Seeksel elektrochemische cortisol biosensor op basis van tindisulfide nanovlokken

Abstract

Cortisol, een steroïde hormoon, wordt uitgescheiden door het hypothalamus-hypofyse-bijniersysteem. Het is een bekende biomarker van psychologische stress en staat daarom bekend als het 'stresshormoon'. Als de overexpressie van cortisol langdurig en herhaald wordt, treedt uiteindelijk disfunctie in de regulatie van cortisol op. Daarom is een snelle point-of-care-assay nodig om cortisol te detecteren. De elektrochemische analyse van speekselcortisol is een niet-invasieve methode die mogelijk nuttig is om een snelle meting van de cortisolspiegel mogelijk te maken. In deze studie werden meerlagige films met tweedimensionale tindisulfide-nanovlokken, cortisol-antilichaam (C-M_ab ), en runderserumalbumine (BSA) werden bereid op glasachtige koolstofelektroden (GCE) als BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE, en gekarakteriseerd met behulp van elektrochemische impedantiespectroscopie en cyclische voltammetrie. Elektrochemische reacties van de biosensor als functie van cortisolconcentraties werden bepaald met behulp van cyclische voltammetrie en differentiële pulsvoltammetrie. Deze cortisolbiosensor vertoonde een detectiebereik van 100 pM tot 100 μM, een detectielimiet van 100 pM en een gevoeligheid van 0,0103 mA/Mcm² (R ² =0,9979). Ten slotte correleerden de cortisolconcentraties in authentieke speekselmonsters verkregen met behulp van het ontwikkelde elektrochemische systeem goed met de resultaten verkregen met behulp van enzymgekoppelde immunosorbent-assays. Deze biosensor is met succes voorbereid en gebruikt voor de elektrochemische detectie van speekselcortisol over fysiologische bereiken, op basis van de specificiteit van antilichaam-antigeen-interacties.

Inleiding

Cortisol, een steroïde hormoon, wordt uitgescheiden door het hypothalamus-hypofyse-bijniersysteem (HPA). Het is een bekende biomarker van psychologische stress en wordt daarom het “stresshormoon” genoemd [1, 2]. Cortisolspiegels volgen een circadiaans ritme gedurende een cyclus van 24 uur; de hoogste niveaus worden 's morgens vroeg waargenomen en de niveaus nemen 's nachts geleidelijk af [3,4,5,6]. Overmatige cortisolspiegels kunnen de ziekte van Cushing veroorzaken, met symptomen van centrale obesitas, paarse striae en proximale spierzwakte. Verlaagde cortisolspiegels kunnen echter leiden tot de ziekte van Addison, met chronische vermoeidheid, malaise, anorexia, orthostatische hypotensie en hypoglykemie [7,8,9]. Daarom is het handhaven van een juiste cortisolbalans essentieel voor de menselijke gezondheid.

Er is een groeiende belangstelling ontstaan voor het meten van cortisol als voorloper van medisch en psychologisch relevante gebeurtenissen, waaronder de meest recente aandoening posttraumatische stressstoornis (PTSS). Het belang van afwijkende HPA-asfunctie bij PTSD staat buiten kijf; daarom kunnen traditionele beoordelingsmethoden nog steeds overvloedig bewijs en informatie opleveren [10,11,12,13,14]. Onlangs hebben veel onderzoeken het belang van cortisoldetectie gemeld en correlaties met verschillende ziekten vastgesteld [15,16,17,18]. Verschillende onderzoeken hebben bevestigd dat cortisol verband houdt met autismespectrumstoornis [19], depressie [20], zelfmoordgedachten [21], tegenspoed in de kindertijd en externaliserende stoornissen [22].

Hoewel het identificeren van cortisolspiegels een belangrijk diagnostisch hulpmiddel is, routinematige laboratoriumcortisoldetectietechnieken zoals chromatografie [23, 24], radioimmunoassay [25], elektrochemiluminescente immunoassay [26,27,28], enzymgekoppelde immunosorbentassay [28, 29] ], oppervlakteplasmonresonantie [1, 30, 31] en kwartskristalmicrobalans [32] brengen veel analysetijd met zich mee, zijn duur en kunnen niet worden geïmplementeerd in point-of-care (POC) instellingen [33]. Daarom is er momenteel behoefte aan een gevoelige, efficiënte en realtime bepaling van de cortisolspiegels.

In de afgelopen jaren zijn elektrochemische immunoassay-methoden, die zijn vastgesteld op de specifieke moleculaire herkenning tussen antigenen en antilichamen, naar voren gekomen als een veelbelovende technologie vanwege opvallende kenmerken, zoals het betrekken van eenvoudige apparaten, snelle analyse, goedkope, labelvrije POC-testen, hoge gevoeligheid en lage detectiedrempels voor cortisol in biologische vloeistoffen [34, 35]. Veranderingen in elektrische potentiaal worden toegeschreven aan variaties in de concentratie van elektrochemische redoxreacties aan de elektrode. Afgescheiden cortisol komt uiteindelijk in de bloedsomloop terecht en kan worden gevonden in verschillende biologische vloeistoffen zoals interstitiële vloeistof [36], bloed [37], urine [38], zweet [39] en speeksel [40]. De voordelen van elektrochemische detectie van speekselcortisol, een niet-invasieve methode, met gemakkelijke monsterafname, hantering en opslag, hebben het potentieel voor toepassing in POC-sensoren voor realtime metingen vergroot [41].

Een ideale biosensor moet lage detectielimieten, snelle selectiviteit en hoge gevoeligheid hebben. Om een immunosensor te fabriceren, moet de gekozen immobiliserende matrix een hoge oppervlaktefunctionaliteit, een hoge biomolecuulbelading en een lage weerstand tegen elektronentransport hebben, met een hoge elektronenoverdrachtsnelheid [42]. Metaalsulfide-nanomaterialen zijn echter zelden gesuggereerd voor de immobilisatie van eiwitten voor elektrochemische biosensing. Daarom werd hier tindisulfide geselecteerd als een potentiële immobiliserende matrix voor de ontwikkeling van immunosensoren om cortisol in speeksel te detecteren.

Nano tweedimensionale (2D) materialen hebben de afgelopen tien jaar overvloedige onderzoeksinteresses getrokken. Er zijn verschillende soorten 2D-materialen, variërend van halfgeleider tot metaal en van anorganisch tot organisch [43,44,45,46] en verwant composiet [47,48,49,50]. De ontdekking, productie en onderzoek van nano 2D-materiaal zijn heersende stromen op verschillende gebieden. Nano 2D-tindisulfide (SnS₂ ), een n-type halfgeleider met een bandgap van 2,18-2,44 eV [51, 52], bestaat uit Sn-atomen die zijn ingeklemd tussen twee lagen hexagonaal geplaatste en dicht bij elkaar liggende zwavel (S)-atomen, met aangrenzende S-lagen verbonden door zwakke van der Waalskrachten [53]. Vanwege zijn intrigerende elektrische eigenschappen, hoge draaggolfmobiliteit, goede chemische stabiliteit, lage kosten en optische eigenschappen [54], SnS₂ is geëvolueerd tot een veelbelovend materiaal voor verschillende toepassingen in zonnecellen en opto-elektronische apparaten [55, 56], als elektroden in lithium-ionbatterijen [57, 58], gassensoren en glucosemonitors [59, 60]. De selectie van elektrodemateriaal is een belangrijke sleutelfactor om de prestaties te verbeteren door een groot reactiegebied en een gunstige micro-omgeving te bieden voor het vergemakkelijken van elektronenoverdracht tussen enzym en elektrodeoppervlak.

In dit werk werden biosensoren gefabriceerd met behulp van SnS₂ als de immobiliserende matrix om cortisol te detecteren. De resultaten van differentiële pulsvoltammetrie (DPV)-onderzoeken met betrekking tot elektrochemische detectie tonen een hoge gevoeligheid van 0,0103 mA/Mcm² en de laagste detectieconcentratie van 100 pM.

Materialen en methoden

Materialen

Hydrocortison (cortisol), anti-konijn cortisol antilichaam (anti-cortisol, C-M_ab ), werden kaliumhexacyanoferraat (II), kaliumhexacyanoferraat (III), β-estradiol, testosteron, progesteron en corticosteron gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS). Runderserumalbumine (BSA) werd verkregen van PanReac. Tin (IV) chloride pentahydraat (SnCl₄ ^. 5H₂ O) en thioacetamide (C₂ H₅ NS) werden geleverd door Showa (Japan) en Alfa Aesar (VK). Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bereid met NaCl, KCl, Na₂ HPO₄ , en KH₂ PO₄ werden gekocht bij Sigma-Aldrich. Microgepolijst aluminiumoxide was afkomstig van Buehler (VK). Alle andere chemicaliën waren van analytische kwaliteit en werden zonder verdere zuivering gebruikt. Cortisol Saliva ELISA-kit (Cat # SA E-6000) is gekocht bij LDN (Duitsland).

Synthese van tindisulfide

Poeders van SnCl₄ ·5H₂ O en C₂ H₅ NS werd gemengd in 70 ml gedeïoniseerd water en de pH werd op 7,4 ingesteld. Een hydrothermische autoclaafreactor met daarin de reactanten werd verwarmd van kamertemperatuur tot 200 ^° C in 1 uur en gehandhaafd op 200 ^° C voor 11 uur. Dan, de resulterende SnS₂ poeder werd gewassen met gedeïoniseerd water en ethanol bij 6000 rpm gedurende 15 min, en tenslotte gedroogd aan de lucht bij 80 ^° C. Deze hydrothermische methode werd met succes toegepast voor de synthese van SnS₂ .

Kenmerken van materialen

Röntgendiffractie (XRD, PANalytical, Nederland) werd gebruikt om de kristalfase van 2D hexagonaal SnS₂ te onderzoeken vlokken. Multifunctionele veldemissie scanning elektronenmicroscopie (FE-SEM, Zeiss, Duitsland) werd gebruikt om de oppervlaktemorfologie van materialen in beeld te brengen. Veldemissiekanontransmissie-elektronenmicroscopie (FEG-TEM, Tecnai, VS) werd gebruikt om de microstructuur van SnS₂ te onderscheiden , en geselecteerde gebiedsdiffractie (SAED, Tecnai) werd gebruikt om kristalpatronen te verkrijgen.

Vervaardiging van BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE-biosensoren

Glasachtige koolstofelektroden (GCE's) werden eerst gepolijst met aluminiumoxidesuspensie en vervolgens druppels van een mengsel van 5 M SnS₂ werden afgezet op het oppervlak van voorbehandelde GCE's. Oplossingen van anti-cortisol antilichaam (1 mg/ml) en BSA (1%) werden bereid in PBS. SnS₂ /GCE werd vervolgens achtereenvolgens versierd met de antilichaam- en BSA-oplossingen. De gefabriceerde BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE-biosensoren werden gekoeld bewaard bij 4 ^° C wanneer niet in gebruik. Het onderzoeksconcept en de opzet van het detectiesysteem worden geïllustreerd in Fig. 1.

Onderzoeksconcept en opzet van het detectiesysteem

Elektrochemische analyse

Gefabriceerde BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE's werden gekarakteriseerd met behulp van elektrochemische impedantiespectroscopie (EIS) en cyclische voltammetrie (CV) om hun elektro-actieve gedrag te vergelijken. Elektrochemische responsstudies als functie van de cortisolconcentratie werden uitgevoerd met behulp van CV en differentiële pulsvoltammetrie (DPV). Alle experimenten werden uitgevoerd met een systeem met drie elektroden met een GCE als werkelektrode, een Pt-draad als hulpelektrode en een verzadigde calomelelektrode als referentie-elektrode in 10 mM PBS (pH 7,4) met 5 mM Fe (CN )₆ ^3-/4- . Elektrochemische metingen werden uitgevoerd op een elektrochemisch werkstation uit de model CHI6114E-serie (CH Instruments, VS). De CV- en DPV-metingen zijn uitgevoerd tussen − 0,4 V en 1,0 V bij een scansnelheid van 10 mV/s, tenzij anders aangegeven.

Speekselmonsterafname en elektrochemische detectie

Rond het middaguur werd speekselmonster (2 ml) afgenomen van twee gezonde vrijwillige proefpersonen om de ontwikkelde BSA/C-M_ab te valideren. /SnS₂ /GCE. Speekselmonsters werden verkregen zonder enige filtratie en aanvankelijk bewaard bij -20 ° C om de biologische kenmerken te behouden. Vóór detectie werden de speekselmonsters ontdooid tot kamertemperatuur en 15 minuten bij 3500 rpm gecentrifugeerd om het supernatant voor meting te verzamelen. Het afgescheiden speeksel werd bewaard bij -20°C. De BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE werd gebruikt voor de elektrochemische detectie van cortisolconcentraties in speekselmonsters. De detectie van cortisol met behulp van elektrochemische analyse met de BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE werd vergeleken met die van de hierboven genoemde commercieel verkrijgbare ELISA-cortisolkit.

Interferentieonderzoek

Het remmende effect van mogelijke verstorende stoffen, zoals andere steroïde hormonen, op BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE-specificiteit werd onderzocht door de biosensor gedurende 10 minuten in de volgende verschillende oplossingen te plaatsen:100 nM β-estradiol, 100 nM testosteron, 100 nM progesteron en 100 nM corticosteron en vervolgens gescand met CV. De scansnelheid was 10 mV/s en het scanbereik was van -0,4 V tot 0,6 V.

Detectie van speekselcortisol door ELISA

ELISA werd uitgevoerd op de speekselmonsters volgens het protocol van de fabrikant. Om een kalibratiecurve voor cortisolmetingen vast te stellen, werd de test uitgevoerd in een titerplaat met 96 putjes die zes bekende standaardcortisolconcentraties (0,0, 0,1, 0,4, 1,7, 7,0 en 30 ng/ml) bevat voor het bepalen van de absorptie van elk putje bij 450nm. De kalibratiecurve werd voorzien van een trendlijn om een vergelijking te verkrijgen voor de berekening van onbekende monsters.

Resultaten en discussie

Materiaalanalyse van SnS₂

Zoals te zien is aan het XRD-patroon in figuur 2a, vertoont het als gesynthetiseerde product alleen de XRD-pieken die overeenkomen met de hexagonale fase SnS₂ (JCPDS-kaart nr. 89-2358). Figuur 2b, c illustreert de FE-SEM-beelden van de as-synthesized SnS₂ met een uniforme vlokachtige morfologie met een grootte van ongeveer 300 nm. Afbeelding 2d-f toont de FEG-TEM- en SAED-afbeeldingen van SnS₂ , waarin roosterrandafstanden van 0,167 nm en 0,316 nm worden geïdentificeerd voor hexagonale SnS₂ als een enkele kristallijne structuur. De stapeling van nanovlokken is minder dan 10 lagen met een totale dikte van minder dan 10 nm.

een XRD-patroon van SnS₂ . FE-SEM-afbeeldingen van SnS₂ nanovlokken werden genomen met vergrotingen van (b ) × 250.000 en (c ) × 100.000. d FEG-TEM-afbeeldingen van SnS₂ nanovlokken. e Transversale FEG-TEM van SnS₂ nanoflakes en ingezoomde FEG-TEM-afbeelding. v SAED-afbeelding van SnS₂ nanovlokken

Elektrochemische reacties van de elektrode

Oxidatiestroom kan sterk toenemen door toevoeging van tindisulfide. Zoals getoond in Fig. 3a, b, de grootte van de oxidatiestroom verminderd van SnS₂ /GCE naar C-M_ab /SnS₂ /GCE, gevolgd door BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE, naarmate de weerstandswaarde van de ladingsoverdracht toenam. Daarom geven de resultaten aan dat de sensoreigenschappen op de elektrode zijn gewijzigd. Aanvankelijk BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE werd bestudeerd door de scansnelheid te variëren van 10 mV/s tot 100 mV/s, zoals weergegeven in figuur 3c. De verandering in stroomrespons met scansnelheid, zoals weergegeven in figuur 3d, laat zien dat de oxidatiestroom lineair toenam met scansnelheid, en volgde de relatie:I =0,5156 υ–0,0319 (R ² =0,9985) in oxidatie, en I =0,6758υ–0,0288 (R ² =0,9997) in reductie. Een bijna-lineariteit voor de toename van de piekstroom met toenemende scansnelheid met goed gedefinieerde redoxpieken duidt echter op een oppervlakte-gecontroleerd proces, met stabiele elektronenoverdracht.

een CV-responsonderzoek van GCE-elektrode (curve a), SnS₂ /GCE-elektrode (curve b), C-M_ab /SnS₂ /GCE-elektrode (curve c), BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE-elektrode (curve d). b EIS-responsonderzoek van de GCE, SnS₂ /GCE, C-M_ab /SnS₂ /GCE, en BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE-elektroden. Inzet:het overeenkomstige equivalente circuit. c Verhoogde grootte van oxidatiereactiestroom van BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE-elektrode met verhoogde scansnelheid van 10 mV/s naar 100 mV/s. d De huidige magnitude nam toe met toenemende scansnelheid. e CV-onderzoeken van BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE-elektrode als functie van de cortisolconcentratie variërend van 100 pM tot 100 M. v Lineariteitscurve voor de huidige respons met verschillende cortisolconcentraties. g DPV-onderzoeken van BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE-elektrode als functie van de cortisolconcentratie variërend van 100 pM tot 100 M. u Lineariteitscurve voor de huidige respons met verschillende cortisolconcentraties

De stroom nam af met toenemende concentratie van cortisol over het bereik van 100 pM tot 100 M. Het verschil in stroom correleerde direct met de gemeten cortisolconcentratie. Huidige waarden en goed gescheiden oxidatiepieken werden verkregen voor BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE-elektroden, zoals weergegeven in Fig. 3e, f. De verandering in stroom met de log van concentratie was bijna lineair. Het is duidelijk dat de verlaging van de lineaire regressiecoëfficiënt beter is voor CV. Daarom werden verdere metingen gedaan met meer specifieke en nauwkeurige DPV. De resultaten van dergelijke DPV-onderzoeken gaven aan dat de omvang van de huidige respons afnam met de toevoeging van cortisol, zoals geïllustreerd in Fig. 3g. Een kalibratiecurve weergegeven in Fig. 3h geeft de grootte van de huidige respons en logaritme van de cortisolconcentratie weer en bleek lineair afhankelijk te zijn en de vergelijking te volgen:y =− 0.0103x + 0,0443; R ² =0,9979. Deze sensor vertoonde een detectiebereik tussen 100 pM en 100 μM, met een detectielimiet van 100 pM en een gevoeligheid van 0,0103 mA/Mcm² (R ² =0,9979).

Onderzoek naar opslagstabiliteit

Er zijn ook CV-onderzoeken uitgevoerd om de houdbaarheid van de BSA/C-M_ab . te bestuderen /SnS₂ /GCE met tussenpozen van 1 dag tot 1 week. Om twee bewaarcondities te vergelijken, was een voorwaarde om de elektroden onder vacuüm gedroogd op te slaan, terwijl de andere voorwaarde was om de elektroden bij 4 ° C op te slaan. De stabiliteit van de redoxpiek van de elektroden bij 4 ° C en onder vacuüm wordt respectievelijk getoond in Fig. 4a, c. Het is duidelijk dat de bewaarconditie bij 4 °C beter was dan die onder vacuüm. Figuur 4b, d laat zien dat de elektrodestabiliteitswaarde 82% was met de elektroden die 7 dagen onder vacuüm werden bewaard, terwijl de elektrodestabiliteitswaarde 91% was met de elektroden opgeslagen bij 4 °C. Er kan worden waargenomen dat de stabiliteit van elektroden die bij 4 ° C werden bewaard, hoger was dan die onder vacuüm. Het verlies van activiteit van de elektrode werd mogelijk veroorzaakt door afbraak van de cortisol-antilichaamactiviteit onder vacuüm. De opslagstabiliteit is een cruciaal punt voor enzymatische sensor. In het toekomstige ontwerp van de elektrode kan een beschermende coating worden aangebracht.

Redox piekstabiliteit van BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE-elektrode met verschillende bewaarcondities (a en b ) onder vacuüm (c en d ) bij 4 °C gedurende 7 dagen

Interferentieonderzoek

De resultaten van CV-onderzoeken van BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE voor het meten van potentiële verstorende stoffen, zoals β-estradiol (100 nM), testosteron (100 nM), progesteron (100 nM) en corticosteron (100 nM) met betrekking tot cortisol (10 nM), worden getoond in Fig. 5a. Vergeleken met de verandering in de respons van het cortisolsignaal, waren de effecten van interferentie minder dan 5% van het resultaat voor cortisol, wat suggereert dat dergelijke potentiële interferenties gemakkelijk kunnen worden verwaarloosd.

een Interferentiestudie met β-estradiol (100 nM), testosteron (100 nM), progesteron (100 nM) en corticosteron (100 nM) met betrekking tot cortisol (1 0 nM). b Vergelijking van speekselcortisolmetingen met behulp van ELISA en elektrochemische methoden

Detectie van speekselcortisol met behulp van ELISA en elektrochemische methoden

Metingen van speekselcortisolmonsters uitgevoerd met ELISA en de BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE-elektrode zijn samengevat in Tabel 1 en Fig. 5b. De cortisolconcentraties bepaald met ELISA waren 1,105 ×10⁻⁸ M en 3,998 × 10⁻⁹ M. De berekende resultaten van cortisol met behulp van elektrochemische metingen waren 1,046 × 10⁻⁸ M en 3.911 × 10⁻⁹ M. Er werd een goede correlatie bereikt met deze twee technieken, met vergelijkbare resultaten met slechts een verschil van 2-5%. De resultaten tonen dus aan dat deze BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE kan worden gebruikt voor elektrochemische detectie van cortisol in biologisch relevante vloeistoffen zoals speeksel.

Vergelijking met andere onderzoeken

De resultaten van dit onderzoek zijn vergeleken met andere onderzoeken met elektrochemische sensoren van speekselcortisol die in de literatuur zijn gerapporteerd om een beter inzicht te krijgen in de prestaties van deze BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE. Tabellen 2 en 3 tonen vergelijkingen van resultaten die zijn verkregen met niet-gouden elektroden bij de detectie van cortisol. Er zijn drie belangrijke voordelen van het huidige werk. Ten eerste zijn de materialen veel goedkoper dan de apparaten die in andere onderzoeken zijn gepresenteerd. Ten tweede was het voorbereidingsproces relatief eenvoudig en snel. Ten slotte was de detectielimiet vergelijkbaar met die gerapporteerd in andere literatuur of zelfs beter dan die gerapporteerd, terwijl het doeldetectiebereik voor speekselcortisol gemakkelijk wordt verkregen.

Conclusies

Een hydrothermische methode is met succes toegepast voor de synthese van SnS₂ . De eigenschappen van SnS₂ werden gekenmerkt door XRD, FE-SEM, FEG-TEM en SAED. Elektrochemische reacties van de elektrode als functie van cortisolconcentraties werden bepaald met behulp van CV en DPV. Onze cortisolsensor vertoonde een detectiebereik van 100 pM tot 100 μM, een detectielimiet van 100 pM en een gevoeligheid van 0,0103 mA/Mcm² (R ² =0,9979). De verkregen detectieparameters waren in normale fysiologische bereiken. De impact van mogelijke interferentie was minder dan 5%, wat wijst op een goede specificiteit van deze sensor. Stabiliteitstesten toonden aan dat de activiteit van de sensor bewaard bij 4 °C beter was dan onder vacuüm. De resultaten van deze elektrode voor de meting van cortisol in speekselmonsters waren consistent met ELISA. Daarom elektrochemische analyse met behulp van deze BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE-elektrode kan meer traditionele, tijdrovende immunoassay-benaderingen vervangen.