Preparatie en farmacokinetisch onderzoek van lang-circulerende Daidzein-liposomen

Methoden

Materialen

Sojafosfatidylcholine (SPC) werd gekocht bij Lipoid GmbH (Duitsland). Cholesterol en DSPE-mPEG2000 werden gekocht bij AVT Pharmaceutical Co., Ltd. (Shanghai, China). Methanol en acetonitril van HPLC-kwaliteit werden gekocht bij TEDIA Company (VS). Chloroform en methanol (analytische kwaliteit) werden verkregen van Sinopharm Chemistry Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Het water werd gezuiverd door het Milli-Q® waterzuiveringssysteem ((Millipore, VS). Daidzein (≥ 98% in zuiverheid) werd gekocht bij Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China). Apigenin (interne standaard, IS, ≥ 98% in zuiverheid) werd gekocht bij Delge Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (Nanjing, China). Fosfowolfraamzuurhydraat (analytische kwaliteit) werd gekocht bij Macklin Co., Ltd. (Shanghai, China). Tween-80 en ethyl acetaat werd verkregen van Sigma (Missouri, VS). Mierenzuur (MS-kwaliteit) werd gekocht van Fischer (VS).

Dieren

Tien mannelijke Sprague-Dawley-ratten (200-210 g) werden gekocht bij het ziektepreventie- en controlecentrum van de provincie Hubei met het licentienummer van SCXK (E) 2017-0012. De dierproef werd goedgekeurd door de ethische commissie van Hubei University en voldeed aan de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

Voorbereiding van Daidzein lang-circulerend nanoliposoom (DLCL)

Met deeltjesgrootte en inkapselingsefficiëntie (EE) als evaluatie-indexen, werd het orthogonale ontwerp van vier factoren en drie niveaus (tabel 3) uitgevoerd om de beste afstemming van de molaire verhouding van SPC tot cholesterol (A), de massaverhouding van de geneesmiddel (daidzeïne) tot het totale lipide (SPC en cholesterol) (w/w) (B), hydratatietemperatuur (C) en ultrasone tijd (D) bij een gehalte van 5% DSPE-mPEG2000 [21, 22] .

DLCL werd bereid door middel van dunne film verdamping-sonicatie methode kort beschreven als volgt [21]:sojabonen fosfatidylcholine, cholesterol, DSPE-mPEG2000 en daidzeïne werden opgelost in een rondbodemkolf met 10  mL chloroform-methanol (1:4, v/ v) mengsel. Onder vacuüm en 40°C (waterbad) werd het mengsel gedroogd om een ​​dunne film te vormen in het roterende verdampingsapparaat (RE-2000A, Shanghai Yi-Rong Biochemical Instrument Factory, China), en vervolgens gehydrateerd met 20  mL ultrapuur water door sonicatie (80 w) gedurende 24 min in ijsbad. De liposomale suspensie werd driemaal geëxtrudeerd door achtereenvolgens te filtreren door een microporeus membraan van 0,45 m en 0,22 m. De bereide DLCL-oplossing werd bewaard bij 4°C. Voor langdurige bewaring is de toevoeging van 3% sucrose (gebruikt als lyoprotectant) aan de DLCL-suspensie en vriesdrogen bij -20 °C vereist.

Bepaling van daidzeïne in DLCL door HPLC

De kolom was een Phenomenex ODS analytische kolom (150 mm × 4.6 mm, 5 μm) verbonden met een bewakingskolom (30 mm × 10 mm, 3 μm) met een kolomtemperatuur van 40°C. De mobiele fase bestond uit 10 mM waterige ammoniumacetaatoplossing (A) en methanol (B) met de gradiëntelutie als volgt:0-3,0 min, 45% B tot 80% B; 3,0-4,0 min, 80% B; 4,0-6,0 min, 80% B tot 45% B. De stroomsnelheid was 1 mL/min. De detectiegolflengte was 240 nm. Het injectievolume was 10 L. Het lineaire bereik van daiazeïne was 0,313–50 μg/ml, en de regressievergelijking was y = 35,461x + 1802.4, R ² = 0.9999. De retentietijd van daidzeïne is 4,30 min en er werd geen interferentie van de DLCL-formulering gevonden bij de bepaling van daidzeïne (Fig. 1). De precisie, reproduceerbaarheid, stabiliteit en monsterterugwinning van de analysemethode werden strikt onderzocht en voldeden aan de vereisten van de kwantitatieve analyse (tabel 1).

Typische chromatogrammen van blanco liposomen (a ), daidzeïne-referentiestof (b ), en DLCL-voorbeeld (c )

Voorschriftscreening door orthogonale test

Door deeltjesgrootte en inkapselingsefficiëntie (EE) als evaluatie-indexen te nemen, werd het orthogonale ontwerp van vier factoren en drie niveaus uitgevoerd om de beste afstemming van de molaire verhouding van SPC tot cholesterol (A), de massaverhouding van het geneesmiddel (daidzeïne) te optimaliseren. tot totaal lipide (SPC en cholesterol) (w/w) (B), hydratatietemperatuur (C) en ultrasone tijd (D) bij een gehalte van 5% DSPE-mPEG2000 [21, 22].

Diameter en morfologie van DLCL

De deeltjesgrootte en zeta-potentiaal van de bereide DLCL-oplossing werden gemeten door een laserdeeltjesgrootte-analysator (Zetasizer Nano90, Malven Instruments Limited, Worcestershire, VK) bij kamertemperatuur, 230 V en 50 HZ. De bereide DLCL-oplossing werd 10 keer verdund met zuiver water en vervolgens met een pincet vanaf de rand van het koperen gaas opgenomen. Na drogen bij kamertemperatuur en tegenkleuring met een waterige oplossing van fosfowolfraamzuur (2%, w/v), werd de morfologie van de volledig gedroogde DLCL waargenomen met behulp van een veldemissietransmissie-elektronenmicroscoop (JEM-2100 (HR), JEOL Ltd. , Tokyo, Japan) bij acceleratie 200 kV en zender LaB6.

EE en het laden van medicijnen van DLCL

De EE en geneesmiddelbelading van de bereide DLCL werden bepaald met de dialysemethode die als volgt wordt vermeld:(1) 500 L van de bereide DLCL-oplossing werd toegevoegd aan een dialysezak met een molecuulgewichtsgrens van 8000-14.000 (BioSharp Sai-Guo Biotechnology Co., LTD), knoopte vervolgens de twee uiteinden van de dialysezak stevig vast en plaats de dialysezak in 20  mL water (dialysemedium). Na 12  uur trillen met schudder, werd 1 mL van het dialysemedium genomen en 10 min gecentrifugeerd bij 12000 rpm om de vrije geneesmiddelconcentratie te bepalen (C ₁ ) in het supernatant. (2) Vijfhonderd microliter van de bereide DLCL-oplossing en 2000 L methanol werden gemengd door 15 min te vortexen om de liposomen te vernietigen en vervolgens 10 min gecentrifugeerd bij 12000 tpm om de totale geneesmiddelconcentratie te bepalen (C ₀ ) in het supernatant. (3) Tien milliliter van de bereide DLCL-oplossing (V ₀ ) werd gevriesdroogd om de vaste poedermassa te wegen (W ₀ ). (4) De EE en de medicijnbelading werden als volgt berekend volgens de formule:

In vitro geneesmiddelafgifte

De in vitro afgifte van DLCL en vrij daidzeïne werd bepaald door middel van de dialysemethode. De gesimuleerde maagvloeistof was 0,1 mol/L HCl (pH 1,2) met 0,5% Tween-80 en de gesimuleerde darmvloeistof was 25 mM PBS-buffer (pH 6,9) met 0,5% Tween-80. 0, 5 mL van de bereide DLCL-oplossing werd toegevoegd aan een dialysezak met een onderschepping van het molecuulgewicht van 8000-14.000 en respectievelijk in 20  mL van de twee afgiftemedia geplaatst. De afgiftetestmedia werden continu bij 37°C geroerd (100 tpm). Op de aangegeven tijdstippen (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120 en 144 h), aliquots van het monster (1 mL ) werden uit het dialysaat genomen en vervolgens met dezelfde hoeveelheid verse afgiftemedia aangevuld. Eén milligram per milliliter daidzeïne (opgelost in DMSO) werd als controle gebruikt en respectievelijk in de bovengenoemde twee afgiftemedia voor dezelfde behandeling geplaatst. Daidzein werd op elk tijdstip gemeten en de cumulatieve afgiftesnelheid werd berekend volgens de formule:

In de formule, V ₁ was de steekproefhoeveelheid op elk tijdstip, V ₂ was het volume van het dialysemedium, C ₁ ~C _ik was de concentratie van daidzeïne gemeten op elk tijdstip, en V ₀ en C ₀ waren het volume en de concentratie van DLCL toegevoegd aan de dialysezak.

Farmacokinetiek van DLCL bij ratten

Tien mannelijke Sprague-Dawley-ratten werden willekeurig verdeeld in twee groepen (n = 5). De ene groep was de daidzeïne-groep (gesuspendeerd in 0,5% natriumcarboxymethylcellulose) en de andere groep was de DLCL-groep (opgelost in water). De doses daidzeïne in de twee groepen waren 30 mg/kg. Vóór de orale toediening moesten ratten 12 uur vasten en vrij om water te drinken. Nadat de ratten intragastrisch waren toegediend, werd de daidzeïne-groep 0,5 ml bloed afgenomen van de fundus veneuze plexus van elke rat op 3 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 1,5 h, 2 h , respectievelijk 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 24 h en 36 h. Ondertussen werd de DLCL-groep op dezelfde manier 0,5 mL bloed van elke rat afgenomen bij 1 min, 3 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 1,5 h, 2 h, 3 h , respectievelijk 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 24 h en 36 h. Het bloedmonster werd in een gehepariniseerde centrifugebuis geplaatst en 10 min gecentrifugeerd bij 4000 tpm, en het plasma werd bewaard bij -80°C. Het gehalte aan daidzeïne in het plasmamonster werd bepaald met de gevestigde LC-MS/MS-methode om de geneesmiddeltijdcurve bij de geteste ratten te verkrijgen. De farmacokinetische parameters werden berekend met een niet-compartimentmodel met behulp van DAS3.0-software (Professional Member of Chinese Pharmacology Society, Shanghai, China).

Bepaling van daidazeïne in rattenplasma door LC-MS/MS

Rattenplasmamonsters werden als volgt voorbehandeld:rattenplasma (50 L), methanol (10 L), interne standaard (IS) apigenine opgelost in methanol (10 L, 500 ng / ml) en 5% mierenzuur waterige oplossing (100 L ) werden gemengd in een schone reageerbuis van 1,5 ml. Na kort mengen met de vortex werd 1,2 mL ethylacetaat aan het mengsel toegevoegd. Na 5 min schudden bij kamertemperatuur, werd het mengsel 10 min gecentrifugeerd bij 12.000 rpm. De resulterende bovenste organische fase (1 mL) werd overgebracht naar een andere schone 1,5 ml reageerbuis, verdampt en opnieuw opgelost in de mobiele fase (100 L). Het supernatant verkregen door 10  min te centrifugeren bij 12.000 tpm werd verzameld voor LC-MS/MS-analyse. De kwantitatieve omstandigheden van rattenplasmamonsters worden hieronder beschreven:GL Inertsustain C18 (100 mm × 2.1 mm, 3 μm) werd verbonden met een Shim-pack Column Holder guard column (5,0 mm × 2.0 mm, 1.6 μm) bij een kolomtemperatuur van 40°C; de gradiëntelutie met de stroomsnelheid van 0,2 mL / min werd uitgevoerd met behulp van de mobiele fase bestond uit water (A) -methanol (B) in de omstandigheden van 50% B tot 80% B (0-2,00 min), 80% B (2,00–4,00 min), 80% B tot 50% B (4,00–6,00 min) en 50% B (6,10–8,00 min). Het injectievolume was 10 L. De negatieve ionen multi-reaction monitoring mode (MRM) werd gebruikt om de ionenparen van daidzeïne (m) te detecteren. /z 253.0 → 224.15) en IS (m /z 269.00 → 117.05). De overige condities waren als volgt aangegeven:ESI ionenbron, verwarmingsblok temperatuur 400 °C, DL buis verwarmingstemperatuur 250 °C, verstuivingsgas (N ₂ ) volumestroom 3,0 L/min, drooggas (N ₂ ) volumestroom 15,0 L/min en ionensproeispanning − 4,5 V. De retentietijden van daidzeïne en interne standaard (apigenine) waren respectievelijk 4,5 min en 5,4 min en de endogene stoffen in plasma hadden geen invloed op de bepaling van daidzeïne en interne standaard (Fig. 2). De kwantitatieve methodologie is strikt onderzocht en voldeed aan de vereisten van kwantitatieve analyse van biologische monsters (tabel 2).

HPLC van blanco plasma (a ), daidzeïne + apigenine (interne standaarden) + blank plasma (b ), en plasmamonster (c ). 1, daïdzeïne; 2, apigenine (IS)

Statistische analyse

Gegevens worden weergegeven als gemiddelde   ± standaarddeviatie (SD). Statistische vergelijkingen werden gemaakt met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA), gevolgd door de Tukey-test. Waarden werden als statistisch significant beschouwd bij p <  0,05.

Resultaten en discussie

Effect van voorbereidingsprocessen op nanoliposoomkenmerken

Het orthogonale testontwerp en de testresultaten worden getoond in Tabel 3, en de variantieanalyseresultaten worden getoond in Tabel 4. Intuïtieve analyse (Tabel 3) toonde aan dat de volgorde van invloed van vier factoren op de deeltjesgrootte de verhouding geneesmiddel-lipide was > SPC- cholesterolverhouding > hydratatietemperatuur > ultrasone tijd, die weinig effect had op de inkapselingsefficiëntie. Variantieanalyse (tabel 4) toonde de verhouding tussen geneesmiddelen en lipiden; SPC-cholesterolverhouding heeft een significant effect op de deeltjesgrootte. De optimale voorbereidingsomstandigheden voor DLCL waren A₁ B₁ C₂ D₁ , de verhouding van SPC tot cholesterol was 55:40, de verhouding van geneesmiddel tot lipide was 1:10, de hydratatietemperatuur was 50 °C en de ultrasone tijd was 24 min.

Drie batches DLCL werden parallel bereid volgens het hierboven geoptimaliseerde proces. De EE was 85,3 ± 3,6% en de medicijnbelading was 8,2 ±  1,4%. De gemiddelde deeltjesgrootte was 156,1 ± 3.0 nm met de PDI van 0.294 ± 0.012 en de zeta-potentiaal van − 49 ± 0.6 mV. De deeltjesgrootteverdeling van DLCL werd getoond in Fig. 3, wat aangaf dat onder de geoptimaliseerde bereidingsprocesomstandigheden de bereide DLCL een smalle en uniforme deeltjesgrootteverdeling had. De vorm en structuur van de DLCL-deeltjes die door TEM werden waargenomen, was rond of elliptisch en de grootte was in principe uniform (Fig. 4).

Deeltjesgrootteverdeling van DLCL

TEM-foto van DLCL

Daidzeïne is een typisch medicijn met slechte hydrofiele en lipofiele eigenschappen. De directionele combinatie van het medicijn met het polaire uiteinde van het fosfolipide kan ze beide in een sterk gedispergeerde staat maken. De kristalkenmerken van het medicijn worden geremd en de oplosbaarheid van lipiden werd verhoogd [11]. Er werd gemeld dat in de interactie tussen daidzeïne en lipidedubbellaag ongeveer 15% van daidzeïne zich in het hydrofiele gebied van het liposoommembraan bevindt [23, 24] en de rest wordt verdeeld op het water/membraan-grensvlak [25]. Volgens de resultaten van TEM was de dubbele structuur van DLCL duidelijk en had de insertie van daidzeïne geen invloed op de dubbele structuur van lipiden.

Effect van bereidingsprocessen op in vitro geneesmiddelafgifte

De resultaten van in vitro afgifte-experimenten zijn weergegeven in Fig. 5. In het afgiftemedium van de gesimuleerde maagvloeistof (0,1 mol/L HCL met 0,5% Tween-80), was de cumulatieve afgiftesnelheid van daidzeïne ongeveer 85% bij 1 uur en volledige release om 12 h; DLCL gaf 18% vrij bij 1 h, 60% bij 12 h en 100% bij 48 h. In het afgiftemedium van gesimuleerde darmvloeistof (25 mM PBS-buffer met 0,5% Tween-80, pH 6,9), was de cumulatieve afgiftesnelheid van daidzeïne ongeveer 73% bij 1 h, 84% bij 12 h en volledige afgifte bij 24 h; DLCL vrijgegeven 3% bij 1 h, 59% bij 12 h en 100% bij 48 h.

In vitro afgifte van DLCL en vrij daidzeïne in hydrochloride-oplossing (pH 1,2) met 0,5% Tween 80 (a ) en fosfaatbuffer (pH 6,9) met 0,5% Tween 80 (b ) (gemiddelde ± SD, n = 3)

De resultaten van een in vitro afgifte-experiment toonden aan dat DLCL een significant langzame afgifte had in dialysemedia met pH 1.2 en pH 6,9, en de afgiftesnelheid in dialysemedia met pH  1.2 was sneller dan die in dialysemedia met pH 6,9. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat lipide dubbellaagstructuren kwetsbaar zijn onder zure omstandigheden en een slechte stabiliteit hebben.

Effect van bereidingsprocessen op de in vivo farmacokinetiek

De gemiddelde plasmaconcentratie-tijdcurves van daidzeïne na orale toediening van een enkele dosis daidzeïne en DLCL werden weergegeven in Fig. 6, en de belangrijkste niet-compartimentele farmacokinetische parameters van daidzeïne in beide groepen werden weergegeven in Tabel 5. De resultaten toonden aan dat onder de isodosis daidzeïne (30 mg/kg) in beide groepen was de plasmaconcentratie van daidzeïne in de DLCL-groep altijd hoger dan die in de daidzeïne-groep. De AUC_0−t (het gebied onder de plasmageneesmiddelconcentratie-tijdcurve, die de totale absorptie na een enkele dosis weergeeft en de mate van geneesmiddelabsorptie weerspiegelt) van daidzeïne in de DLCL-groep was 1515,52 ±  532,40 μg/L*h, wat 2,5 keer was dan die van de daidzein-groep (p <  0,05). Bovendien is de MRT_0−t (gemiddelde verblijftijd, dit is de tijd die nodig is voor de eliminatie van 63,2% van het geneesmiddel in het lichaam) en t _1/2 (de eliminatiehalfwaardetijd, wat de tijd is die nodig is om de plasmageneesmiddelconcentratie van de terminale fase te halveren) van daidzeïne in de DLCL-groep was respectievelijk 1,6 keer en 1,8 keer verlengd dan die in de daidzeïnegroep (p ik> <  0,05). De farmacokinetische resultaten gaven aan dat DLCL niet alleen het first-pass-effect van daidzeïne kon verminderen om de orale absorptie te bevorderen, maar ook de gemiddelde verblijfstijd voor het effect van langzame afgifte kon verlengen.

Gemiddelde plasmaconcentratie-tijdcurves van DLCL en vrij daidzeïne na orale toediening van een enkele dosis daidzeïne (30 mg/kg) (gemiddelde  ± SD, n = 5)

Conclusies

Er is gemeld dat nano-lipidedragers, waaronder zelfemulgerende medicijnafgiftesystemen (SEDDS), vaste lipidenanodeeltjes (SLN) en nanogestructureerde lipidedragers (NLC), de oplosbaarheid, permeabiliteit, gastro-intestinale stabiliteit en orale biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen. SEDDS is samengesteld uit watervrije isotrope olie, emulgator, hulpemulgator, solubilisator en medicijn. Door de emulgering van lipiden in het maag-darmkanaal kan het de absorptie van het oppervlak en de doorlaatbaarheid van geneesmiddelen verhogen en ervoor zorgen dat geneesmiddelen in de systemische circulatie terechtkomen. SEDDS heeft echter een lage medicijnbelasting en is vatbaar voor medicijnkristallisatie en in vivo precipitatie, en de correlatie tussen in vitro en in vivo resultaten is slecht [26, 27]. SLN is samengesteld uit geneesmiddel, lipide en oppervlakteactieve stof. Met unieke deeltjesstructuurkenmerken en controleerbare afgiftevoordelen, kan SLN de targeting aanzienlijk verbeteren en de opname van kankercellen bevorderen wanneer het wordt gebruikt om geneesmiddelen tegen kanker in te kapselen. SLN is echter niet geschikt voor het inkapselen van hydrofiele geneesmiddelen en geneesmiddelen met kationische lading [28]. NLC is de tweede generatie lipidenanodeeltjes gevormd door een mengsel van vloeibare en vaste lipiden, met een hogere stabiliteit dan SLN. Het kan hydrofobe moleculen effectief inkapselen en de verblijftijd van medicijnen in het lichaam verlengen, maar de bereidingskosten zijn hoog [29].

Om de slechte orale biologische beschikbaarheid van daidzeïne te verbeteren, waren recente onderzoeken gericht op het nieuwe medicijnafgiftesysteem, zoals met daidzeïne-fosfolipidecomplex beladen lipidenanodragers met 91,7 ± -1,5% EE en 6,87-voudig verhoogde AUC [11], daidzeïne -zelf-geassembleerd nanoafgiftesysteem met 85,9 ± -2,7% EE negenvoudig verhoogde AUC [12], en daidzeïne-PLGA nanodeeltjes met 81,9% EE en 5,57-voudig verhoogde AUC [13].

In het huidige werk waren de EE- en medicijnbelading van DLCL, bereid onder geoptimaliseerde omstandigheden, respectievelijk 85,3 ± 3,6% en 8,2 ± 1,4%. De in vitro volledige afgiftetijden van DLCL in het medium van pH 1.2 en pH 6.9 stegen respectievelijk met een factor vier en twee keer die van vrije geneesmiddelen. Nadat ratten oraal een enkele dosis daidzeïne (30 mg/kg) en DLCL (met gelijke dosis daidzeïne) kregen toegediend, werd de t _1/2 , MRT_0−t , en AUC_0–t van daidzeïne in de DLCL-groep nam met een factor 1,8, 1,6 en 2,5 toe in vergelijking met die in de daidzeïnegroep, wat erop wees dat DLCL de orale absorptie bevorderde en de gemiddelde verblijfsduur van daidzeïne bij ratten verlengde.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

De auteurs verklaren dat de materialen, gegevens en bijbehorende protocollen onmiddellijk beschikbaar zijn voor de lezers zonder onnodige kwalificaties in overeenkomsten voor materiaaloverdracht. Alle gegevens die tijdens dit onderzoek zijn gegenereerd en geanalyseerd, zijn opgenomen in dit artikel.

Afkortingen

AUC:

Gebied onder de tijd-concentratiecurve;

C _max :

Piekconcentratie

DL-buis:

Oplosmiddelbuis

DLCL:

Daidzein lang circulerende liposomen

DSPE-mPEG2000:

Distearoylfosfoethanolamine-PEG2000

EE:

Inkapselingsefficiëntie

ESI:

Electrospray ionisatie

HPLC:

Hoge prestatie vloeistofchromatografie

IS:

Interne standaard

LC-MS/MS:

Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie

m /z :

Massa-tot-lading verhouding

MPS:

Mononucleair fagocytsysteem

MRM:

Controlemodus voor meerdere reacties

MRT:

Gemiddelde verblijftijd

MS:

Massaspectrogtafie

PBS:

Fosfaatgebufferde zoutoplossing

PDI:

Polydispersiteitsindex

PEG:

Polyethyleenglycol

RSD:

Relatieve standaardafleiding;

SD:

Standaarddeviatie

SEM:

Standaardfout van gemiddelde

SPC:

Fosfatidylcholine

t _1/2 :

Eliminatiehalfwaardetijd

TEM:

Transmissie elektronenmicroscoop

T _max :

De tijd van piekconcentratie