Kationische micel-gebaseerde siRNA-afgifte voor efficiënte gentherapie voor colonkanker

Abstract

Op kleine interfererende RNA (siRNA) gebaseerde gentherapie heeft een alternatieve strategie voor kankertherapie opgeleverd. Een van de belangrijkste componenten binnen het gentherapieproces is het toedieningssysteem. Als een nieuwe niet-virale genvector is DMP, bereid door mPEG-PCL-micel te modificeren met kationisch DOTAP-lipide, bereid en met succes toegepast in op plasmide-DNA gebaseerde gentherapie voor colonkanker. Het potentieel ervan in siRNA-afgifte is echter onbekend. In deze studie werd het bereidingsproces van DMP geoptimaliseerd en werden de antikankereffectiviteiten van de DMP/siMcl1- en DMP/siBcl-xl-complexen bestudeerd op een muis-darmkankermodel. Onze resultaten toonden aan dat DMP-kationische micel-afgeleverde siRNA's de groei van C26-darmkankercellen in vitro effectief konden remmen. Ondertussen onderdrukte intratumorale toediening van DMP/siMcl1- en DMP/siBcl-xl-complexen duidelijk het subcutane tumormodel in vivo. Deze resultaten suggereren dat het DMP/siRNA-complex een potentiële kandidaat is voor kankergentherapie.

Inleiding

Kanker is een groot wereldwijd probleem voor de volksgezondheid. Darmkanker is een veelvoorkomende kwaadaardige tumor die jaarlijks wereldwijd meer dan een miljoen mensen treft [1]. Gentherapie is toegepast om te dienen als een methode voor de behandeling van solide tumoren en bloedtumoren [2, 3]. De sleutel tot kankergentherapie hangt af van het veilige en effectieve genafgiftesysteem [4, 5]. Niet-virale vectoren, waaronder kationische lipiden, lipidenano-emulsies, vaste lipidenanodeeltjes en op polymeren gebaseerde vectoren hebben meer aandacht gekregen dan virale vectoren vanwege hun potentiële voordelen bij genafgifte:ze zijn gemakkelijk te bereiden, veroorzaken minder immuunrespons, hebben een lagere toxiciteit en betere biocompatibiliteit [6, 7]. Nanotechnologie biedt een nieuw middel voor de studie van niet-virale vectoren met voordelen zoals biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid, veiligheid en doelgerichtheid, enzovoort [2, 8]. Daarin kan een groot aantal dragers van nanodeeltjes met een hoge positieve lading worden gecombineerd met het anionische nucleïnezuurgeneesmiddel door een elektrisch ladingseffect, wat een breed en helder toepassingsperspectief in gentherapie laat zien [9, 10].

Als een type polymeercopolymeer, dat biologische afbreekbaarheid en biocompatibiliteit bezit, laten PEG/PCL-copolymeren veelbelovende toepassingen zien in medicijnafgiftesystemen [11,12,13]. Op basis van MPEG-PCL-micellen gebruikten we amfifiele DOTAP om MPEG-PCL-copolymeer in één stap te modificeren, waardoor de kationische zelf-geassembleerde DOTAP- en MPEG-PCL-hybridemicellen (DMP) [14,15,16,17] werden gecreëerd. Deze micellen laten een veelbelovend vooruitzicht zien in de levering van chemische geneesmiddelen en gengeneesmiddelen met uitstekende stabiliteit en veiligheid. DMP is bijvoorbeeld gebruikt om survivinT34A-zelfmoordgen en curcumine af te leveren voor behandeling van darmkanker [14, 18]. Eerdere onderzoeken waren echter beperkt tot de overdracht van plasmide-DNA en er was tot nu toe geen rapport over de levering van DMP-micellen voor andere vormen van gentherapie, wat de toepassing van DMP-micellen bij gentherapie beperkte.

Genetische interferentie op basis van siRNA is ook een essentieel onderdeel van gentherapie anders dan therapeutische genen van plasmide-DNA. Als een essentieel lid van gen-drug, is siRNA een klein molecuul dubbelstrengs RNA. siRNA-geneesmiddelen tegen kanker maken gebruik van endogene RNAi-mechanismen om oncogenexpressie tot zwijgen te brengen. Vanwege significante voordelen zoals verbeterde stabiliteit en silencing-efficiëntie, heeft siRNA het potentieel om te worden ontwikkeld tot kankertherapeutische toepassingen [19]. Vergeleken met het grote molecuulgewicht van plasmide-DNA heeft siRNA een hogere transfectie-efficiëntie, wat met name geschikt is voor het specifieke gen-targetingpunt in gentherapie. Het kan dus een goede keuze zijn voor gentherapie. Momenteel zijn meerdere siRNA-behandelingsgeneesmiddelen op basis van niet-virale vectoren getest in klinische onderzoeken, zoals CALAA-01 op basis van cyclodextrine-polypolymeer nanodeeltjes en ALN-TTR02 op basis van lipiden [2]. Gentherapie op basis van siRNA is echter nog steeds nodig om een nieuw siRNA-richtpunt te ontwikkelen en veilige, effectieve en hoog-specifieke dragers van siRNA te zoeken.

In deze studie hebben we geprobeerd om DMP-micellen te gebruiken om siRNA af te leveren om de efficiëntie en veiligheid van DMP-micellen te bestuderen om siRNA af te geven. We gebruikten Bcl-xl-siRNA en Mcl1-siRNA als een therapeutisch doelwit, op zoek naar hun antitumoreffect voor de behandeling van darmkanker in vitro en in vivo. Het Bcl-xl-gen en het Mcl1-gen zijn leden van de Bcl-2-familie van het anti-apoptotische gen, en ze speelden een vitale rol bij het remmen van apoptose [20, 21]. We vermoeden dat synthetische DMP-micellen effectief en veilig Bcl-xl-siRNA en Mcl1-siRNA kunnen leveren. Bcl-xl-siRNA en Mcl1-siRNA kunnen Bcl-xl-gen- en Mcl1-genexpressie remmen, apoptose van C26-cellen induceren en vervolgens een therapeutisch effect bereiken door de groei van C26-cellen te remmen.

Materialen en methode

Materialen

N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N, N, N-trimethylammoniummethylsulfaat (DOTAP) werd gekocht bij Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, VS). MPEG-PCL diblokcopolymeer met een ontworpen molecuulgewicht van 4000 werd gesynthetiseerd volgens onze eerdere rapporten [22]. De Mn van MPEG-PCL-copolymeer was 4050. Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) en 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) werden verkregen van Sigma-Aldrich (VS ) en zonder verdere zuivering gebruikt. Dichloormethaan en andere organische oplosmiddelen werden gekocht bij ChengDu Kelang Chemical Co., Ltd. (Chengdu, P.R. China). C26 (murine colonadenocarcinoom) cellen en 293 T (HEK 293 T/17) cellen werden gekocht bij de American Type Culture Collection (Manassas, VA, VS). Cellen werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, geïncubeerd bij 37°C met 5% CO₂ -bevochtigde luchtatmosfeer.

Bereiding van DMP-micellen

Om een beter DMP-bereidingsproces te selecteren, werden DMP-micellen bereid in drie organische oplosmiddelen, elk met drie verschillende doseringen DOTAP. Met betrekking tot oplosmiddel werden dichloormethaan, chloroform en ethylacetaat gekozen om te bestuderen, en de doseringen van DOTAP omvatten 5 mg, 10 mg en 20 mg. DOTAP en MPEG-PCL werden samen opgelost in het organische oplosmiddel en vervolgens verdampt door een vacuümpomp om een gedroogde film te vormen. De gedroogde film werd vervolgens opnieuw gehydrateerd in gedestilleerd water. Ten slotte werden de bereide DMP-micellen bewaard bij 4 °C.

Karakterisatie van DMP-micellen

De deeltjesgrootte en zeta-potentiaal van DMP-micellen werden bepaald door een Zeta-sizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, VK) en tijdens het meetproces op 25°C gehouden. Alle resultaten waren het gemiddelde van drie runs. De stabiliteit van DMP-micellen werd kwalitatief beoordeeld. Aggregaten van DMP-micellen werden met het blote oog onderzocht. De aanwezigheid van precipitatie duidde op instabiliteit van DMP-micellen, terwijl een uniform transparante oplossing stabiliteit suggereert.

Gel vertragend

DMP-geleverd Scramble-siRNA (DMP / Scramble-siRNA) werd gemengd met 2 L laadbuffer, geladen in 1% agarosegel en gescheiden door elektroforese bij 140 V gedurende 10 min. 0,2 μg Scramble-siRNA werd gecombineerd met 1, 2, 3, 4, 5 en 6 μg DMP-micellen. De gel werd gekleurd met de gouden kijker en de banden die overeenkomen met Scramble-siRNA werden zichtbaar gemaakt onder een UV-licht.

Cytotoxiciteit van DMP-micellen

De cytotoxiciteit van DMP-micellen op de 293 T-cellen en C26-cellen werd geëvalueerd met de MTT-methode. In het kort werden 293T-cellen en C26-cellen uitgeplaat met een dichtheid van 1,2 × 10³ cellen per putje in 100 L DMEM-medium met 10% FBS (foetaal runderserum) in een plaat met 96 putjes en 24 h gekweekt. Cellen werden vervolgens gedurende 72 uur blootgesteld aan een reeks DMP-micellen of PEI25K in verschillende concentraties. De levensvatbaarheid van cellen werd gemeten met behulp van een MTT-assay. De resultaten waren het gemiddelde van zes testruns.

In vitro transfectie

Vierentwintig uur vóór transfectie werden C26-cellen uitgezaaid in een plaat met 24 putjes met een dichtheid van 5 x 10⁴ cellen per putje in 0,5 mL DMEM-medium met 10% FBS (foetaal runderserum). Op het moment van transfectie werd het medium in elk putje vervangen door 0,5 mL medium met 0%, 10%, 20% en 30% FBS en DMP-geleverd FAM (Carboxyfluoresceïne) siRNA (DMP/FAM siRNA) en PEI- afgeleverd FAM-siRNA (PEI/FAM-siRNA) dat 1 g siRNA in serumvrij medium bevatte, werd in elk putje gepipetteerd en de massaverhouding van DMP/FAM-siRNA en PEI25K/FAM-siRNA was 30:1 en 2:1. Vierentwintig uur later werden de overgebrachte cellen onder een microscoop bekeken en werd de luciferase-activiteit gemeten met flowcytometrie (Epics Elite ESP, VS)

In vivo genuitschakeling

siRNA-gerichte muis Bcl-xl, Mcl1-1, Scramble-siRNA en FAM-gelabeld negatief controlesiRNA werden gekocht bij GenePharma Co., Ltd (Shanghai, P.R. China) in onbeschermde, ontzoute, gegloeide vorm.

Om het niveau van Bcl-xl-mRNA te bepalen, werd totaal RNA geëxtraheerd uit C26-cellen met behulp van TRIzol™ Reagent (Thermo Fisher Scientific, VS), en werden individuele cDNA's gesynthetiseerd met een SuperScript II reverse transcriptase-assay (Invitrogen). Realtime kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met een SYBR GreenER kwantitatieve PCR SuperMix Universal-kit (Invitrogen). De PCR-primers werden gesynthetiseerd door TSINGKE Biological Technology (Chengdu, P.R. China).

Antiproliferatieonderzoek

De anti-proliferatiecapaciteiten van DMP/siBcl-xl en DMP/siMcl1 tot C26-cellen werden geëvalueerd met de MTT-methode. In het kort werden C26-cellen uitgeplaat met een dichtheid van 1,2 × 10³ cellen per putje in 100 L DMEM met 10% FBS in platen met 96 putjes en 24 h gekweekt. Cellen werden vervolgens 72 uur lang blootgesteld aan een reeks DMP / siBcl-xl en DMP / siMcl1 in verschillende concentraties. De levensvatbaarheid van cellen werd gemeten met behulp van de MTT-methode. De resultaten waren het gemiddelde van zes testruns.

Kloonvormingsonderzoek

C26-cellen werden uitgezaaid in een plaat met 6 putjes met een dichtheid van 10³ cellen per putje in 2 mL DMEM medium met 10% FBS. Vierentwintig uur later werden de cellen vervolgens blootgesteld aan een reeks DMP-micellen of DMP/Scramble-siRNA en DMP/siBcl-xl en DMP/siMcl1 in verschillende concentraties. Toen de cellen uitgroeiden tot een zichtbare kloon van het blote oog, werd de kweek beëindigd en gevolgd door spoelen, fixeren en verven. Het aantal klonen werd direct geteld en de remmingssnelheid werd berekend.

In vitro apoptose studie

De cellulaire apoptose werd waargenomen via Annexine V-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en propidiumjodide-kleuring. In het kort werden C26-cellen gezaaid in platen met zes putjes en gedurende 72 uur blootgesteld aan een reeks DMP-micellen, DMP / Scramble-siRNA, DMP / siBcl-xl en DMP / siMcl1. Cellen werden vervolgens onderworpen aan annexine V-FITC en propidiumjodidekleuring.

In vivo tumor xenograft-onderzoek

BALB/c-muizen van 6-8 weken oud werden ingeënt met 5 × 10⁶ C26-cellen op de rechterflank. DMP/siRNA-complexen equivalent aan 10 g siRNA werden om de dag intratumoraal geïnjecteerd gedurende 5 behandelingen, aangezien het tumorvolume 100 mm bereikte³ . Muizen die een equivalente hoeveelheid normale zoutoplossing of DMP kregen, werden als controlegroep beschouwd. De tumorgrootte werd gemeten en het diergewicht werd om de 2 dagen gevolgd totdat alle dieren waren gedood. Het tumorvolume werd berekend als (1/2 × lengte × breedte [2]).

Histologische analyse

De uitgesneden weefsels werden gedurende meer dan 24 uur gefixeerd in 4% neutraal gebufferde formaline-oplossing en ingebed in paraffine. Secties van de weefsels (3-5 m) werden gekleurd met hematoxyline en eosine. Deze analyse werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant en de monsters werden onderzocht met een fluorescentiemicroscoop (× 400).

Een in de handel verkrijgbare TUNEL-kit (Promega, Madison, WI) werd gebruikt om de apoptotische effecten in C26-muizenmelanoom-xenotransplantaattumorweefsels te analyseren. Deze analyse is uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant.

Statistische analyse

Gegevens werden uitgedrukt als de gemiddelde waarde ± SD. Statistische analyse werd uitgevoerd met eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) met behulp van SPSS-software. Voor alle resultaten, P ≤ 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Voorbereidingsprocesonderzoek

Om effectieve transfectie-efficiëntie en lage cytotoxiciteit voor het afleveren van siRNA te verkrijgen, hebben we verschillende bereidingsprocessen voor DMP-micellen bestudeerd, zoals weergegeven in tabel 1. In onze studie, met betrekking tot oplosmiddelen, waren DMP-micellen bereid door ethylacetaat zeer onstabiel en de stabiele tijd van DMP-micellen was niet meer dan 10 min. En DMP-micellen bereid door dichloormethaan en chloroform hadden beide een uitstekende stabiliteit, en ze konden stabiel blijven gedurende 96 uur, behalve DMP bereid door chloroform met een dosering van 20 mg DOTAP. Wat nog belangrijker is, ze hadden ook de juiste maat, zeta-potentieel en PDI. Door de initiële transfectie-efficiëntie te vergelijken, was de transfectie-efficiëntie van DMP-micellen bereid met dichloormethaan echter hoger dan die van DMP-micellen bereid met chloroform. Dus selecteerden we dichloormethaan om DMP-micellen te bereiden.

DMP-micellen bereid met drie doseringen DOTAP hadden geen duidelijke verschillen in grootte, zeta-potentiaal en PDI, maar DMP-micellen bereid met een dosering van 20 mg DOTAP hadden de hoogste transfectie-efficiëntie in drie doseringen DOTAP. Door de bovenstaande vergelijkingen hebben we een voorbereidingsproces geselecteerd op basis van DOTAP en MPEG-PCL (Fig. 1a) om DMP-micellen te bereiden met uitstekende stabiliteit en hoge transfectie-efficiëntie. Het bereidingsschema van DMP-micellen wordt weergegeven in Fig. 1b.

een Moleculaire structuur van DOTAP en MPEG-PCL. b Bereidingsschema van DMP-micellen. c Grootteverdelingsspectrum van DMP-micellen. d zeta-potentiaalspectrum van DMP-micellen. e siRNA vertragende test. v Cytotoxiciteit van DMP-micellen op 293T-cellen. g cytotoxiciteit van DMP-micellen op C26-cellen

Karakterisatie van DMP-micellen

Zoals weergegeven in Fig. 1c, gaf het deeltjesgrootteverdelingsspectrum aan dat DMP-micellen nanogrootte hadden (PDI =0,315) met een gemiddelde deeltjesgrootte van 144,8 nm, wat suggereert dat het een zeer smalle deeltjesgrootteverdeling had. Het zeta-potentiaalspectrum van DMP werd gepresenteerd in Fig. 1d met een zeta-potentiaal van 46,4 mV. De stabiliteit van DMP-micellen werd kwalitatief beoordeeld.

Om het bindingsvermogen van DMP met siRNA te evalueren, werd een gelvertragingstest uitgevoerd en de resultaten werden getoond in Fig. 1e. Wanneer de massaverhouding van DMP tot siRNA ≥ 30 was, werd volledige vertraging van Scramble-siRNA bereikt. Het anionische Scramble-siRNA werd geabsorbeerd op het oppervlak van DMP als gevolg van elektrostatische interactie, waardoor een DMP/siRNA-complex werd gevormd.

De cytotoxiciteit van DMP-micellen op C26-cellen en 293T-cellen werd geëvalueerd met de MTT-methode. Zoals getoond in Fig. 1f en g, vertoonde PEI25K een hoge toxiciteit op 293T-cellen, met IC₅₀ 0,83 g/ml. De DMP-micellen waren echter veel minder toxisch en de IC₅₀ van DMP was 3,7 g/ml. De IC₅₀ van DMP-micellen was 0,497 mg / ml op C26-cellen. PEI25K vertoonde echter een enorme toxiciteit, met IC₅₀ <0,1 g. DMP-micellen hadden dus een lagere cytotoxiciteit dan PEI25K en konden worden gebruikt om siRNA veilig aan C26-cellen te leveren.

In vitro transfectie

Naast biofysische karakterisering vergeleken we de transfectie-efficiëntie van DMP-micellen met die van PEI25K ("gouden standaard" transfectiemiddel) in vitro . Zoals getoond in Fig. 2 hadden DMP-micellen in medium dat 0%, 10%, 20% en 30% FBS-transfectie bevatte een transfectie-efficiëntie van 85,47 ± 1,01%, 81,57 ± 2,04%, 75,29 ± 1,20% en 71,64 ± 1,59% en PEI had een transfectie-efficiëntie van 86,38 ± 2,92%. Er was weinig verschil in transfectie-efficiëntie tussen serumgroep en niet-serumgroep. En de transfectie-efficiëntie van de serumgroep en de niet-serumgroep waren vergelijkbaar met de transfectie-efficiëntie van PEI. Bovendien presenteren de afbeeldingen in Fig. 2a een directe observatie van het transfectievermogen van DMP-micellen met een op FAM gebaseerd reportergen. Op de foto was te zien dat de keldermorfologie van de PEI-groep was veranderd in vergelijking met DMP-groepen, wat aantoonde dat PEI een hoge cytotoxiciteit had, terwijl DMP-micellen een lage cytotoxiciteit hadden.

Transfectie-efficiëntie van DMP-micellen. een Afbeelding van getransfecteerde C26-cellen (b , c ) transfectie-efficiëntie van DMP-micellen in medium met 0%, 10%, 20% en 30% FBS en PEI25K, geteld door flowcytometrie

Antikankeractiviteit in vitro

In het proces van gentherapie speelt siRNA een cruciale rol. Daarom hebben we een Bcl-xl-targeting siRNA en een Mcl1-targeting siRNA ontworpen om hun antikankeractiviteit te bestuderen. Om het interferentievermogen van Bcl-xl-siRNA en Mcl1-siRNA te evalueren, hebben we het interferentievermogen van Bcl-xl-siRNA en Mcl1-siRNA door qPCR bevestigd. Volgens onze resultaten (Fig. 3) was het mRNA-niveau van de DMP / siMcl1-groep lager dan dat van de controlegroepen (Fig. 3a). En het mRNA-niveau van DMP / siBcl-xl-groepen was lager dan dat van de controlegroepen (figuur 3b). Het is goed aangetoond dat DMP/siBcl-xl en DMP/siMCL1 het relevante mRNA-niveau efficiënt verlaagden.

een mRNA-niveau van Bcl-xl duidelijk verlaagd door DMP / siMcl1. b mRNA-niveau van Mcl1 duidelijk verlaagd door DMP / siBcl-xl. c Foto's van kloonvorming na behandeling met DMP/siBcl-xl of DMP/siMcl1 onder verschillende concentraties. d Het aantal klonen na behandeling met DMP/siBcl-xl met verschillende concentraties siRNA. e Antikankervermogen van DMP / siBcl-xl en DMP / siMcl1 met 50-nM en 100-nM concentratie van siRNA op C26-cellen in vitro. v De remmingssnelheid van kloonvorming na behandeling met DMP/siMcl1 van verschillende concentraties van siMcl1. g de remmingssnelheid van kloonvorming na behandeling met DMP/siBcl-xl van verschillende concentraties van siBcl-xl

Bovendien werden DMP-micellen gebruikt om siRNA in C26-cellen af te leveren om te bestuderen dat DMP/siBcl-xl en DMP/siMcl1 de groei van C26-cellen kunnen remmen. De levensvatbaarheid van de C26-cellen werd bepaald met de MTT-methode. De resultaten toonden aan dat de celoverlevingspercentages van DMP/siBcl-xl (50 nM en 100 nM) 69,6% ± 3,3% en 56,3% ± 1,9% waren en dat de celoverlevingspercentages van DMP/siMcl1 (50 nM en 100 nM) 82,8 waren. %±3,1% en 56,3%±3,2% (Fig. 3e).

Om de antikankeractiviteit van DMP/siBcl-xl en DMP/siMcl1 verder te bestuderen, werd een kloonvormingsassay uitgevoerd. Het werd duidelijk aangetoond dat in Fig. 3c en d, vergeleken met de controlegroep, het aantal klonen in DMP/siBcl-xl en DMP/siMcl1 (50 nM en 100 nM) lager was. Deze resultaten suggereerden dat DMP/siBcl-xl en DMP/siMcl1 een duidelijk anti-proliferatie-effect hadden op C26-cellen. Door de resultaten van de MTT-assay te combineren, toonden de resultaten aan dat DMP/siBcl-xl en DMP/siMcl1 de proliferatie van C26-cellen zouden kunnen remmen en een prominente antikankeractiviteit op C26-cellen hebben.

Om te bepalen of DMP/siBcl-xl- en DMP/siMcl1-geïnduceerd verlies van proliferatiecapaciteit en cellevensvatbaarheid van DMP-micellen geassocieerd waren met de inductie van apoptose, werd het aantal apoptotische cellen bepaald met flowcytometrie. Zoals getoond in Fig. 3f, waren de apoptosepercentages van de DMP / siMcl1-groep 37, 9% ± 4, 7%, wat hoger was dan die van de controlegroep en de DMP-groep en de DMP / Scramble-siRNA-groep. Zoals getoond in Fig. 3g, was de apoptosesnelheid van de DMP / siBcl-xl-groep 33,0% ± 3,8%, wat ook hoger was dan die van andere controlegroepen. Deze apoptosegegevens gaven aan dat DMP/siMcl1 en DMP/siBcl-xl een sterk apoptose-inducerend vermogen hadden. De resultaten van de apoptose-assay waren consistent met de MTT-resultaten en de eerder beschreven resultaten van kloonvorming, wat suggereert dat het induceren van apoptose een mogelijk mechanisme is voor het remmen van de proliferatie en levensvatbaarheid van C26-cellen.

DMP/siRNA-complex remt C26-tumorgroei in vivo

Een C26-xenotransplantaatdiermodel werd ook gebruikt om de antitumorwerking van het DMP/siRNA-complex in vivo te testen. De tumorgroeicurven en afbeeldingen van C26-xenotransplantaattumoren van elke groep worden weergegeven in Fig. 4a en b. Volgens onze resultaten resulteerde intratumorale injectie van DMP/siMcl1 en DMP/siBcl-xl in een significante remming van xenotransplantaattumorgroei in vergelijking met controlegroepen. Het gewicht van de tumoren in elke groep wordt weergegeven in figuur 4b. In vergelijking met de NS-behandelingsgroep (0,85 ± 0,09 g) en de DMP-groep (0,76 ± 0,11 g), veroorzaakte het DMP/siMcl1-complex een statistisch significante vermindering van het tumorgewicht (0,34 ± 0,06 g, P <0,01), en ondertussen veroorzaakte het DMP/siBcl-xl-complex een statistisch significante vermindering van het tumorgewicht (0,42 ± 0,08 g, P <0,01). Deze resultaten suggereren dat intratumorale injectie van DMP / siRNA-complex de groei van subcutaan xenotransplantaat van C26-darmkankermodel efficiënt zou kunnen remmen. De in vivo bijwerkingen van DMP/siRNA-complex op andere organen werden onderzocht door middel van HE-analyse. Zoals getoond in Fig. 4 werden er geen significante pathologische veranderingen in het hart, de lever, de milt, de longen of de nieren waargenomen.

Antikankereffecten en veiligheid van DMP / siRNA op C26-muisxenotransplantaatmodel. een Tumorontwikkelingscurve, berekend door tumorvolume. b Gemiddeld gewicht van tumoren in elke groep. Vergeleken met andere behandelingsgroepen bereikten de DMP/siMcl1-groep en DMP/siBcl-xl-groep een statistisch significante vermindering van het tumorgewicht (***P , 0,001). c Representatieve beelden van tumoren van C26 coloncarcinoom. d Apoptose in tumorweefsel gedetecteerd door TUNEL-assay. e HE-analyse van de belangrijkste organen van elke behandelingsgroep in beide modellen. Er werden geen significante pathologische veranderingen waargenomen in hart, lever, milt, long of nier

Discussie

In deze studie werden kationische zelf-geassembleerde DOTAP- en MPEG-PCL-hybride micellen bereid om Bcl-xl-siRNA en Mcl1-siRNA af te leveren voor de behandeling van C26-darmkanker. Deze DMP-micellen hadden een uitstekende stabiliteit en waren in staat om Bcl-xl-siRNA en Mcl1-siRNA effectief te combineren en naar C26-cellen te verzenden. Wat nog belangrijker is, DMP-micellen leverden ongekend siRNA (Bcl-xl-siRNA en Mcl1-siRNA) en zouden effectief de apoptose van C26-cellen kunnen induceren, wat resulteert in het remmen van de groei van C26-cellen zowel in vitro als in vivo met hoge veiligheid. Gezamenlijk suggereerde onze studie dat DMP een potentiële genoverdrachtsdrager is voor siRNA.

Er zijn meldingen dat kationische lipide DOTAP op grote schaal is toegepast voor de afgifte van siRNA, maar het veroorzaakt sterke positieve ladingen die hemolyse veroorzaken en had een hoge cytotoxiciteit. Gebaseerd op DOTAP-kationische liposomen met hoge transfectie-efficiëntie, maar hun positieve ladingen zouden toxiciteit veroorzaken, de reden kan zijn dat quaternaire ammoniumzoutkop van DMP met positieve ladingen werd blootgesteld aan het oppervlak van de liposoomfosfolipide dubbellaag. DMP-micellen op basis van DOTAP-lipide hadden echter een hoge transfectie en een lage cytotoxiciteit. We speculeerden dat in het zelf-geassembleerde proces van micellen DOTAP was ingebed in de polymeer nanodeeltjes, waarvan de quaternaire ammoniumzoutkop niet volledig aan het oppervlak was blootgesteld. Zo werden de gedeeltelijke positieve ladingen gemaskeerd; in de tussentijd laten onze resultaten ook zien dat de transfectie-efficiëntie van DMP-micellen niet laag was in vergelijking met de transfectie-efficiëntie van PEI25K. Het suggereerde dat de positieve ladingen van DOTAP nadat ze waren bedekt, nog steeds gedeeltelijk waren blootgesteld, wat het juiste potentieel vertoonde, en dit niveau van potentieel bleek voldoende te zijn om siRNA te combineren en over te dragen. Bovendien gaven onze resultaten aan dat DMP-micellen op basis van MPEG-PCL een effectieve en veilige genafgiftedrager zijn, die is geoptimaliseerd voor de cytotoxiciteit van DOTAP en de gentransmissiecapaciteit van DOTAP behoudt. En een soortgelijk onderzoek had gemeld dat de cytotoxiciteit van DOTAP werd verminderd na combinatie met andere materialen [23]. Onlangs had een nieuwe vector bestaande uit DOTAP en SWNT een lagere cytotoxiciteit bij siRNA-afgifte in vergelijking met lipofectamine [8]. LPN's die DOTAP-PLGA-micellen zijn bereid met behulp van een dubbele-emulsie-oplosmiddelverdamping (DESE) -methode resulteerden in dragers van nanogrootte [24,25,26]. Deze studies kwamen goed overeen met die beschreven in ons onderzoek en maakten ons vermoeden tot op zekere hoogte overtuigender.

De afgifte-efficiëntie van de genoverdrachtsvector wordt sterk beïnvloed door serum. De serumeiwitten in het serum konden de positieve ladingen op het oppervlak van de nanocarrier/siRNA-complexen neutraliseren, die werden beïnvloed door de elektrostatische effecten op het oppervlak van cellen met negatieve ladingen [27,28,29].

In onze studie, toen we de transfectie-efficiëntie van DMP-micellen bestudeerden, hebben we een reeks DMEM-medium opgezet met 0%, 10%, 20% en 30% FBS voor transfectie, waarbij we het effect van serum op de transfectie-efficiëntie van geladen FAM siRNA-nanodeeltjes. Onze resultaten toonden aan dat de aanwezigheid van FBS weinig invloed had op de transfectie-efficiëntie. In dit artikel hebben we MPEG-PCL gebruikt om DOTAP te bedekken, en DOTAP was ingebed in MP met sommige delen in de juiste verhouding op het oppervlak. Op basis van deze structuur speculeerden we dat de positieve ladingen van de DOTAP gedeeltelijk verborgen waren vanwege de dekking van MPEG-PCL, die het niveau van blootstelling aan serumeiwitten verminderde, zodat het effect van serum op transfectie werd vermeden. Het impliceerde dat naast de verminderde oppervlakteladingen van kationische dragers na modificatie, de aanwezigheid van serumtransfectie weinig effect had op de efficiëntie van de kationische polymeerdrager. Vanwege de uitstekende transfectiecapaciteit in serumomgeving aangetoond door DMP-micellen in vitro, suggereerde het dat het serum weinig affectie had voor DMP-gemedieerde siRNA-afgifte in vitro celexperiment.

Conclusie

In deze studie hadden de bereide DMP-micellen het vermogen om siRNA af te leveren. En DMP-micellen werden gebruikt om Bcl-xl-siRNA en Mcl1-siRNA in C26-cellen af te leveren voor onderzoek naar activiteit tegen kanker in vitro. We onderzochten het bereidingsproces voor DMP-micellen en selecteerden een uitstekend bereidingsproces om DMP-micellen te bereiden met een smalle grootte, goede zeta-potentiaal en uitstekende stabiliteit. Bovendien werden de bereide DMP-micellen niet beïnvloed door de aanwezigheid van een in vitro transfectie-experiment in serum. Belangrijker is dat DMP/siBcl-xl en DMP/siMcl1 Bcl-xl-gen en Mcl1-genexpressie kunnen remmen, apoptose van C26-cellen induceren en vervolgens een therapeutisch effect bereiken door de groei van C26-cellen te remmen. Intratumorale injectie van DMP / siRNA-complex zou de groei van subcutaan xenotransplantaat van C26-darmkankermodel efficiënt kunnen remmen. Er werden geen significante pathologische veranderingen in het hart, de lever, de milt, de longen of de nieren waargenomen. Er wordt aangenomen dat DMP-micellen kunnen worden beschouwd als een effectieve drager om siRNA af te geven voor de behandeling van darmkanker.

Afkortingen

DOTAP:: N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N, N, N-trimethylammoniummethylsulfaat
mPEG-PCL:: Methoxypoly (ethyleenglycol) Poly (caprolacton)
MTT:: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide
siRNA:: Klein storend RNA

Oppervlakte-impedantie van meta-oppervlakken/grafeen hybride structuren Elektronische en magnetische eigenschappen van defecte monolaag WSe2 met vacatures

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal