Fluorescerende neoglycoproteïne gouden nanoclusters:synthese en toepassingen in lectinedetectie bij planten en celbeeldvorming

Resultaten en discussie

We optimaliseerden de synthese van ovalbumine-gouden nanoclusters versierd met de G0-glycan (G0-OVA-AuNC's) op basis van eerdere rapporten waarbij gebruik werd gemaakt van ongeconjugeerd OVA-eiwit [25, 26]. Eiwitbeschermde AuNC's werden bereid door toevoeging van goudtetrachloorgoud (III) zuur (HAuCl₄ ^. 3H₂ O) tot een eiwitoplossing, gevolgd door 1 M waterige oplossing van natriumhydroxide. Een verhoging van de reactie-pH verhoogt het reductiepotentieel van tryptofaan- en tyrosineresiduen die aanwezig zijn in OVA (Fig. 1a) [14]. De eiwitsteiger fungeert als zowel reductief als stabiliserend reagens, waarbij het kleine gouden cluster in de eiwitstructuur wordt gevangen en van de omgeving wordt geïsoleerd. Een eerder protocol voor de synthese van fluorescerende OVA-AuNC's vereiste een zeer sterk geconcentreerde OVA-oplossing (tot 65 mg mL ⁻¹ ) [25]. Om het gebruik van waardevolle OVA-neoglycoconjugaten voor de bereiding van AuNC's te beperken, hebben we de minimale hoeveelheid ongeconjugeerde OVA bepaald die efficiënt OVA-AuNC's zou kunnen produceren. We hebben vastgesteld dat een OVA-concentratie van 15 mg mL ⁻¹ was voldoende om clusters met sterke fluorescentie-emissie te produceren (aanvullend bestand 1:figuur S1). De vorming van OVA-AuNC's werd aanzienlijk versneld door microgolfbestraling, waardoor de reactietijd werd verkort van 18 uur tot 6 minuten [25]. Bovendien zorgde microgolfbestraling voor een homogene verwarming van de oplossing, wat de vorming van uniforme en monodisperse clusters [1] bevorderde. OVA-AuNC's die op deze manier zijn bereid, vertonen een lichtbruine kleur en zenden een sterke rode fluorescentie uit onder UV-lichtverlichting (figuur 1b). Het UV-Vis-spectrum van OVA-AuNC's mist de absorptie die overeenkomt met een gelokaliseerde oppervlakte-plasmonresonantieband, wat de afwezigheid suggereert van gouden nanodeeltjes groter dan 5 nm [27], wat verder werd bevestigd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). We hebben een gemiddelde diameter van de gouden kern van de OVA-AuNCs gemeten in een bereik van 1,9 ± 0,7 nm (aanvullend bestand 1:figuur S2). Ten slotte werd de gemiddelde hydrodynamische grootte van OVA-AuNC van 8,7 nm ± 2,5 nm toegewezen door dynamische lichtverstrooiing (aanvullend bestand 1:figuur S2). Het vergelijkbare groottebereik als OVA (6,5-7 nm diameter [28]) suggereert de aanwezigheid van een enkel eiwitmolecuul per gouden kern. Verdere analyse van OVA-AuNC's door agarosegelelektroforese toonde een vergelijkbare mobiliteit voor OVA en OVA-AuNC's naar een positieve elektrode die de vergelijkbare grootte voor beide soorten en hun negatieve lading bij neutrale pH verder bevestigt (figuur 1c). Het fluorescentie-emissiespectrum van OVA-AuNC's vertoont een maximale emissiepiek bij λ 670 nm bij excitatie bij 350 nm (figuur 1d). De excitatiespectra van AuNC's zijn breed en de Stokes shift groot (boven 200 nm), wat ideaal is voor spectrale veelkleurige detectietoepassingen in de aanwezigheid van een andere fluorescerende sonde (multiplexing) die wordt gekenmerkt door een vergelijkbare excitatiegolflengte, zoals blauw emitterende Alexa Fluor® 405-kleurstof [26]. De kwantumopbrengst (QY) van OVA-AuNC's werd berekend op ≈ 4% wanneer fluoresceïne in 0,1 M NaOH (QY = ≈ 92%) als referentiestandaard werd gebruikt [29]. De oxidatietoestand van de gouden kern werd toegewezen aan een mengsel van Au(I)- en Au(0)-soorten op basis van röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS) metingen (aanvullend bestand 1:figuur S3) [11, 30]. Studie van het circulair dichroïsme (CD) van de secundaire structuur van het eiwit onthulde een willekeurige spoelorganisatie die een verlies van de natieve vouw voor OVA in AuNC's suggereert, waarschijnlijk als gevolg van ruwe alkalische omstandigheden tijdens de synthese (aanvullend bestand 1:figuur S4) [31]. Ten slotte hebben we ook een buitengewone stabiliteit van OVA-AuNC's waargenomen binnen een breed pH-bereik (3-11) en in een oplossing die foetaal runderserum (FBS) bevat, het meest gebruikte serumsupplement voor in vitro celkweek (Extra bestand 1:Figuur S5). Dit kenmerk van OVA gouden nanoclusters benadrukt hun bruikbaarheid voor in vitro en in vivo bioassays en opent spannende nieuwe toepassingen. De pH-ongevoelige fluorescentie-emissie van OVA-AuNC's zou bijvoorbeeld een efficiënte tracking van deeltjes in de cel mogelijk maken zonder signaalverlies, zelfs in de endosomale compartimenten, die worden gekenmerkt door een licht zure pH [32, 33]. Integendeel, onder deze omstandigheden kan het gebruik van bepaalde fluoresceïneconjugaten in het gedrang komen, aangezien de maximale fluorescentie-emissie van deze kleurstoffen wordt bereikt bij de basische pH. OVA-AuNC's vertoonden ook een uitstekende oplosbaarheid, zowel in water als in celgroeimedium. Volledige solubilisatie van OVA-AuNC's werd waargenomen tot een concentratie van 40 mg / ml, zowel in water als in celgroeimedium. (Extra bestand 1:Figuur S6). Fluorescentie-emissiespectra bij verschillende OVA-AuNCs-verdunningen werden gemeten en onderzocht om stabiel te zijn onder incubatie bij 37 ° C tot 24 uur.

een Schematische weergave van OVA-AuNCs-synthese. b UV-zichtbare spectra van OVA (blauwe lijn) en OVA-AuNC's (oranje lijn). Invoegen:afbeeldingen van OVA-AuNC's (a ) en OVA (b ) onder zichtbaar licht (links) en onder UV-licht (365 nm) (rechts). c Agarosegelelektroforese van OVA (gekleurd met Coomassie Blue G-250) en OVA-AuNC's (onder UV-lichtverlichting). d Fluorescentie-excitatie (groene lijn) en emissie (roze lijn) spectra van OVA-AuNC's

Voor de synthese van met G0-OVA neoglycoproteïne-beschermde AuNC's hebben we in eerste instantie G0-gefunctionaliseerde OVA-neoglycoproteïnen bereid. Biantennaire N-glycan G0 uitgerust met een C5-aminolinker werd gesynthetiseerd zoals eerder beschreven [34] en de conjugatie met OVA werd bereikt met behulp van disuccinimidylsuberaatester (DSS) als verknopingsreagens (Fig. 2a) [21, 35]. In het kort wordt de conjugatie uitgevoerd in een tweestapsreactie:N-glycan G0 wordt gefunctionaliseerd met een 13-voudige overmaat DSS-linker en vervolgens gekoppeld aan vrije aminogroepen op OVA. Door de glycan/eiwit-verhouding te regelen, konden we de mate van OVA-substitutie effectief aanpassen (zie SI). De succesvolle vorming van neoglycoproteïnen werd geverifieerd door het verschijnen van een diffuse elektroforetisch langzamere migrerende band op de SDS-PAGE-gel (Fig. 2b), terwijl het gemiddelde aantal geïntroduceerde glycanen verder werd bepaald door MALDI-TOF-massaspectrometrie [21] (Fig. 2c). Volgens deze strategie produceerden we OVA-neoglycoconjugaten die 2-3, 3-4 en 5-6 kopieën van N-glycan G0 per eiwit vertoonden.

een Synthese van G0-OVA neoglycoconjugaten (n =waardigheid). b SDS-PAGE-gelelektroforese van OVA- en G0-OVA-neoglycoproteïnen die verschillende valenties van N-glycan G0 bevatten. c MALDI-TOF massaspectra van OVA en G0-OVA neoglycoproteïnen die verschillende valenties van N-glycan G0 bevatten

Vervolgens gebruikten we de synthetische neoglycoproteïnen bij de bereiding van AuNC's (figuur 3a) onder eerder geoptimaliseerde omstandigheden en onderzochten we het effect van de glycan-functionalisatie en de valentie ervan op de fysieke en optische eigenschappen van de clusters. Zoals weergegeven in Fig. 3, waren de absorptie UV-Vis en fluorescentie-emissie van G0-OVA-AuNC's identiek aan OVA-AuNC's met karakteristieke absorptie bij 278 nm en rode fluorescentie-emissie met een maximum van ongeveer 670 nm (Fig. 3b, c).

een Schematische weergave van van G0-glycaan afgeleide OVA-AuNCs-synthese. b Fluorescentie-emissiespectra van G0-OVA-AuNC's (blauwe, oranje en groene lijnen) in vergelijking met OVA-AuNC's (roze lijn). c UV-zichtbare spectra van G0-OVA-AuNC (blauwe, oranje en groene lijnen) en OVA-AuNC (roze lijn)

Verder hebben we door TEM-metingen een gemiddelde diameter van 1,6 ± 0,5 nm (Fig. 4) voor de G0-OVA-AuNCs-kern vastgesteld, wat vergelijkbaar is met de grootte van OVA-AuNC's (1,9 ± 0,7 nm). Dus, op basis van onze resultaten, denken we dat de glycanen geconjugeerd aan OVA via lysineresiduen of de N-terminus geen invloed hebben op het algehele reductieve potentieel van glycoproteïnen en verdere vorming van clusters bij de geteste valenties [36]. Bovendien lijken suikers de vorming van clusterstabiliserende Au (I)-thiolaatpolymeren [37, 38] tussen de cysteïnegroepen van eiwit en gouden kern niet te belemmeren, zelfs niet wanneer ze in een groter aantal (5-6 exemplaren) aanwezig zijn.

TEM-afbeelding van G0-OVA-AuNC's (3/4). Insert:grootteverdeling van gouden kerndiameter van G0-OVA-AuNC's (3/4)

Ten slotte werd, op dezelfde manier als OVA-AuNC's, de secundaire structuur van het G0-OVA-AuNC's (3/4)-eiwit toegewezen door CD en onthulde een willekeurige spoelorganisatie (aanvullend bestand 1:figuur S4). Door de hechting van glycanen aan de eiwitstructuur van AuNC's, introduceren we targetingmoleculen die interactie met koolhydraatbindende eiwitten mogelijk maken en tegelijkertijd blijft een OVA-eiwit alleen als een drager die conformationele veranderingen de lectineherkenning van de hele systeem. De antigene capaciteit van gedenatureerde OVA bij de productie van antilichamen bij muizen [39] en bij T-celactivering is beschreven. De activering van T-cellen is onafhankelijk van de secundaire structuur van het antigeen, aangezien deze wordt gemedieerd via herkenning van bepaalde aminozuursequenties die zowel in natieve als in gedenatureerde OVA voorkomen [40]. In feite is het antigeen OVA 323-339-peptide verantwoordelijk voor de belangrijkste specifieke T-celrespons op OVA en dit peptide is gebruikt in nanodeeltjes om immuunresponsen te induceren [41].

Om de functionaliteit van nieuw geïntroduceerde glycaanketens op door neoglycoproteïne beschermde gouden nanoclusters te onderzoeken, onderzochten we hun interactie met verschillende plantaardige lectines in agglutinatie-experimenten. We voerden incubaties uit van G0-OVA-AuNC's en OVA-AuNC's met twee verschillende plantenlectines, Bandeiraea simplicifolia lectine-II (BSL-II) specifiek voor terminale GlcNAc-groepen en Solanum tuberosum lectine (STL), dat de kernchitobiose herkent die aanwezig is in de N-glycanen [34, 42]. Naast en om alle niet-specifieke interacties tussen G0-OVA-AuNC's en lectines te verwijderen, Aleuria aurantia lectine (AAL) specifiek voor L-fucose werd als controle opgenomen. We voegden toenemende concentraties van BSL-II, STL en AAL-lectines toe aan een oplossing van G0-OVA-AuNC's (5/6). Na incubatie in het donker werden de oplossingen gecentrifugeerd en werd de fluorescentie van het supernatant gemeten. Zoals aangetoond in Fig. 5, konden we een afname van de fluorescentie-intensiteit op een concentratieafhankelijke manier waarnemen na incubatie met BSL-II en STL (Fig. 5a-d), terwijl de fluorescentie-intensiteit onveranderd bleef in de aanwezigheid van AAL (Fig. 5e). Na de incubatie van GO-OVA-AuNC's (5/6) met STL, werd een zichtbaar precipitaat onder UV-lampbestraling waargenomen, terwijl er geen precipitatie verscheen na incubatie met AAL (Fig. 5f). De relatie van initiële fluorescentiewaarden (F0) met de uiteindelijke waarden (F) na lectine-incubatie werd weergegeven tegen toenemende concentraties van lectines (Fig. 5b, d). STL-interactie met G0-OVA-AuNC's (5/6) vertoonde lineariteit van 0 tot 7,5 μM en de detectielimiet werd berekend op basis van de vergelijking SD*3/S (waarbij SD de standaarddeviatie van de kalibratiecurve is en S is de hellingswaarde) [12, 13] tot 2,35 μM (y = 1.95x + 0.4266, R ² = 0,97). Op dezelfde manier toonde BSL-II-interactie met G0-OVA-AuNC's (5/6) lineariteit van 0 tot 10 μM en de detectielimiet (LOD) werd berekend op 2,83 μM (y = 0.5687x + 0.5838, R ² = 0.965). Interessant is dat clusters met een lager aantal geconjugeerde suikers zoals G0-OVA-AuNC's (2/3) (aanvullend bestand 1:figuur S7, AB) geen significante verandering in fluorescentie-intensiteit vertoonden na toevoeging van BSL-II en STL, wat aangeeft gebrek aan agglutinatie. Dit gedrag benadrukt een belangrijk effect van multivalente presentatie van glycanen op de verknopingsactiviteit van lectines, zelfs wanneer slechts kleine verschillen in glycaandichtheid worden toegepast. Belangrijk is dat er geen verandering werd waargenomen in de fluorescentie-emissie-intensiteit van niet-geconjugeerde OVA-AuNC's die waren geïncubeerd met lectines (aanvullend bestand 1:figuur S7, C-D). Hoewel natieve kippen-OVA een enkele N-gekoppelde glycosyleringsplaats (Asn-292) bevat die voornamelijk is gesubstitueerd met hoog mannose of minder overvloedige hybride en complexe type N-glycanen [43], wordt deze suikermodificatie niet herkend door STL noch BSL-II , waarschijnlijk vanwege de monovalente presentatie. Dit bevestigde de aanwezigheid van een specifieke koolhydraat-lectine-interactie tussen chemisch geïntroduceerde G0 op G0-OVA-AuNC's en STL/BSL-II en sloot niet-specifieke binding van OVA-AuNC's aan de lectines uit. We voorzien een mogelijke toepassing van dit systeem voor de detectie van biomarkers voor koolhydraatbindende eiwitten. Desalniettemin zou de bereiding van neoglycoproteïnen die een groot aantal glycaankopieën vertonen, de aviditeit van het construct in de richting van het gewenste lectine verhogen, waardoor de detectielimiet wordt verbeterd [44].

Lectine-agglutinatie-assays van G0-OVA-AuNC's (5/6). een Representatieve fluorescentiespectra van de supernatanten van OVA-G0 (5/6)-AuNCs-oplossingen na incubatie met BSL-II. b Vertegenwoordiging van F0/F tegen toenemende concentraties van BSL-II. c Representatieve fluorescentiespectra van de supernatanten van OVA-G0 (5/6)-AuNCs-oplossingen na incubatie met STL. d Vertegenwoordiging van F0/F tegen toenemende concentraties STL. e Representatieve fluorescentiespectra van de supernatanten van OVA-G0 (5/6)-AuNCs na incubatie met AAL. v Afbeelding die overeenkomt met incubatie van G0-OVA-AuNC's (5/6) met AAL en STL, onder UV-lichtverlichting (365 nm). Na incubatie met STL werd een zichtbaar precipitaat gevormd. Aan de rechterkant:schematische illustratie van binding tussen G0-OVA-AuNC's en plantlectine

We hebben ook de interactie van G0-OVA-AuNC's (5/6) met STL in de aanwezigheid van cellulaire groeimedia bestudeerd om het mogelijke effect van mediacomponenten in koolhydraateiwitinteracties te onderscheiden. G0-OVA-AuNC's (5/6) werden opgelost in volledig Iscove's gemodificeerde Dulbecco's medium (IMDM) aangevuld met foetaal kalfsserum en geïncubeerd met toenemende hoeveelheden STL; de resulterende oplossingen werden geanalyseerd door middel van agarosegelelektroforese. (Extra bestand 1:Figuur S8). De elektroforetische mobiliteit van G0-OVA-AuNC's (5/6) wordt zowel in water als in complex medium gehandhaafd. Desalniettemin was er in de aanwezigheid van toenemende hoeveelheden STL een dosisafhankelijke verplaatsing van G0-OVA-AuNC's (5/6) naar de negatieve pool, wat de eiwit-koolhydraatinteractie benadrukt, zelfs in de aanwezigheid van complexe cellulaire media. Dit geeft aan dat eiwit-koolhydraatinteracties met G0-OVA-AuNC's (5/6) niet worden belemmerd door de aanwezigheid van mediacomponenten.

Het potentieel van clusters voor fluorescentiebeeldvorming en eerder succes met DC's gericht op G0-OVA neoglycoproteïnen [21] moedigde ons aan om G0-OVA-AuNC's te bestuderen in de opname door muizen-DC's in vitro. We gebruikten confocale fluorescentiemicroscopie om de internalisatie van zelf-fluorescerende G0-OVA-AuNC's (3/4) te visualiseren. Milt-DC's werden geïsoleerd uit C57BL/6J-muizen en CD11c ⁺ populatie werd gezuiverd door magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) (aanvullend bestand 1:figuur S9) en 's nachts uitgezaaid op met poly-d-lysine gecoate glazen dekglaasjes. Als proof of concept werden gezuiverde DC's geïncubeerd met GO-OVA-AuNC's (3/4), gewassen om ongebonden materialen te verwijderen en gefixeerd. Na 40 minuten incubatie werden confocale fluorescentiemicroscopiebeelden verkregen (Fig. 6) en we observeerden sterke fluorescentie voor dendritische cellen die waren geïncubeerd met G0-OVA-AuNC's (3/4), wat hun effectieve internalisatie aantoont (Fig. 6a) en gebrek aan fluorescentie in de negatieve controle (ongestimuleerde CD11 ⁺ cellen; Extra bestand 1:Afbeelding S9). De internalisatie van nanoclusters werd verder bevestigd door het stapelen van enkele DC-beelden genomen langs hun Z -as (z-stack) en door reconstructie van een 3D-beeld van een enkele DC om fluorescentie-emissie vanuit de cel te visualiseren (Fig. 6b en Aanvullend bestand 1:Figuur S10).

Opname van G0-OVA-AuNC's (3/4) door muizen-DC's gemeten met confocale microscopie. een Representatieve afbeeldingen van CD11c ⁺ cellen na incubatie met G0-OVA-AuNC's (3/4). b Z-stack-afbeelding van een enkele dendritische cel die de opname van G0-OVA-AuNC's in de cel weergeeft

Samenvattend hebben we neoglycoproteïne-beschermde gouden nanoclusters bereid en gekarakteriseerd die zijn gebruikt in agglutinatie-experimenten en in DC's-opname-assay. Met het voorbeeld van specifieke detectie van lectine bij planten hebben we het nut van G0-OVA-AuNC's voor de analyse van koolhydraat-eiwit-interacties aangetoond. We toonden ook in vitro beeldvorming van dendritische cellen door middel van fluorescentiemicroscopie. Er moeten echter verdere experimenten worden ondernomen om eerst de rol van glycaan bij de opname van nanoclusters door DC's beter te begrijpen (bijvoorbeeld door de lokalisatie van nanoclusters in de cellulaire compartimenten te volgen) en ten tweede om hun bio- en cytocompatibiliteit te bestuderen. Op basis van onze eerdere resultaten die de targeting-eigenschappen van G0-glycaan en een toename van de G0-OVA-opname door DC's beschrijven in vergelijking met ongeconjugeerde OVA, zijn we van mening dat G0-OVA-AuNC's een aantrekkelijk alternatief kunnen worden voor fluorescent gelabelde neoglycoproteïnen.