Atomic Force Microscopie-gebaseerde nanoscopie van chondrogeen differentiërende menselijke vet-afgeleide stamcellen:nanostructuur en integrine β1-expressie

Resultaten en discussie

Beoordeling van hADSc

Mesenchymale stamcellen zijn multipotente stromale cellen die osteogeen, adipogeen, chondrogeen en myogeen potentieel hebben. Er zijn twee belangrijke manieren om hADSc te identificeren, celoppervlak-CD-markers en het vermogen om te differentiëren [16]. Zoals weergegeven in Aanvullend bestand 1:Afbeelding S1 en Aanvullend bestand 2:Afbeelding S2, waren de afgeleide cellen hADSc. Vervolgens werd celproliferatie van passage 3 hADSc bepaald door MTT-assay (aanvullend bestand 3:figuur S3).

Geïnduceerde morfologie en oppervlakte-ultrastructuurveranderingen tijdens hADSc-chondrogenese

AFM wordt altijd gebruikt om celmorfologie en ultrastructuur op nanoschaal te detecteren [17]. De vorm van een cel heeft betrekking op zijn gespecialiseerde celfunctie en op weefselorganisatie. In sommige kankeronderzoeken kan AFM worden gebruikt als een techniek voor hoge beeldvorming om morfologische veranderingen te analyseren voor de evaluatie van geneesmiddeleffecten. Verder verandert de vorm van mesenchymale stamcellen tijdens chondrogene inductie [18]. Hoewel veranderingen van celvorm nodig lijken te zijn voor differentiatie, is er weinig bekend over de vraag of celmorfologie eerdere ontwikkelingsstadia van mesenchymale stamceldifferentiatie beïnvloedt. Daarom werden veranderingen in de morfologie en ultrastructuur van het membraan tijdens hADSc-chondrogenese geëvalueerd door AFM, aangezien deze veranderingen belangrijk zijn [19] en de functie van cellen direct kunnen beïnvloeden [20]. Oppervlaktemorfologie en ultrafijne structuur van hADSc werden onderzocht tijdens chondrogene differentiatie gedurende verschillende tijdsperioden (Fig. 1 en Fig. 2). De morfologie en oppervlakte-ultrastructuur waren duidelijk verschillend in elke vergelijkingsgroep. Op dag 0 hadden cellen een langwerpige spilvorm met een relatief glad oppervlak. De celmembraanarchitectuur was homogeen. Na chondrogene inductie werden op dag 6 en 12 significante veranderingen in celmorfologie waargenomen. De meeste cellen kromp geleidelijk in een veelhoekige vorm (figuur 1a) met een afname van de gemiddelde cellengte / breedte-verhouding tijdens chondrogene differentiatie (figuur 1b). Talrijke studies tonen aan dat de veranderingen in celmorfologie consistent zijn met het cytoskelet van cellen [21]. We vonden ook de veranderingen in het cytoskelet tijdens chondrogene differentiatie, wat werd uitgelegd in de laatste resultaten.

Kenmerken van hADSc-morfologie tijdens chondrogenese. een Morfologische beelden van hele hADSc werden verkregen na 0, 6 en 12 dagen chondrogene differentiatie. Beelden werden geanalyseerd door een hoogte- en piekkrachtfoutbeeldmodel door Nanoscope. b De gemiddelde lengte / breedte-verhouding van cellen werd gemeten na chondrogene differentiatiebehandeling op 0, 6 en 12 dagen. *p < 0.05, **p < 0.01

Kenmerken van hADSc-membraan-ultrastructuur tijdens chondrogene differentiatie. een Veranderingen in de ultrastructuur van het celmembraan werden beoordeeld na chondrogene differentiatie gedurende 0, 6 en 12 dagen. b De parameters van de oppervlakteruwheid Ra en Rq van cellen werden gemeten tijdens chondrogene inductie van hADSc gedurende 0, 6 en 12 dagen

Zoals getoond in figuur 2a, veranderde ook de ultrastructuur van het celmembraan; deeltjes werden vergroot en waren heterogeen. Eerdere studies toonden aan dat Ra en Rq de makers waren van de ruwheidswaarde om de verandering in verschillend behandelde celmembranen te evalueren [22]. Rq gaat over wortel-gemiddelde-kwadraat ruwheid, \( \mathrm{Rq}=\sqrt{\frac{\sum_{t-1}^N{\left( Zn-\overline{Z}\right)}^2 }{N-1}} \); \( \mathrm{Rq}=\sqrt{\frac{\sum_{\mathrm{t}-1}^{\mathrm{N}}{\left(\mathrm{Zn}-\overline{\mathrm{Z }}\right)}^2}{\mathrm{N}-1}}; \) Ra is ongeveer de gemiddelde ruwheid, \( \mathrm{Ra}=\frac{1}{N}{\sum}_{ t-1}^N1\mid Zi-\overline{Z}\mid \). Om de ruwheid te krijgen, is de scangrootte 10 μm  ×  10 μm. Zoals getoond in figuur 2b, namen zowel de Ra als Rq van twee verschillende gebieden toe tijdens de chondrogenese van hADSc. De Ra- en Rq-waarden van de cellen op dag 0 waren laag, wat wijst op een glad oppervlak (figuur 2b). De waarden voor Ra en Rq namen gelijktijdig toe met chondrogene differentiatie, met een grotere heterogeniteit en ruwer op celoppervlakken (figuur 2a). Op basis van waargenomen veranderingen resulteerde chondrogene differentiatie in celmorfologie en veranderingen in de hoogte / breedte-verhouding van de cellen (Fig. 1a, b). Er zijn onderzoeken die aantonen dat ECM celadhesie zou kunnen reguleren door integrines te reguleren [11]. Daarom suggereerden verhoogde ruwheidswaarden veranderingen in ECM en de ultrastructuur van het celmembraan tijdens chondrogenese. Deze gegevens tonen aan dat chondrogene differentiatie de celmorfologie, de ECM en de celmembraanstructuur beïnvloedt.

Cytoskeletveranderingen tijdens chondrogene inductie van hADSc

Tijdens stamceldifferentiatie zijn celmorfologie en structurele veranderingen van het membraan gerelateerd aan het cytoskelet van de cel, volgend op de ontwikkeling van afstammingsspecifieke cellulaire kenmerken [21]. Zoals weergegeven in figuur 3a, geven de rode en blauwe fluorescentiesignalen respectievelijk F-actine en DAPI aan. Het celcytoskelet veranderde sterk tijdens chondrogene inductie in figuur 3a. Aan de ene kant gingen de microfilamenten van het cytoskelet langs de lange celas op dag 0-groep, terwijl de microfilamenten van het cytoskelet zich in een radiale reeks verspreidden wanneer hADSc gedurende 12 dagen met chondrogene differentiatie werd behandeld. Aan de andere kant was de verdeling van celmicrofilamenten homogeen op dag 0-groep, maar de microfilamenten werden voornamelijk verdeeld aan de periferie van hADSc die 12 dagen lang met chondrogene differentiatie was behandeld.

Organisatie van het cytoskelet en locatie van integrine β1 op chondrogeen differentiërende hADSc. een Veranderingen in het cytoskelet werden gedetecteerd tijdens chondrogenese van hADSc door confocale microscopie. b De locatie van integrine β1 werd gemeten tijdens chondrogene differentiatie door confocale microscopie. Cytoskelet en kern werden gekleurd met respectievelijk F-actine en DAPI. De rode en blauwe fluorescentiesignalen geven respectievelijk F-actine en DAPI aan

Chondrogene differentiatie veranderde de bindingswaarschijnlijkheid van integrine β1 aan receptoren op hADSc

AFM is ook een nuttig hulpmiddel voor de studie van de bindingskracht tussen liganden en hun receptoren, waardoor de membraan-receptor signaaltransductie op celoppervlakken duidelijk wordt [23]. Door AFM worden veranderingen tussen integrine β1 en zijn receptoren op een visuele, eenvoudige en specifieke manier gemeten. De interactie van de integrine 1 ligand-receptor op levende cellen is een manier om het bindingsproces op het celmembraan te onderzoeken. De procedure voor AFM-tipfunctionalisatie is de koppeling van integrine β1 aan AFM-tips door koppeling van APTES en glutaaraldehyde. Deze tips werden gebruikt voor de detectie van de binding van integrine β1 aan CD29-receptoren op celoppervlakken (figuur 4a). Krachtspectroscopie met één molecuul (SMFS) werd gebruikt om de anti-integrine β1-levende celscheidingskrachtverdeling binnen gelokaliseerde regio's van individuele levende hADSc te beoordelen (figuur 4b). Representatieve krachtcurven worden getoond in figuur 4c, d, die een curve met één molecuul (figuur 4c) en twee paar breukpiekcurven (figuur 4d) weergeven. Blokkeerexperimenten en experimenten met blote AFM-tips werden uitgevoerd om de specificiteit van de verkregen krachtcurven te verifiëren. Bare AFM-tips hebben geen specifieke krachtpiek gedetecteerd (figuur 4e). Kale AFM-experimenten toonden aan dat de niet-specifieke bindingswaarschijnlijkheid van integrine 1-ligand-receptor-interactie op het oppervlak van hADSc minder dan 1% was. Voor het blokkeren van experimenten werd het anti-integrine β1-antilichaam gedurende 30 minuten met cellen geïncubeerd en vervolgens werden krachtcurven geregistreerd met behulp van integrine β1-gefunctionaliseerde tips. Het blokkerende antilichaam verminderde de krachtcurven met 90% (figuur 4f). Er was geen verschil in bindingskans van integrine 1-ligand-receptor op celoppervlakken tussen de drie groepen na behandeling met anti-integrine 1-antilichaam (figuur 4g). Deze resultaten tonen aan dat antilichaam-gemodificeerde AFM-tips zeer nuttig waren om de kracht te detecteren, en dat de met integrine β1-gefunctionaliseerde AFM-tips specifiek waren.

AFM-krachtmetingen met integrine β1-gefunctionaliseerde AFM-tip op levende hADSc. een Schematische weergave van de strategie die wordt gebruikt voor immobilisatie van integrine β1 op een AFM-tip. b Schematische weergave van de kracht van één molecuul gemeten tussen integrine β1-gefunctionaliseerde AFM-tips en levende hADSc. c, d Representatieve krachtcurven verkregen met integrine β1-gemodificeerde AFM-tips op hADSc, en e nadat het systeem was geblokkeerd met de integrine 1-monoklonale antilichaamoplossing. v De bindingskans van integrine β1-gefunctionaliseerde tips op hADSc voor en na blokkering door integrine β1-antilichaam op dag 0. g De bindingskans van CD29-gefunctionaliseerde tips op hADSc na blokkering door integrine β1-antilichaam op 0, 6 en 12 dagen. ***p < 0,001, n.s.. geen significant verschil

De bindende kracht (breekkracht) is de interactiekracht tussen liganden en hun receptoren [24]. Veranderingen in morfologie en oppervlakte-ultrastructuur van plasmamembranen houden verband met vele processen van celbiologie, zoals differentiatie, apoptose en celmigratie. Tijdens differentiatie wordt aangenomen dat veranderingen in het cytoskelet verband houden met integrineveranderingen, met name integrine β1. Integrine β1 (CD29) is erg belangrijk bij celadhesie aan ECM en bij cel-celadhesie. Het kan ook interageren met intracellulaire eiwitten, waardoor signaalmoleculen worden gestimuleerd die gerelateerd zijn aan het actine-cytoskelet [25]. In deze studie werden veranderingen in het cytoskelet en de celmorfologie waargenomen tijdens hADSc-chondrogenese door confocale laser scanning microscopie (CLSM) en AFM. Tijdens chondrogene differentiatie kunnen veranderingen in het cytoskelet, de morfologie en de ultrastructuur van het oppervlak een nieuwe en betrouwbare indicator zijn van de celtoestand. Integrine β1, de CD29-receptor, wordt verdeeld over het celoppervlak, zoals beoordeeld door immunofluorescentie (figuur 3b). Bindingssterkte en stabiliteit van integrine β1-ligand-receptorcomplexen tijdens hADSc-chondrogenese werden geëvalueerd op 0, 6 en 12 dagen differentiatie. Een totaal van 1200 curven werden voor elke dag geregistreerd, met gemiddelde breukkrachten van respectievelijk 61,8 ± 22,2 pN, 60 ± 20,2 pN en 67,2 ± 22,0 pN (Fig. 5a-c). De verdeling van de krachtgrootte werd geanalyseerd als krachtgemiddelde + SD (afb. 5d). Er was geen significant verschil in krachtgemiddelde tussen dag 0 en 6. Er was een verschil in krachtgemiddelde tussen dag 0 en 12. De grootte van de bindingskracht nam toe op dag 12. Ondertussen ruptuurgebeurtenissen op 0, 6 en 12 dagen waren respectievelijk 19,58 ±-1,74%, 28,03 ± 2,05% en 33,4 ±-1,89% (Fig. 5e). De verhoogde bindingswaarschijnlijkheid gaf ook aan dat integrine β1 (CD29) een belangrijke rol speelde bij chondrogene differentiatie en mogelijk de informatie verschaft voor chondrogene differentiatie, via signaalroutes. Daarom kunnen verhoogde integrine-β1-nanodomeinen tijdens chondrogene differentiatie de bindingssterkte van de CD29-ligand-receptor op levende hADSc fundamenteel beïnvloeden. Veranderingen in morfologie en oppervlakte-ultrastructuur van plasmamembranen gingen gepaard met veranderingen in integrine 1-eiwitstructuur, conformatie, bindingssterkte en stabiliteit van integrine 1-ligand-receptorcomplexen op cellen. Samenvattend speelt integrine β1 een noodzakelijke rol bij de chondrogene differentiatie van hADSc.

Bindingskracht en bindingskans gemeten op het oppervlak van levende hADSc door integrine β1-gefunctionaliseerde AFM-tips. a–c Histogrammen van de bindingskracht van integrine β1-antilichaam-receptor verkregen tijdens hADSc-chondrogene differentiatie gedurende 0, 6 en 12 dagen. d Bindende krachten voor integrine 1-receptoren werden verkregen op 0, 6 en 12 dagen chondrogene differentiatie van hADSc. e Bindingswaarschijnlijkheid van integrine 1-receptor werd gedetecteerd tijdens chondrogene differentiatie van hADSc gedurende 0, 6 en 12 dagen. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001, n.s. geen significant verschil

Upregulatie van Integrine β1 tijdens hADSc Chondrogeen Differentiatie

Talrijke studies hebben aangetoond dat familieleden van integrine een belangrijke rol spelen bij celdifferentiatie. Verder kunnen integrines de interactie tussen de extracellulaire omgeving en cellen reguleren, waardoor signaaltransductieroutes via verbonden eiwitten worden gecontroleerd [26]. Eerdere studies hebben aangetoond dat de bindingskans kan worden beïnvloed door de dichtheid en conformatie van het transmembraaneiwit (receptoren) op het celoppervlak [27]. Integrineconformatie kan een gesloten zendspoel zijn, die een lage affiniteit heeft voor ligand, of een open zendspoel, die een hoge affiniteit heeft voor ligand [28, 29]. Expressie van integrine β1 werd opwaarts gereguleerd op zowel transcriptionele als translationele niveaus met verhoogde collageen II-expressie, kenmerkend voor chondrocyten (Fig. 6a, b). Als zodanig was opwaarts gereguleerde integrine β1-expressie consistent met verhoogde bindingswaarschijnlijkheid, ongeacht de conformatie.

The role of integrin β1 and β-catenin/SOX pathway in regulating hADSc chondrogenic differentiation. een Protein integrin β1 was up-regulated during chondrogenesis of hADSc as assessed by western blotting. Cartilage differentiation up-regulated collagen II expression at different days. b The mRNA of integrin β1 was up-regulated during chondrogenic differentiation of hADSc. c Measurement of proteins associated with the β-catenin/SOX pathway during chondrogenic differentiation of hADSc for 0, 6, and 12 days. *p < 0.05, **p  < 0.01

The Role of Integrin β1 in Chondrogenic Differentiation Regulated by the β-catenin/SOX Signaling Pathway

Previous studies have shown Wnt/β-catenin, PI3K, and mTOR signaling pathways to be related to integrin β1 [30,31,32]. Each is important in mesenchymal stem cell differentiation. Likewise, studies have demonstrated SOX and collagen II to be regulated by integrin β1 during chondrogenesis of hADSc. SOX is a hallmark component of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Hence, we hypothesized that chondrogenic differentiation was regulated by the β-catenin/SOX pathway via integrin β1. SOX, GSK-3β, β-catenin, and integrin β1 were all increased during chondrogenesis of hADSc (Fig. 6c), with integrin β1 inducing cell signaling. These data demonstrate chondrogenic differentiation to be regulated by the β-catenin/SOX pathway via integrin β1.

Prospective and Limitations

In this work, changes in cellular morphology, the structure of the membrane, and the binding probability of integrin β1 ligand–receptors were demonstrated to be useful image markers to evaluate the chondrogenic differentiation process. This is a new method for evaluation of morphology, membrane ultrastructure, and changes in transmembrane proteins during chondrogenic differentiation. There are limitations to this study. Although increased binding probability was related to the high expression of integrin β1, the conformation of integrin β1 during chondrogenesis was not investigated. Further work is necessary to determine the conformation of integrin β1 during chondrogenic differentiation. Integrin β1 was demonstrated to participate in the β-catenin/SOX signaling pathway during chondrogenesis of hADSc. However, the relationship between integrin β1 and β-catenin/SOX signaling pathway is still not fully established. Further work is necessary to identify the exact role of integrin β1 in this pathway.