Met PD-L1 monoklonale antilichaam versierde nanoliposomen geladen met Paclitaxel en P-gp-transportremmer voor de synergetische chemotherapie tegen multiresistente maagkankers

Resultaten en discussie

Voorbereiding en karakterisering van PTX/TQD-geladen PD-L1-geconjugeerde nanoliposomen

De PTX wordt veel gebruikt in de klinieken en is voornamelijk geïndiceerd bij de behandeling van maagkanker. De meerderheid van de patiënten lijdt echter blijkbaar aan een slechte therapeutische respons als gevolg van multidrug-resistentie (MDR) van de maagkankers. Een verhoging van de dosis PTX resulteerde in verhoogde systemische toxiciteit, waardoor MDR een belangrijk obstakel werd in de succesvolle behandeling van kankertherapie. Onder de overvloed aan MDR-mechanismen wordt p-gp-gemedieerde geneesmiddelefflux beschouwd als primair verantwoordelijk voor de geneesmiddelresistentie in kankercellen [27]. Daarom hebben we in deze studie een tweede medicijn (TQD) als p-gp-remmer gebruikt om het MDR-fenomeen in de kankercellen te overwinnen en de werkzaamheid tegen kanker van PTX te verbeteren. We hebben de gewichtsfractie van twee geneesmiddelen waarin ze het synergetische effect vertonen zorgvuldig bestudeerd. Om het antikankereffect te maximaliseren, is het belangrijk om de meerdere medicijnen samen te leveren in een enkel nanodeeltjessysteem. De gelijktijdige toediening van twee geneesmiddelen (PTX en p-gp-remmer) zal de efficiënte onderdrukking van het effluxmechanisme van geneesmiddelen mogelijk maken en het vooruitzicht op verhoogde intracellulaire concentraties in de kankercellen vergroten [28]. Voor dit doel hebben we in deze studie twee geneesmiddelen geladen in de lipide dubbellaag van nanoliposomen die als extreem stabiel worden beschouwd in de systemische circulaties (figuur 1). Om de verbeterde tumorspecifieke targeting te bereiken, werden nanoliposomen aan het oppervlak geconjugeerd met PD-L1-mAb. De maleïmidegroep die aanwezig is in het nanoliposoom zal binden met de thiolgroep van PD-L1-mAb en een stabiele covalente binding vormen. Maar een mogelijke beperking van maleïmideconjugatie is dat de reactie omkeerbaar is:het product kan retro-Michael-additiereacties ondergaan met biologische thiolen in plasma, wat kan leiden tot het vrijkomen van de maleïmide. We hebben een dergelijke reactie echter overwonnen door maximale oppervlakteconjugatie van antilichaam op het maleïmide-liposoom. Er is gerapporteerd dat tumor-targeting ligand specifiek de therapeutische lading in de tumorweefsels zal afgeven en onnodige bijwerkingen in de normale weefsels zal vermijden. Eerder, Patel et al. rapporteerde dat opname van p-gp-remmer met PTX de MDR in de eierstokkankercel zou kunnen overwinnen onder in vitro omstandigheden [11]. Ook Zou et al. en Zhang et al. rapporteerde dat de PTX-cytotoxiciteit tegen SKOV-3TR en A2780-Adr multiresistente cellen significant toenam in de aanwezigheid van Tariquidar. In deze onderzoeken werd echter ofwel een fysieke combinatie van PTX + TQD gebruikt of werd een niet-gerichte drager ontwikkeld [29, 30]. Belangrijk is dat al deze onderzoeken alleen zijn uitgevoerd onder in vitro-omstandigheden. De huidige studie was gericht op het ontwerpen van de gerichte nanodrager met behulp van een relatief nieuwe klasse van targeting-agent, PDL1-antilichaam. Bovendien heeft de huidige studie de werkzaamheid van PTX + TQD in het xenograft-tumormodel aangetoond en ook de bloedparameters beoordeeld die verband houden met de systemische toxiciteit.

Schematische illustraties van het laden van paclitaxel en tariquidar in PD-L1 monoklonaal antilichaam (mAb) -oppervlak geconjugeerde nanoliposomen. Het liposoom werd bereid door hydratatie van dunne lipidefilm en gesoniceerd om de met geneesmiddel beladen nanoliposomen te vormen

De gemiddelde deeltjesgrootte van PTLP was 135,6 ± 1,26 nm, terwijl deze na conjugatie met PD-L1-mAb (PD-PTLP) toenam tot 168,59 ± 1,34 nm. De deeltjesgrootte nam toe vanwege het grote molecuulgewicht van PD-L1-mAb; niettemin was de totale grootte van minder dan 200 nm en de bolvorm het vermelden waard (figuur 2a). Nanodeeltjes met een grootte van minder dan 200 nm zullen de hogere accumulatie in tumorweefsels mogelijk maken dankzij het verbeterde permeatie- en retentie-effect (EPR). Bovendien zorgt de aanwezigheid van PEG voor een langere bloedcirculatietijd in de systemische circulatie. De zeta-potentiaal van PD-PTLP was 22,1 ± 1,21 mV, wat geen niet-specifieke binding aan de bloedbestanddelen mogelijk maakt. PD-PTLP vertoonde een hoge invangefficiëntie van ~  95% voor zowel de geneesmiddelen (PTX als TQD). PD-PTLP vertoonde ook een hoge medicijnbelading van 12-14% w/w voor respectievelijk PTX en TQD (Fig. 2b).

Fysisch-chemische karakterisering van met PTX/TQD geladen PD-L1-geconjugeerd nanoliposoom. een Morfologische analyse van PD-PTLP met behulp van transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). b Geneesmiddellaadcapaciteit van PD-PTLP. c In vitro afgifte van PTX en TQD van PD-PTLP bij pH 7,4 buffer en pH 5,0 bufferomstandigheden bij 37 °C. **p <0,01 is het statistische verschil in geneesmiddelafgifte tussen pH 7,4 en pH 5,0 buffers

In vitro geneesmiddelafgifte

Het afgiftegedrag van PTX en TQD van PD-PTLP werd bestudeerd in pH 7,4 en pH 5,0-omstandigheden bij 37 °C. Zoals getoond in Fig. 2c, werd gedurende de onderzoeksperiode (72 uur) een gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen (PTX en TQD) waargenomen van de PD-PTLP. De afgifte van geneesmiddel uit de dikke dubbellaag van nanoliposoom zou verantwoordelijk kunnen zijn voor de langzame en aanhoudende afgifte van twee geneesmiddelen uit de PD-PTLP. Opgemerkt moet worden dat er geen significant verschil werd waargenomen in het afgiftepatroon van PTX en TQD in pH 7,4 en pH 5,0. Op een langer tijdstip werd een significant verschil in afgifte waargenomen in verschillende pH-omstandigheden. Het is vermeldenswaard dat er geen pH-responsieve elementen zijn toegevoegd in het nanoliposoom en dat een hogere geneesmiddelafgifte in zure omstandigheden kan worden toegeschreven aan de hogere diffusie bij een lagere pH. Bijvoorbeeld, ~~85% van PTX vrijgegeven in pH 5,0-omstandigheden vergeleken met ~~55% van geneesmiddelafgifte bij fysiologische pH-omgeving. Een vergelijkbaar patroon van snelle afgifte van kleine moleculen bij zure omstandigheden en langzamere afgifte in basische pH-omstandigheden is door andere onderzoekers aangetoond. Desalniettemin zou een relatief lage geneesmiddelafgifte bij pH 7,4 de onnodige systemische bijwerkingen kunnen verminderen en de systemische circulatie verlengen, terwijl een hogere geneesmiddelafgifte in pH 5,0 de hogere therapeutische werkzaamheid in de tumorweefsels ten goede zou kunnen komen.

In vitro cellulaire opname-analyse

De leveringsefficiëntie van gerichte (PD-PTLP) en niet-gerichte (PTLP) nanoliposomen werd getest in SGC7901/ADR. De cellulaire opname werd geëvalueerd met behulp van rhodamine-B als een fluorescentietracker. Rhodamine-B is de veelgebruikte fluorofoor zonder celbiologische interacties. Nucleus werd gekleurd met blauwgekleurde DAPI en de rode kleur was afkomstig van de nanodeeltjes. De CLSM-gegevens laten duidelijk zien dat PD-PTLP een sterke rode fluorescentie in de kankercellen vertoonde in vergelijking met die van niet-gericht PTLP. Een hogere rode fluorescentie in met PD-PTLP behandelde kankercellen toegeschreven aan de hogere internalisatie van nanodeeltjes (figuur 3a). De uitkomst van de CLSM-gegevens geeft aan dat de op het celmembraan tot expressie gebrachte PD-L1-receptor werd herkend door PD-L1-mAb dat op het nanoliposoomoppervlak was geconjugeerd. Een niet-specifiek of passief opnamemechanisme was duidelijk in de met PTLP behandelde kankercellen. De PD-L1-doelspecificiteit werd verder bevestigd door PD-L1-mAb-voorbehandelingsexperiment. De SGC7901/ADR-cellen werden voorbehandeld met PD-L1-mAb en 30 minuten geïncubeerd. De cellen werden vervolgens blootgesteld aan PD-PTLP en PTLP en 3 uur geïncubeerd. Zoals getoond (Fig. 3b), vertoonden cellen die waren voorbehandeld met PD-L1-mAb significant minder rode fluorescentie vergeleken met die van niet-behandelde cellen, wat aangeeft dat PD-L1-mAb werd geconsumeerd door de aan het oppervlak tot expressie gebrachte receptoren en dat er geen extra receptoren beschikbaar waren voor binding en internalisatie resulterend in minder opname van nanodeeltjes en minder internalisatie. Deze CLSM onthulden duidelijk de targetingspecificiteit van PD-PTLP in SGC7901/ADR-kankercellen.

een Confocale laser scanning microscopie (CLSM) beelden van SGC7901/ADR-cellen na incubatie met PTLP en PD-PTLP gedurende 3 uur; CLSM-beelden van SGC7901/ADR-cellen voorbehandeld met/zonder PD-L1-mAb na incubatie met PD-PTLP gedurende 3 uur. Rhodamine B werd gebruikt als een fluorescerende tracker en DAPI werd gebruikt om de kern van de kankercellen te kleuren

Dubbele, met medicijnen beladen nanoliposomen versterken het antiproliferatieve effect

Voor combinatietherapie werden verschillende verhoudingen van twee geneesmiddelen (PTX en TQD) gebruikt om de mate van synergetisch of additief effect op de resistente maagkankercellen vast te stellen. Om het isobologram en de combinatie-index (CI) te berekenen, werd CalcuSyn-software (Biosoft, versie 2.1) gebruikt. De isobologramplot kan worden verklaard op basis van de Chou-Talalay-vergelijking. De CI-waarden worden gekenmerkt door synergetisch (CI < 0.9), additief (CI =1) en antagonistisch (CI> 1). Zoals getoond, onthulden alle combinatieverhoudingen van PTX en TQD een CI-waarde van <-1, wat een synergetisch werkingsmechanisme aanduidt (figuur 4a). Om specifiek te zijn, de hoogste synergie werd waargenomen bij een gewichtsfractie van 1/0,5 (P/T), terwijl het niveau van synergie afnam met de toename van de TQD-gewichtsfractie, wat het belang aangeeft van de aanwezigheid van twee geneesmiddelen in de specifieke gewichtsfractie. Een te lage en te hoge concentratie van TQD in een combinatieregime leverde niet het beste synergetische effect op. Voor alle in vitro-experimenten hebben we in het onderzoek de P/T =1/0,5-verhouding gebruikt.

een Combinatie-index (CI) van verschillende gewichtsfracties van PTX en TQD in SGC7901/ADR-cellen. De combinatie-index is geëvalueerd door Calcusyn ^TM software. b In vitro cellevensvatbaarheid van SGC7901/ADR-cellen na behandeling met verschillende concentraties vrij PTX, TQD, PTLP en PD-PTLP gedurende een incubatieperiode van 24 uur. c Western-blot-analyse van p-gp-expressie in SGC7901/ADR-cellen na behandeling met respectieve formuleringen. **p <0.01 en ***p <0,001 is het statistische verschil tussen vrije PTX en PD-PTLP-behandelde groep

Het in vitro cytotoxische effect van zowel individuele als combinatiegeneesmiddelen werd bepaald door het MTT-protocol na een incubatie van 24 uur. Zoals getoond in Fig. 4b, had blanco NP geen enkel effect op de levensvatbaarheid van de cellen, waardoor de mogelijkheid van enige interferentie in de uiteindelijke resultaten werd uitgesloten. De monotherapie met PTX en TQD vertoonde echter een concentratie-afhankelijk cytotoxisch effect in de resistente maagkankercellen; het voldeed niet aan een merkbare effectiviteit bij de behandeling. Het anti-proliferatieve effect van een enkelvoudig middel werd opmerkelijk verbeterd in combinatie met het tweede medicijn ingekapseld in een nanoliposoom. The combination of PTX and TQD resulted in obvious synergistic effect compared to that of individual drugs alone. Moreover, PD-L1 mAb-conjugated nanoliposome (PD-PTLP) exhibited the strongest anti-proliferative effect indicating the influence of the targeting ligand on the nanoparticle surface. This enhanced cell killing in the PD-L1-targeted treatment group might be attributed to the high cellular internalization of PD-L1-targeted nanoliposomes by SGC7901/ADR cells consistent with the cellular uptake analysis. The IC50 value of PD-PTLP was 0.76 μg/ml compared to 6.58 μg/ml and 7.64 μg/ml for PTX and TQD, respectively. A ten-fold decrease in IC50 value of PD-PTLP clearly indicates that resistance to PTX in p-gp overexpressing SGC7901/ADR was reversed by TQD. Our in vitro results showed that TQD was effective in reversing the multidrug resistance in SGC7901/ADR cells. Results also showed that nanoliposomes retained the pharmacological actions of encapsulated drugs and released the drug in a controlled manner in the cancer cells. The combination therapy with PTX and TQD enhanced the anticancer efficacy with increased synergistic activity, outperforming the minimal advantages of monotherapy and possible associated side effects. Overall, combination treatment of PTX with an effective p-gp inhibitor in nanoliposome could be a promising strategy to overcome MDR and treat gastric cancers.

In order to evaluate the molecular mechanism, Western blot analysis was performed on SGC7901/ADR. As shown (Fig. 4c), PTX did not have any effect on the p-gp protein expression while on the contrary, TQD significantly downregulated the p-gp expression confirming its pharmacological role as a p-gp inhibitor. Interestingly, combination drug-based PTLP and PD-PTLP showed insignificant difference in protein expression compared to that of TQD-treated cancer cells. The result demonstrated the advantage of loading PTX and TQD (P-gp inhibitor) together in a single nanocarrier system. The Western blot result could be corroborated with the cell viability results where combination of PTX + TQD reversed the MDR and exhibited higher anticancer efficacy in gastric cancer cells.

Apoptosis analysis by flow cytometer

Apoptosis analysis of individual formulation was evaluated by Annexin V-FITC/PI staining method using flow cytometer. Results of apoptosis are presented in Fig. 5a. A shown, control cells did not show any sign of apoptosis, whereas free PTX and TQD exhibited obvious increase in the apoptosis cells. Combination drug-based PTLP showed two-fold higher apoptosis compared to that of individual drugs indicating the synergistic anticancer effect of the formulations. More importantly, PD-PTLP showed the highest apoptosis of cancer cells with around 60% under apoptosis region. Enhanced apoptosis effect of PD-PTLP was attributed to higher internalization of dual-drug-loaded nanocarriers and synergistic potential of PTX and TQD in a ratiometric manner. The p-gp silencing effect of TQD in combinational regimen enhanced the anticancer effect of PTX in the cancer cells. The apoptosis rate of individual drug was in the range between 20 and 25% while around 60% of apoptosis cells were observed for PD-PTLP-treated cells. The PD-PTLP induced more apoptosis than free drugs and non-targeted liposomes, suggesting that the PD-L1 could deliver PTX/TQD more efficiently to induce apoptosis of the SGC7901/ADR cells.

een Apoptosis assay of SGC7901/ADR cells after staining with Annexin V/PI combo using flow cytometer. The cells were treated with a fixed concentration of 2 μg/ml. b Reactive oxygen species (ROS) analysis of SGC7901/ADR cells using 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) as a probe. ***p <0.001 is the statistical difference between free PTX and PD-PTLP-treated group

Intracellular ROS level determination

We have explored the ability of individual drug and dual drug to affect the redox state of the cancer cells cell by evaluating the level of reactive oxygen species (ROS) in gastric cancer cells. ROS levels in cancer cell were evaluated by DCFH-DA (green fluorescence). Quantitative ROS data are presented in Fig. 5b. As shown, non-treated cells did not have any sign of ROS; however, PTX or TQD did induce appreciable levels of ROS generation. Importantly, TPLP and PD-TPLP triggered a significantly higher levels of ROS compared to that of free PTX or TQD or non-treated control cells. A remarkably higher ROS indicates the potential of PD-TPLP to promote higher apoptosis. Microscopic images corroborate with the quantitative results with brightest and higher intensity green fluorescence compared to untreated or free PTX or TQD treated cancer cells. The higher intensity of green fluorescence is an indication of higher ROS production. Oxidative stress such as ROS is considered to be an important indicator of cellular cytotoxicity. Studies have shown that induction of ROS induce a scores of physiological events including DNA damage, inflammation, and cell apoptosis.

Combination of PTX and TQD inhibited growth in drug-resistant tumors

Finally, therapeutic efficacy and toxicity parameters of formulations were investigated on drug-resistant SGC7901/ADR xenograft tumor model (Fig. 6a). The drugs were intravenously administered at a fixed dose of 5 mg/kg for every 3 days with a total of three injections. The PTX/TQD was administered at a fixed weight fraction of 1/0.5. On the expected line, free PTX and free TQD did not show any inhibitory effect on the growth of MDR tumors, suggesting the fact that the SGC7901/ADR cells manifest drug tolerance on the proliferation of MDR tumors. P-gp inhibitor (TQD) though efficient in inhibiting the drug efflux pumps however does not convert into improved therapeutic outcome. In comparison, combination of PTX + TQD (PTLP) displayed a significant inhibition of growth of drug-resistant tumors. The best antitumor efficacy was observed with PD-PTLP which was three-fold effective compared to control, 2.5 compared to free drugs, and approximately two-fold effective in reducing the tumor burden compared to non-targeted formulations (p <0.05; p <0.001). The final tumor volume of control, free PTX, TQD, PTLP, and PD-PTLP was ~ 2000 mm ³ , ~ 1650 mm ³ , 1625 mm ³ , ~ 1000 mm ³ , and ~ 650 mm ³ , respectievelijk. Free drugs were slightly effective during the initial time point; however, they grew the same as that of non-treated control group. Results clearly reveal the potential of combination of PTX + p-gp inhibitor as a unique strategy to effectively control the tumor burden. The extensive tumor suppression in PD-PTLP clearly suggests the greater antitumor efficacy of the targeted formulations group. The tumors were extracted and weighed; tumor weights were consistent with the tumor volume data (Fig. 6b). PD-PTLP-treated mice group showed the smallest tumor compared to any other formulation-treated group (p <0.001). To further verify the inhibitor effect of individual tumors, tumors were subjected to TUNEL assay (Fig. 6c). As shown, PD-PTLP showed the large swaths of apoptosis staining compared to non-treated control or free drugs. PD-PTLP showed apparent apoptosis traits with disorganized cell arrangements. The prominent tumor killing effect of PD-PTLP displays the greater cancer cell inhibition in drug-resistant tumor cells. The excellent efficacy of PD-PTLP was mainly attributed to the presence of targeted ligand (PD-L1 mAb) which binds with the respective receptors and increases the intracellular concentrations. The presence of combination regimen and release in a controlled manner for prolonged time also contributed for its enhanced efficacy. In addition, dense hydrophilic PEG surface corona might offer excellent physical stability to the particles and could potentially avoid the unnecessary protein absorption and avoid rapid clearance. The long circulation and nano-scaled size in turn benefit the higher accumulation of particles in the tumor tissues [31,32,33].

In vivo antitumor efficacy of different formulations against multidrug resistant (MDR) SGC7901/ADR tumors; een tumor volume, b tumor weight analysis, and c TUNEL assay of tumor tissues. The mice were administered with a fixed dose of 5 mg/kg with duration of three times for three administrations. Apoptotic cells wells were evaluated by TUNEL assay. *p <0.05 and **p <0.05 (PTLP vs. PD-PTLP), ***p <0.001 (PTX vs. PD-PTLP)-treated group.

Systemic toxicity analysis

The change in body weight is a good indicator of systemic toxicity. As shown (Fig. 7a), mice treated with free PTX shed ~ 20% of body weight on day 10 which gradually decreased to regain the original body weight toward the end of the study. Loss of more than 5% of body weight is considered to cause severe internal toxicity and 20% of body weight loss is considered a significant adverse effect of free drugs [31]. On the contrary, PTLP or PD-PTLP did not cause any such loss of body and the mice remain healthy throughout the study period indicating the safety index of the nanoliposomes. Delivery system with no systemic toxicity and enhanced antitumor efficacy is considered to be highly effective in tumor treatment. The safety of nanoparticles was further studied by measuring plasma levels of enzymes. Plasma levels of aminotransferases (AST and ALT) are measured following the 24-h administration of respective formulations (Fig. 7b, c). As shown, free PTX resulted in significant increase (p <0.01) in the levels of AST and ALT while PD-PTLP and PTLP were insignificantly different compared to that of non-treated control. AST is released in serum upon organ damage such as heart, kidney, or liver while ALT is specifically released in case of liver injury [34]. The levels of AST and ALT serves as a specific indicator of organ damage and in this regard PD-PTLP showed to be a safe carrier.

Systemic toxicity analysis of individual formulations in SGC7901/ADR tumors; een mice body weight analysis; b , c blood biochemical evaluation of serum levels of AST and ALT as a systemic toxicity parameters. *p <0.05 and **p <0.01 is the statistical difference between free PTX and PD-PTLP treated group