Een nieuw mechanisme dat ten grondslag ligt aan meerwandige, door koolstof nanobuisjes geactiveerde, laterale wortelvorming van tomaten:de betrokkenheid van stikstofmonoxide

Resultaten

MWCNT's komen niet alleen in wortelcellen, maar bevorderen ook LR-vorming

LR-vorming is een belangrijke bepalende factor voor de architectuur van wortelsystemen. Om het effect van MWCNT's op LR-vorming te onderzoeken, werden 3 dagen oude tomatenzaailingen gedurende 3 dagen geïncubeerd met een reeks concentraties MWCNT's (0,05, 0,5, 5 en 50 mg / ml). De toepassing van 1-naftylazijnzuur (NAA) werd als een positieve controle beschouwd. In ons experiment werden zowel het LR-nummer als de lengte bepaald als twee parameters van LR-vorming. Zoals getoond in Fig. 1, in vergelijking met de controlemonsters, induceerden exogene MWCNT's significant LR-vorming op een ongeveer dosisafhankelijke manier, met een maximaal effect in 5 en 50  mg / ml. Een vergelijkbare induceerbare respons werd waargenomen wanneer 200 nM NAA werd toegediend. Gezien de kosten van MWCNT's en induceerbare respons bij LR-vorming, werd 5  mg / ml MWCNT's toegepast in de volgende experimenten.

MWCNT-geïnduceerde tomaat LR-vorming was op een ongeveer dosisafhankelijke manier. Drie dagen oude tomatenzaailingen werden behandeld met respectievelijk 200 nM NAA en de aangegeven concentraties MWCNT's. Het aantal en de lengte van de uitgekomen zijwortels (> 1 mm) per zaailing werden vervolgens bepaald na 3 dagen behandeling. Er waren 30 (10  ×  3) planten in drie biologische replica's en de experimenten werden 3 keer uitgevoerd. Gegevens zijn het middel ± SE. Binnen elke reeks experimenten verschilden balken die met dezelfde letter werden aangeduid niet significant op p < 0,05 niveau volgens de meervoudige test van Duncan

Om de specifieke functie van MWCNT's bij de inductie van LR-vorming te valideren, onderzoeken we verder of de andere allotropieën van MWCNT's ook dergelijke induceerbare effecten hebben. Zoals getoond in Fig. 2a vertoonden al deze koolstofnanomaterialen toxische effecten op de scheutgroei (gegevens niet getoond). Interessant is dat de toepassing van MWCNT's, enkelwandige koolstofnanobuisjes (SWCNT's), grafeen en actieve koolstof met identieke concentratie (5 mg / ml) differentieel zou kunnen resulteren in de toename van het LR-aantal en de lengte, vergeleken met de chemicaliënvrije controleplanten (Fig. 2b). Van deze chemicaliën werd de maximaal induceerbare respons ontdekt in MWCNT-geïncubeerde tomatenzaailingen.

Veranderingen in laterale wortelvorming als reactie op verschillende koolstofnanodeeltjes. Drie dagen oude tomatenzaailingen werden behandeld met gedestilleerd water (Con), 5 mg / ml MWCNT, enkelwandige koolstofnanobuisjes (SWCNT's), grafeen en actieve koolstof (AC), respectievelijk gedurende nog eens 3  dagen. een Vervolgens werden representatieve foto's gemaakt. b Het aantal en de lengte van de uitgekomen zijwortels (> 1 mm) per zaailing werden vervolgens ook bepaald. Schaalbalk = 50 mm. Er waren 30 (10  ×  3) planten in drie biologische replica's en de experimenten werden 3 keer uitgevoerd. Gegevens zijn het middel ± SE. Binnen elke reeks experimenten verschilden balken die met dezelfde letter werden aangeduid niet significant op p < 0,05 niveau volgens de meervoudige test van Duncan

Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) kan de verdeling van MWCNT's eenvoudig worden geëvalueerd. De resultaten getoond in Fig. 3 onthulden dat MWCNT's, wanneer exogeen toegepast, konden worden geabsorbeerd door tomatenzaailingen, en de distributie van MWCNT's bleek in wortelcellen te zijn. Dit resultaat kan worden begrepen, aangezien de wortels van zaailingen direct worden gekweekt in een vloeibare oplossing die MWCNT's bevat.

Verdeling van MWCNT's in tomatenwortels. TEM-beelden van 3 dagen oude tomatenzaailingen behandeld met gedestilleerd water (Con; a ) of 5 mg/ml MWCNT's (b ) voor 1  dag werden genomen. Rode pijl geeft celwand aan, terwijl witte pijl MWCNT's aangeeft

MWCNT-geïnduceerde NO-synthese en daarna LR-formatie waren gevoelig voor cPTIO, een aaseter van NO

Om te onderzoeken of NO ook betrokken is bij MWCNT-geïnduceerde LR-vorming, werd de functie van NO in LR-vorming opgewekt door MWCNT's beoordeeld door endogene NO-niveaus te manipuleren met behulp van NO-afgevende verbinding en de scavenger. Net als bij de eerdere resultaten [31], zou de toediening van natriumnitroprusside (SNP) kunnen resulteren in de inductie van LR-vorming, en een additieve respons werd waargenomen wanneer SNP en MWCNT's samen werden toegepast (Fig. 4). Toen 2-(4-carboxyfenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide kaliumzout (cPTIO; een wegvanger van NO) werd toegevoegd, waren de promotiereacties in LR-vorming veroorzaakt door MWCNT's significant verzwakt. Alleen cPTIO zou de ontwikkeling van LR kunnen remmen, vergeleken met de chemicaliënvrije controle, wat wijst op de belangrijke rol van endogeen NO in de organogenese van wortels.

Door MWCNT geïnduceerde LR-vorming was gevoelig voor de verwijdering van endogeen NO met cPTIO, de aaseter ervan. Drie dagen oude tomatenzaailingen werden gedurende 3 dagen alleen of in combinatie behandeld met gedestilleerd water, 5 mg / ml MWCNT, 0,1 mM SNP, 0,2 mM cPTIO. Daarna werd het aantal en de lengte van de uitgekomen zijwortels (> 1 mm) per zaailing bepaald. Er waren 30 (10  ×  3) planten in drie biologische replica's en de experimenten werden 3 keer uitgevoerd. Gegevens zijn het middel ± SE. Binnen elke reeks experimenten verschilden balken die met dezelfde letter werden aangeduid niet significant op p < 0,05 niveau volgens de meervoudige test van Duncan

Om de belangrijke rol van endogeen NO in de MWCNT-respons verder te evalueren, werd eerst een tijdsverloop van NO-productie in vivo gedetecteerd met de Greiss-reagensmethode. Tijdens bovenstaande bepaling werd het identieke filtraat voorbehandeld met cPTIO als een blanco beschouwd voor de nauwkeurige resultaten. Er werd waargenomen dat de NO-productie in de wortels van tomatenzaailingen dramatisch was verhoogd tot 24 uur na MWCNT-behandeling en daarna herstelt tot de oorspronkelijke niveaus (48 uur; Fig. 5a). Boven het maximale niveau van endogeen NO, veroorzaakt door MWCNT's gedurende 24 h, werd duidelijk afgeschaft door cPTIO, een aaseter van NO, wat de specifieke rol van NO suggereert.

MWCNT-geïnduceerde NO-productie werd geblokkeerd door cPTIO, de aaseter van NO. Drie dagen oude tomatenzaailingen werden behandeld met gedestilleerd water en 5 mg / ml MWCNT's met of zonder respectievelijk 0,2  mM cPTIO. een Veranderingen in NR-activiteit (links) en NO-productie (rechts) bepaald met behulp van de Greiss-reagensmethode. b Na behandeling gedurende 24 h werd het NO-signaal geanalyseerd door LSCM (links) en EPR (rechts). Schaalbalk = 0.1 mm. Gegevens zijn het middel ± SE. Bars aangeduid met dezelfde letter verschilden niet significant bij p < 0,05 niveau volgens de meervoudige test van Ducan

Om bovenstaande resultaten te bevestigen, werden zowel LSCM als ESR aangenomen. Ten eerste werden de veranderingen in endogene NO-niveaus in zaailingwortels van tomaat gevolgd door NO te labelen met behulp van de celdoorlatende, redelijk NO-specifieke fluorescente sonde DAF-FM DA en beeldvorming met LSCM. Net als bij de vorige resultaten (Fig. 5a), werd in aanwezigheid van cPTIO de verhoogde DAF-FM-afhankelijke fluorescentie-intensiteit veroorzaakt door MWCNT's sterk afgeschaft (Fig. 5b). Deze resultaten impliceerden dat de DAF-FM-getriggerde fluorescentie gerelateerd is aan endogene NO-niveaus in de wortels van tomatenzaailingen.

MWCNT-geïnduceerde NO-productie werd bevestigd door EPR-spectroscopie. Zoals verwacht, vertoonden zaailingwortels die gedurende 24 h waren behandeld met MWCNT's het typische hyperfijne structuurtriplet van het NO-complex. De toevoeging van cPTIO schafte het bovenstaande signaal echter af, wat aangeeft dat blootstelling aan MWCNT resulteerde in een sterke NO-productie (figuur 5b). Samen suggereerden deze gegevens dat er GEEN synthese nodig zou kunnen zijn voor MWCNT-getriggerde LR-vorming in tomatenzaailingen.

NR is mogelijk verantwoordelijk voor door MWCNT geïnduceerde NO-productie en daarna LR-vorming

Aangezien NR en zoogdierachtige NOS twee belangrijke enzymen zijn die gerelateerd zijn aan NO-synthese in planten, werden zowel wolframaat (een NR-remmer) als NAME (een zoogdier-NOS-remmer) in het daaropvolgende experiment toegepast. Hier onderdrukte de behandeling met wolframaat de bevordering van LR-vorming in met MWCNT behandelde wortels van tomatenzaailingen (Fig. 6). Ter vergelijking:de inductie van LR-vorming veroorzaakt door MWCNT's werd niet sterk geremd door de toevoeging van NAME, wat aangeeft dat zoogdierachtige NOS mogelijk niet het beoogde NO-synthetische enzym is dat verantwoordelijk is voor de NO-productie die wordt opgewekt door MWCNT's. Er werd ook waargenomen dat een lichte maar geen significante afname in LR-vorming werd waargenomen in tomatenzaailingen wanneer ofwel wolframaat of NAME afzonderlijk werd toegepast.

Veranderingen in LR-vorming als reactie op MWCNT's en twee remmer van NO-synthese. Drie dagen oude tomatenzaailingen werden gedurende 3 dagen alleen of in combinatie behandeld met 5 mg / ml MWCNT, 20 M wolframaat (Tg), 0,2 m NAME. Daarna werd het aantal en de lengte van de uitgekomen zijwortels (> 1 mm) per zaailing bepaald. Er waren 30 (10  ×  3) planten in drie biologische replica's en de experimenten werden 3 keer uitgevoerd. Gegevens zijn het middel ± SE. Binnen elke reeks experimenten verschilden balken die met dezelfde letter werden aangeduid niet significant op p < 0,05 niveau volgens de meervoudige test van Duncan

De rol van NR in MWCNT-getriggerde LR-vorming werd verder onderzocht door de NO-productie te volgen als reactie op toegepaste MWCNT's met of zonder wolframaat. Vergeleken met de veranderingen in endogene NO-productie (Fig. 5a), toonde tijdsverloopanalyse in NR-activiteit de vergelijkbare neiging (Fig. 7a), ook met een piek bij 24 h na behandeling met MWCNT's. Deze resultaten suggereerden dat door MWCNT geïnduceerde toename van NO-productie voornamelijk het gevolg kan zijn van verhoogde activiteit van NR. Consistent werd de remming van NR-afhankelijke NO-productie door wolframaat bevestigd met behulp van de Greiss-reagensmethode (Fig. 7b), LSCM en EPR (Aanvullend bestand 1:Figuur S1).

Door MWCNT geïnduceerde NO-productie werd geblokkeerd door wolframaat, een remmer van NR. Drie dagen oude tomatenzaailingen werden behandeld met gedestilleerd water en 5 mg / ml MWCNT's met of zonder 20  μM wolframaat (Tg). Wijzigingen in NR-activiteit (a ) en GEEN productie (b ) bepaald met behulp van de Greiss-reagensmethode. Gegevens zijn het middel ± SE. Bars aangeduid met dezelfde letter verschilden niet significant bij p < 0,05 niveau volgens de meervoudige test van Ducan

Discussie

Fytotoxiciteit is een belangrijke overweging bij het begrijpen van de potentiële milieu-impact van nanodeeltjes [4, 7, 61,62,63]. Overvloedig bewijs onthulde dat MWCNT's giftig zijn voor planten, waaronder het induceren van oxidatieve schade, het remmen van zaadkieming, wortelgroei en ontwikkeling [11, 63, 64]. Omdat het echter een fenotype van SIMR is, is wortelvertakking door laterale wortelvorming een belangrijk onderdeel van het aanpassingsvermogen van het wortelstelsel aan verschillende omgevingsfactoren [17]. In dit werk hebben we biologische, farmacologische en biochemische analyse geïntegreerd om de betrokkenheid van NR-gemedieerde NO-productie bij MWCNT-geïnduceerde LR-vorming aan te tonen, althans gedeeltelijk in onze experimentele omstandigheden. Ook benadrukte de functie van NO in wortelorganogenese gestimuleerd door MWCNT's de centrale rol van deze tweede boodschapper die betrokken is bij het ontwikkelingsproces van planten en aanpassing tegen stress [29,30,31,32,33, 37, 38].

Ten eerste hebben we bevestigd dat MWCNT's van 5 mg / ml (OD 6-12 nm) in wortelweefsels zouden kunnen komen (Fig. 3). Daarna werd de inductie van tomaat LR-vorming waargenomen (Fig. 1), waarbij de inductierollen van NAA en SNP werden nagebootst (Fig. 4), een bekende NO-afgevende verbinding [30, 31]. Vergelijkbare inducerende reacties werden ontdekt in harsachtige bomen [41], sla [42] en Arabidopsis [43] wanneer ze werden uitgedaagd met MWCNT's (respectievelijk OD 6-13 nm, ongeveer 9.5 nm en 30-40 nm). De toepassing met ofwel ongerepte MWCNT (p-MWCNT) of carboxyl-gefunctionaliseerde MWCNT (c-MWCNT) (gemiddelde diameter 9,5 nm) zou bijvoorbeeld de ontwikkeling van LR in slazaailingen kunnen bevorderen [42]. Daarentegen werd de remming van primaire wortel- en zelfs LR-vorming gelijktijdig gevonden in sojabonenplanten wanneer ze werden onderworpen aan MWCNT's (OD 20-70 nm [40];). Door te vergelijken met de gegevens in buitendiameter van MWCNT's (tabel 1), veronderstelden we dat MWCNT-vertoonde effecten op LR-vorming varieerden met hun diameters, wat de promotie met een lagere diameter en de remming met een hogere diameter liet zien. Zeker, het gerelateerde mechanisme moet zorgvuldig worden onderzocht. Een soortgelijk fenomeen werd bevestigd in de tolerantie voor zoutgehalte van planten [50]. Gecombineerd met bovenstaande resultaten werd verder afgeleid dat de functie van nanomaterialen per soort kan verschillen, en omgekeerd kunnen verschillende soorten nanomaterialen verschillende biologische effecten veroorzaken. Andere beïnvloedende factoren, zoals verschillende doses MWCNT's [48] en zelfs plantengroeiomstandigheden, konden echter niet gemakkelijk worden uitgesloten.

Vergeleken met andere nanomaterialen, waaronder SWCNT, grafeen en AC met een identieke concentratie, werden de maximale inductie in LR-vorming en zelfs toxische effecten op scheutgroei waargenomen in MWCNT's (Fig. 2). Deze kunnen verband houden met de speciale fysieke kenmerken van MWCNT's, een type nanomaterialen met een hoge elektrische geleidbaarheid, een groot specifiek oppervlak, een hoge aspectverhouding en een opmerkelijke thermische stabiliteit [65]. De toxische effecten van nanomaterialen zijn op grote schaal gerapporteerd in komkommer, kool, wortel, ui enz. [66, 67].

Voldoende bewijs toonde aan dat NO, dat werkt als een signaalmolecuul, een breed scala aan plantprocessen kan reguleren, van aanpassing aan de omgeving tot ontwikkeling, en de laatste omvat zaadkieming en wortelorganogenese [29, 68,69,70,71,72,73 ]. Ons daaropvolgende experiment onthulde dat NO mogelijk betrokken is bij MWCNT-geïnduceerde LR-vorming. Hoewel er verschillende methoden zijn toegepast om de NO-productie in plantencellen in beeld te brengen, kunnen de nadelen, waaronder het gebrek aan gevoeligheid en de interferentie door NO-onafhankelijke moleculen, in elke methode voorkomen [74]. Zo werden drie methoden die verantwoordelijk zijn voor NO-beeldvorming en -bepaling, waaronder Greiss-reagensmethode, LSCM en EPR, samen met de toepassing van cPTIO, een aaseter van NO, toegepast in onze experimentele omstandigheden. Door drie methoden te gebruiken, hebben we waargenomen dat een verhoogde endogene NO-productie geïnduceerd door MWCNT's in tomatenzaailingen werd teniet gedaan door cPTIO (Fig. 5), een aaseter van NO [30,31,32]. Belangrijk is dat dit proces gecorreleerd was met de biologische respons van MWCNT-geïnduceerde LR-ontwikkeling, die ernstig werd geblokkeerd toen cPTIO gelijktijdig werd toegepast (Fig. 4).

Verdere evaluatie van deze reacties en de mogelijke bron(nen) van NO geïnduceerd door exogeen toegepaste MWCNT's onthulde dat NO-productie en daarna LR-vorming kon worden toegeschreven aan NR-activiteit. In planten wordt NO-productie voornamelijk gegenereerd uit NR en NOS-achtig eiwit van zoogdieren [28]. Het NOS-gen van planten is echter nog steeds niet geïdentificeerd [35, 75, 76], hoewel sommige experimenten met de remmers van het zoogdier NOS-enzym enig bewijs leverden van een l-arginine-afhankelijke route in NO-productie [36, 76]. Het is bevestigd dat NR de belangrijkste bronnen van NO in planten is [28]. Eerdere studies toonden aan dat NR-afhankelijke NO-productie functioneert als een nitraatgerelateerd signaal dat betrokken is bij de regulatie van wortelarchitectuur [32, 33]. Bovendien was NR-afhankelijke NO-productie nauw geassocieerd met koude acclimatisatie [38], zoutgehaltetolerantie [50] en abscisinezuur-geïnduceerde stomatale sluiting [77]. Onze resultaten onthulden verder dat wolframaat (een remmer van NR) duidelijk de MWCNT-geïnduceerde LR-vorming verslechterde, vooral in LR-lengte (Fig. 6). Daarentegen was er slechts een lichte afname in LR-lengte en werd er geen significant verschil waargenomen in LR-getal wanneer l-NAME (een remmer van zoogdier-NOS) werd gebruikt. Consequent toonde biochemische test aan dat NR-activiteit duidelijk werd verhoogd door MWCNT's (Fig. 7a), parallel aan de veranderingen in NO-productie (Fig. 5a). Bovenstaande reacties kunnen volledig worden geblokkeerd door wolframaat (Fig. 7a, Aanvullend bestand 1:Figuur S1). We hebben dus afgeleid dat de verhoogde endogene NO-productie geïnduceerd door MWCNT's voornamelijk werd toegeschreven aan de NR-route. Er moet zeker verder genetisch bewijs worden onderzocht.

Conclusie

In summary, we provide evidence to show that MWCNT-induced NO production via NR might be required for tomato lateral root formation and this was summarized in Fig. 8. Importantly, above findings provide insights into the intricate molecular mechanism of MWCNTs functions in plants.

Schematic representation of the proposed MWCNT-induced tomato lateral root formation mainly via NR-dependent NO production. The role of mammalian NOS-like enzyme was preliminarily ruled out

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Alle gegevens zijn onbeperkt beschikbaar.

Afkortingen

CO:

Koolmonoxide

cPTIO:

2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide potassium salt

DAF-FM DA:

4-Amino-5-methylamino-2′,7′-difluorofluorescein diacetate

EPR:

Elektron paramagnetische resonantie

GO:

Grafeenoxide

H₂ :

Hydrogen gas

H₂ O₂ :

Waterstofperoxide

l-NAME:

N ^G -Nitro-l-arginine methyl ester

LR:

Lateral root

LSCM:

Laser scanning confocal microscopy

MWCNTs:

Multi-walled carbon nanotubes

NAA:

1-Naphthylacetic acid

NO:

Nitric oxide

NOS:

Nitric oxide synthase

NR:

Nitrate reductase

ROS:

Reactieve zuurstofsoorten

SIMR:

Stress-induced morphogenic response

SNP:

Sodium nitroprusside

SWCNTs:

Single-walled carbon nanotubes

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie

Tg:

Tungstate