N=N–CS at different concentrations showed negligible cytotoxicity after incubation with Caco–2 cells or NIH-3T3 cells, and the viability of Caco–2 cells was 87.9% and 88.3% at the high concentration of 100 μg/mL, respectively, which is sufficiently high for clinical applications due to the high drug loading of HMSS. In addition, NIH-3T3 cells incubated with HMSS and HMSS–N=N–CS for 48 h had high cell viability (above 80%) at the relatively high concentration of 100 μg/mL. These results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS are cytocompatible and could be employed for oral delivery.

Effect of HMSS and HMSS–N=N–CS on cell proliferation of a Caco–2 cells and b NIH-3T3 cells for 48 h by MTT assay. c Cytotoxicity of free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX with enzyme against Caco-2 cells with different concentrations for 48 h

The effect of the DOX-loaded nanocarrier HMSS–N=N–CS/DOX on the viability of Caco–2 cells is displayed in Fig. 8c. Free DOX showed strong and concentration-dependent cytotoxicity towards 4T1 cells, which was attributed to the fact that positively charged free DOX could pass through 4T1 cell membranes easily. De IC₅₀ value for the free DOX group was determined to be 10.18 μg/mL using the SPSS Statistics software. Compared with free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX exhibited a higher cell viability at the same DOX concentration owing to the incomplete release of DOX from HMSS–N=N–CS induced by the strong electrostatic interactions between negatively changed HMSS carriers and positively changed DOX. De IC₅₀ value for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 32.22 μg/mL, which was much higher than that for free DOX. However, HMSS–N=N–CS/DOX preincubated with concentrated colon enzymes showed an obvious concentration-dependent cytotoxicity, and the IC₅₀ value was calculated to be 9.41 μg/mL, which was much lower than that of HMSS–N=N–CS/DOX. This reason could be ascribed to the colon enzymes degrading the azo bonds in HMSS–N=N–CS, which would lead to the detachment of grafted CS from the surface of HMSS, causing the fast release of DOX from HMSS carriers.

Toxicity Studies

The hazards of using HMSS–N=N–CS are a vital factor to be considered before its clinical applications in the future. H&E staining of gastrointestinal mucosa irritation is essential to evaluate the in vivo biosafety of the delivery system for oral administration (Fig. 9a). Compared to a saline group, both the HMSS and HMSS–N=N–CS groups exhibited no marked histopathological changes or hyperemia after oral administration for a week with an administration dose of 100 mg/kg. No death or unusual behaviors of rats was observed during the experimental process. A decrease in body weight is widely regarded as an important and simple index for in vivo systemic toxicity [46]. As shown in Fig. 9b, the body weights of mice in the HMSS and HMSS–N=N–CS groups increased slightly and were similar to those of the saline group. The above results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS showed good biocompatibility as drug carriers for oral administration.

een Gastrointestinal mucosa irritation assay after oral administration of HMSS and HMSS–N=N–CS with the dose of 50 mg/kg for 7 days. b The weight changes of mice after oral administration for a week. Data were means ± SD (n =3)

Conclusies

In summary, biodegradable CS was attached through azo bonds to gate the openings of HMSS to achieve enzyme-responsive colon-specific drug delivery. DOX was loaded in the hollow cavity and mesopores of HMSS in a noncrystalline state with a high loading efficiency of 35.2%. Stability and BSA adsorption results illustrated that the CS gates could increase the biocompatibility and stability of HMSS. In vitro release results proved that HMSS–N=N–CS/DOX exhibited enzyme-responsive drug release behavior in the presence of colonic enzymes. CLSM uptake and FCM results indicated that the cellular uptake of DOX was obviously increased after HMSS–N=N–CS/DOX was incubated with the colonic enzyme mixture. Cell viability results indicated that HMSS–N=N–CS/DOX incubated with colonic enzymes showed increased cytotoxicity, and the IC₅₀ value obviously decreased from 32.22 μg/mL for HMSS–N=N–CS/DOX to 9.41 μg/mL upon incubation.