Artesunaat-geladen en nabij-infrarood kleurstof-geconjugeerde albumine nanodeeltjes als zeer efficiënte tumor-gerichte foto-chemo theranostic agent

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering van FA-IHA NP's

Afbeelding 1 illustreert het schematische gebruik van FA-IHA-NP's en hun toepassing voor beeldgestuurde, op tumor gerichte combinatietherapie met fotochemotherapie. De multifunctionele theranostische middelen FA-IHA NP's werden bereid via een eenvoudige en biocompatibele zelfassemblagemethode. Het geconjugeerde ICG werd gebruikt als een NIR-fluorescentiebeeldvormingsmiddel en fototherapiemiddel vanwege zijn PTT-PDT-eigenschappen. Bovendien oefende de geladen Arte het chemotherapeutische effect uit.

Schematische weergave van het gebruik van FA-IHA-NP's voor beeldgestuurde, op tumor gerichte combinatietherapie met fotochemotherapie in vitro en in vivo

Het TEM-beeld van FA-IHA NP's toont een monodisperse bolvormige structuur met een diameter van ongeveer 131,2 nm (figuur 2a). Deze hydrodynamische diameter werd volgens DLS-analyse bevestigd als 131   ± -2, 3 nm lang in water, fosfaatbufferzout (PBS) en celmedium (figuur 2b). Het zeta-potentieel van 131,2 ± 2.12 werd ook gedetecteerd als − 29,2 ± 1.13 mV in deze drie media (Fig. 2c). Bovendien had de diameter van FA-IHA NP's geen significante verandering gedurende 7 dagen in deze drie media (figuur 2d). Deze resultaten gaven aan dat de bereide FA-IHA NP's een goede stabiliteit hadden, waarschijnlijk vanwege de PEG- en HSA-coating. Het UV-vis-NIR-spectrum van FA-IHA NP's vertoonde de absorptiepiek van zowel Arte als ICG (Fig. 2e), wat het bestaan ​​van Arte en ICG in FA-IHA NP's aantoont. De Arte-laadverhouding was 98,6 ± 3,1% en de ICG-laadverhouding was 56,9 ± -2,4%. Afbeelding 2f laat zien dat de FA-IHA-NP's een vergelijkbare fluorescentie-eigenschap hadden in vergelijking met vrije ICG.

een TEM-afbeelding van FA-IHA NP's. b , c Grootte en zeta-potentiaalverdeling van FA-IHA NP's in water, celmedium en PBS. d FA-IHA NP's grootteverandering in water, celmedium en PBS. e Absorptiespectra van vrije ICG-, Arte- en FA-IHA-NP's. v Fluorescentiespectra van vrije ICG en FA-IHA NP's

Aangemoedigd door de sterke NIR optische absorptie van FA-IHA NP's, werd de fotothermische eigenschap van FA-IHA NP's geëvalueerd. Water, vrije ICG en FA-IHA NP's (met gelijke ICG-concentratie) werden bestraald met een 808 nm laser (1 W/cm ² ). De temperatuur van de FA-IHA NP's en vrije ICG steeg met ongeveer 36 ° C binnen 5 minuten na bestraling (Fig. 3a), terwijl water een temperatuurstijging gaf van minder dan 4 ° C, wat aantoont dat de ICG-bevatte nanodeeltjes significante fotothermische effect en hebben het potentieel voor kankertherapie. Bovendien, Aanvullend bestand 1:Afbeelding S1 toont de fotothermische verwarmingscurves van FA-IHA NP's onder 5 min van 808 nm laserbestraling met 0,5, 1 en 1,5 W/cm ² , wat aangeeft dat de optimale laserintensiteit 1 W/cm ² . is . De fotostabiliteitstests op FA-IHA NP's en vrije ICG werden uitgevoerd. Gratis ICG vertoonde een significante temperatuurdaling na vijf cycli in vergelijking met FA-IHA NP's (figuur 3b). Afbeelding 3c toont de verandering in absorptie-intensiteit van vrije ICG en FA-IHA NP's voor en na vijf cycli van NIR-bestraling (808 nm, 1 W/cm ² ). De resultaten suggereerden dat de absorptie-intensiteit bij 808 nm vrij ICG afnam na vijf cycli van NIR-bestraling, terwijl FA-IHA NP's de oorspronkelijke absorptie-intensiteit behielden. Bovendien vergeleken we de fluorescentiestabiliteit van vrije ICG- en FA-IHA-NP's (figuur 3d). Na 30 dagen opslag bij 4 °C was de fluorescentie-intensiteit van FA-IHA NP's bij 800 nm 0,72 vergeleken met de initiële intensiteit van 1, terwijl de fluorescentie van vrij ICG daalde tot 0,12 vergeleken met de initiële intensiteit, als gevolg van de geïnduceerde aggregatie. -fotobleken [36]. Deze resultaten gaven aan dat de covalent geconjugeerde ICG stabieler was dan de vrije ICG, waarschijnlijk als gevolg van de zelfassemblage van HSA en PEG die ICG beschermt tegen door de interne omgeving veroorzaakte aggregatie, zoals warmte of licht. Deze resultaten suggereerden dus dat FA-IHA NP's een uitstekend fotothermisch effect en fotothermische stabiliteit hadden.

een Fotothermische verwarmingscurves van water, ICG en FA-IHA NP's onder 5 min 808 nm laserstraling (1 W/cm ² ). b Temperatuurvariaties van ICG en FA-IHA NP's na continue 5 min bestraling met een 808 nm laser gedurende 5 cycli. c De absorptieverandering van FA-IHA NP's bij 780 nm voor en na bestraling met een 808 nm NIR-laser gedurende 5 cycli. d Fluorescentieverandering van ICG en FA-IHA NP's gedurende 30 dagen

Vervolgens werd een ROS-specifieke probe 1,3-difenylisobenzofuran (DPBF) gebruikt om ROS-productie door FA-IHA NP's na NIR-bestraling te detecteren. Zoals weergegeven in figuur 4a, produceerden FA-IHA-NP's een significante ROS-hoeveelheid (0,58 in de standaardabsorptie) binnen 5 minuten na NIR-bestraling in vergelijking met gratis ICG (0,35), wat kan worden toegeschreven aan combinatietherapie met FA-IHA NP's.

een Genormaliseerde DPBF-absorptie in aanwezigheid van ICG, FA-IHA NP's en blanco monster onder 808 nm laserbestraling (1 W/cm ² ). b Vrijgavekinetiek van Arte uit FA-IHA NP's onder respectievelijk pH = 7.4 en pH = 6.5 met of zonder NIR-laserbestraling

Onder NIR-laserstraling (808 nm, 1 W/cm ² ) en pH-toestand, werd de afgifteprestatie onderzocht (figuur 4b). Als contrast, zonder NIR-bestraling, vertoonden FA-IHA NP's 11,61% en 34,2% Arte-afgifte onder respectievelijk pH 7,4 en pH 6,5, terwijl onder NIR-bestraling gedurende zes keer, FA-IHA NP's een totaal van 68,4% Arte-afgifte vertoonden bij pH 6,5, wat suggereert dat NIR-bestraling en zure toestand beide Arte-afgifte van FA-IHA NP's aanzienlijk kunnen veroorzaken. De NIR-bestraling en zuurgevoelige geneesmiddelafgifte waren waarschijnlijk te wijten aan de door warmte geïnduceerde expansie van HSA-nanodeeltjes, en bovendien, in een zure omgeving, de H ⁺ zou de oppervlaktelading van HSA kunnen veranderen die de hydrofiele/hydrofobe balans van de nanodeeltjes verandert [37, 38].

Celopname en detectie van intracellulaire ROS

Dankzij de fluorescentie-eigenschappen van ICG werd de opname van FA-IHA NP's rechtstreeks waargenomen in HepG2-cellen door een fluorescentiemicroscoop. Zoals getoond in Fig. 5a, vertoonde het cytoplasma na behandeling van de cellen met FA-IHA NP's een sterkere rode ICG-fluorescentie dan die waargenomen in cellen die waren behandeld met vrije ICG en IHA NP's. Verder werd de celopnameverhouding van FA-IHA NP's door FCM gekwantificeerd als 52,3%, wat hoger was dan die van IHA NP's (25,2%) en vrije ICG (3,9%) (figuur 5b). De resultaten toonden aan dat de geconjugeerde FA de nanodeeltjes in staat stelde om de FA-receptoren op tumorcellen te targeten en zo de opname van FA-IHA NP's door cellen te verbeteren [39, 40, 41].

een Confocale fluorescerende beelden van HepG2-cellen na incubatie met gratis ICG- en IHA-NP's en FA-IHA-NP's. Rode en blauwe kleuren vertegenwoordigen respectievelijk ICG-fluorescentie en DAPI-gekleurde celkernen. b Flowcytometriemeting van ICG-fluorescentie-intensiteiten in HepG2-cellen na incubatie met vrije ICG en IHA NP's en FA-IHA NP's

Door een fluorescentiemicroscoop te gebruiken, observeerden we de intrinsieke fotodynamische activiteit van met Arte-, ICG- en FA-IHA NP's behandelde cellen met of zonder NIR-bestraling. Een ROS-sonde 2, 7-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat werd gebruikt om de cellulaire ROS-productie te visualiseren. De resultaten toonden aan dat FA-IHA NP's een significant verbeterde ROS-productie konden induceren in vergelijking met andere monsters na 5 minuten NIR-bestraling (figuur 6a). De corresponderende fluorescerende waarden worden getoond in Fig. 6b.

een Fluorescentiebeelden van ROS-productie in kankercellen die met verschillende medicijnen zijn behandeld, en b overeenkomstige fluorescentie-intensiteit:(1) PBS, (2) Arte, (3) FA-HA NP's, (4) gratis ICG + NIR, (5) IHA NPs + NIR, en (6) FA-IHA NPs + NIR

In vitro tumor gecombineerde foto-chemotherapie

Afbeelding 7a toont de temperatuurverandering van de met PBS, vrije ICG-, IHA NP's en FA-IHA NP's behandelde cellen (met gelijke ICG-concentratie) na 5 min NIR-bestraling (1,0 W/cm ² ). De temperatuur van cellen behandeld met FA-IHA NP's vertoonde de grootste stijging (ΔT = 31 °C) vergeleken met die van met PBS, vrije ICG- en IHA NP's behandelde cellen. De levensvatbaarheid van cellen behandeld met Arte, IHA NP's en FA-IHA NP's in verschillende concentraties gedurende 24 uur zonder NIR-bestraling nam af met verhoogde concentratie, terwijl vrij ICG bij deze concentraties geen cytotoxiciteit vertoonde (Fig. 7b). Ondertussen vertoonden de medicijndrager FA-IH NP's (FA-IHA NP's zonder Arte) ook geen significante cytotoxiciteit (aanvullend bestand 1:figuur S2). Daarentegen na NIR-bestraling (1,0 W/cm ² , 5 min), werd significante concentratieafhankelijke celdood waargenomen in cellen die waren behandeld met vrije ICG, IHA NP's en FA-IHA NP's (Fig. 7c). Het effect was vooral significant in met FA-IHA NP's behandelde cellen. Het uitstekende antikankereffect kan worden toegeschreven aan de gerichte combinatorische fotochemotherapie, zoals het chemotherapeutische effect van het vrijgekomen Arte en het PTT-PDT-therapeutisch effect van ICG. Verder werd de cytotoxiciteit van FA-IHA NP's met of zonder NIR-bestraling onderzocht door middel van dubbele kleuring met calceïne-AM/PI. Cellen behandeld met FA-IHA NP's en bestraling waren bijna volledig dood in vergelijking met andere behandelde groepen (Fig. 7d).

een Temperatuurveranderingscurven van met PBS, vrije ICG-, IHA NP's en FA-IHA NP's behandelde cellen in platen met 96 putjes na 5 minuten NIR-bestraling. b, c Cellevensvatbaarheid van cellen behandeld met vrije ICG, Arte, IHA NP's en FA-IHA NP's zonder of met 808 nm laserbestraling (5 min, 1 W/cm ² ), respectievelijk. d Calcium AM/PI dual-kleuring beelden van cellen na behandeling met respectievelijk PBS (controle), PBS + NIR, FA-IHA NP's en FA-IHA NP's + NIR

In vivo fluorescentiebeeldvorming

Zoals getoond in Fig. 8a en b 0,1 uur na injectie van vrije ICG, IHA NP's en FA-IHA NP's, kon een sterk fluorescentiesignaal worden gezien in het hele lichaam van de tumordragende muizen. Fluorescentiesignalen namen toe in het tumorgebied met de toenemende tijd en bereikten de piek 24 uur na injectie. De tumorfluorescentiesignalen in de FA-IHA NP's-groep waren het hoogst in vergelijking met die van ICG- en IHA NP's-groepen op alle geteste punten (Fig. 8b), wat aangeeft dat FA-IHA NP's sterk kunnen accumuleren in het tumorgebied als gevolg van de FA -geïnduceerd tumorgericht effect. Bovendien werd de biodistributie in belangrijke weefsels, waaronder hart, lever, milt, longen en nieren, uitgevoerd door een ex vivo kwantitatieve fluorescentie-analyse 24 uur na injectie. In alle geteste groepen werden sterke fluorescentiesignalen gedetecteerd in het leverweefsel (Fig. 8c), wat aangeeft dat de belangrijkste metabolische omzetting van deze verbindingen een hepatische route volgt. Deze resultaten toonden aan dat FA-IHA NP's zich selectief kunnen ophopen in tumoren in vivo, waarschijnlijk veroorzaakt door het FA-gerichte effect [37].

een Representatieve fluorescentiebeelden van tumordragende muizen na injectie van de staartader met gratis ICG, IHA NP's en FA-RIPNP's. De zwarte gestippelde cirkels geven het tumorgebied aan. b Kwantitatieve in vivo analyse van het fluorescentiesignaal in de tumorgebieden van muizen die zijn behandeld met vrije ICG, IHA NP's en FA-IHA NP's als functie van de injectietijd. c Het fluorescentiesignaal van belangrijke organen, waaronder hart, lever, milt, longen en nier

In vivo tumor gecombineerde foto-chemotherapie

Zoals getoond in Fig. 9a en b, de tumortemperatuur in de tumordragende muizen na behandeling met PBS, vrije ICG, IHA NP's en FA-IHA NP's 24 uur na injectie onder 5 min NIR-bestraling (1 W/ cm ² ) werd opgenomen door een warmtebeeldcamera. Een toename van ongeveer 22,1 ° C van het tumorgebied werd gedetecteerd in de met FA-IHA NP's behandelde groep, wat het hoogst was dan die van andere groepen. Na twee cycli van NIR-bestraling (dag 0 en dag 2) vertoonde de FA-IHA NP's + NIR-groep een significante onderdrukking van de tumorgroei zonder een terugval (Fig. 9c), terwijl de groepen behandeld met PBS, Arte, FA-IHA NP's, PBS + NIR, ICG + NIR en IHA NPs + NIR vertoonden geen duidelijke indicatie van tumorsuppressie. Bovendien vertoonden de muizen in de FA-IHA NPs + NIR-groep na 90 dagen een overlevingspercentage van 100% (Fig. 9d). Deze resultaten geven aan dat FA-IHA-NP's met NIR-bestraling een uitstekende in vivo tumortherapeutische werkzaamheid hadden, waarschijnlijk als gevolg van actieve gerichte en gecombineerde fotochemotherapie.

een Temperatuur van het tumorgebied bij tumordragende muizen na injectie in de staartader van PBS, ICG, IHA NP's en FA-RIPNP's na 24 uur onder 5 minuten NIR-bestraling (808 nm, 1 W/cm ² ). b Thermische beelden van tumordragende muizen na staartaderinjectie van PBS, ICG, IHA NP's en FA-RIPNP's na 24 uur onder 5 minuten NIR-bestraling (808 nm, 1 W/cm ² ). c HepG2-xenotransplantaattumoren groeiprofiel na intraveneuze injectie van PBS, Arte, ICG, IHA NP's en FA-RIPNP's met of zonder 5 min NIR-bestraling (808 nm, 1 W/cm ² ). d Overlevingspercentage van tumordragende muizen na staartaderinjectie met PBS, vrije Arte, ICG, IHA NP's en FA-RIPNP's met of zonder 5 min NIR-bestraling (808 nm, 1 W/cm ² )

Ten slotte werd kleuring met hematoxyline en eosine (H&E) gebruikt om de toxiciteit van FA-IHA NP's te evalueren. De sectie-afbeeldingen vertoonden geen significante histologische laesies in vergelijking met de met PBS behandelde groep (Fig. 10), wat aangeeft dat FA-IHA NP's verwaarloosbare toxiciteit hadden, wat waarschijnlijk te wijten was aan de veiligheid van de ingrediënten van de FA-IHA NP's, dus gunstig voor hun toekomstig gebruik in de klinische praktijk.

H&E-gekleurde weefselsecties van belangrijke organen, waaronder hart, lever, milt, longen en nieren van muizen die zijn behandeld met PBS en FA-IHA NP's