Toxiciteitsbeoordeling van PEG-PCCL-nanodeeltjes en voorlopig onderzoek naar het antitumoreffect van Paclitaxel-loading

Methoden

Materialen, cellen en dieren

ε-caprolacton (ε-CL, Alfa Aesar, VS), poly(ethyleenglycol) (PEG, Mn = 1000, Fluka, VS), hexamethyleendiisocyanaat (HMDI, Aldrich, VS), Palladium sur charbon (pd/c, Sigma , VS), Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM, Hyclone, VS), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT, Sigma, VS), runderserumalbumine (BSA , BR, BoAo Co. Ltd., China) werden zonder verdere zuivering gebruikt. Alle materialen waren van analytische reagenskwaliteit.

Mannelijke Balb/C-muizen (7-8 weken oud, 20-25 g gewicht) en Nieuw-Zeeland konijn (2,5-3,0 kg gewicht) werden gekocht bij de Chengdu DaShuo biotech Companies (Sichuan, China) met kwaliteitscertificaat nr. SCXK2013– 24. De dieren werden gehouden in een standaard specifieke pathogeenvrije omgeving met voldoende voer en kraanwater. De experimenten zijn uitgevoerd volgens de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Ministerie van Wetenschap en Technologie van China, 2006). Alle dierexperimentele procedures zijn goedgekeurd door de ethische commissie voor proefdieren van het West China Medical Center van de Universiteit van Sichuan.

Muis H22 hepatocarcinoomcellen (H22), menselijke embryonale niercellen (HEK293T) en hepatoomcarcinoomcellen (Hep G2) werden verkregen van de afdeling Immunologie, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University. HEK293T en Hep G2 werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-media (DMEM) (Hyclone, UT, VS), aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) (Hyclone, UT, VS) en antibiotica (penicilline 100 E/ml en streptomycine 100 E/mL) bij 37 °C in 5% CO2.

Voorbereiding van PEG-PCCL en PTX-geladen PEG-PCCL-micellen

PEG-PCCL en PTX-NP's werden geleverd door onze medewerker, professor Liu van de School of Microelectronics and Solid-state Electronics, University of Electronic Science and Technology of China. De PEG-PCCL diblokcopolymeren werden gesynthetiseerd door de ringopeningspolymerisatie van ɛ-CL in aanwezigheid van PEG-homopolymeer met de katalysatoren van Palladium sur charbon als het stroomdiagram hieronder (Fig. 1). De verkregen PEG-PCCL-copolymeren werden gezuiverd en tot gebruik in luchtdichte zakken bewaard.

Het stroomdiagram van het synthetiseren van het PEG-PCCL-dipolymeer

Om PTX in PEG-PCCL-nanodeeltjes te laden, werd vaste dispersie, een eenvoudige en waardevolle techniek zonder giftig organisch oplosmiddel [19] uitgevoerd nadat PEG-PCCL was bereid. Vervolgens werd de oplossing onder verminderde druk bij 60°C ingedampt. Na verdamping van alcohol werden homogene copolymeren verkregen. PTX werd ingekapseld door polymere dragers als amorfe vorm. De gezamenlijke verdamping werd opgelost in water van 65 ° C om PTX-NPs-oplossing te produceren, die werd gefiltreerd met een 0,22 nm-filter om een ​​geklaarde en steriele oplossing te verkrijgen. PTX-NPs-poeder werd verkregen uit de gevriesdroogde oplossing van een gevriesdroogd systeem. De invangefficiëntie (EE) van PTX werd bepaald met de minikolom-centrifugatiemethode [20]. De concentraties van PTX opgenomen in PEG-PCCL (C_I ) of het totale geneesmiddel in PEG-PCCL-dispersies (C_T ) werden geanalyseerd met HPLC. EE (%) = (C_I / C_T ) × 100%.

Karakterisering

De deeltjesgrootte en zeta-potentiaal van PEG-PCCL werden gemeten met een laserdeeltjesgrootte-analysator (Malvern Nano-ZS 90). Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, H-6009IV, Hitachi, Japan) werd gebruikt om de morfologie van PEG-PCCL te beoordelen. In het bijzonder werd de oplossing van nanodeeltjes op een koperen rooster geplaatst dat bedekt was met nitrocellulose, en vervolgens werden de monsters gekleurd met fosfowolfraamzuur en gedroogd bij kamertemperatuur.

Cytotoxiciteitstesten

De cytotoxiciteit werd beoordeeld met MTT- en LDH-lektest in Hep-G2 en HEK293T. MTS-metabolisatie werd gekwantificeerd in intacte cellen volgens de procedure van MTT [21]. Celsuspensies werden bereid door trypsine/EDTA (HyClone, UT, VS). Een totaal van 0,4 × 10 ⁴ cellen werden gezaaid in een plaat met 96 putjes (Corning, MA, VS). De platen werden 12 uur geïncubeerd om de cellen aan het plastic oppervlak van de kweekplaten te laten hechten. Vervolgens werd het medium verwijderd en werd 200 μl vers kweekmedium of medium met verschillende concentraties PEG-PCCL (van 0 tot 1 mg/ml) aan de putjes toegevoegd. Tijdens de blootstellingsperiode van 24 uur werd geen FCS aan het medium toegevoegd. Het overlevingspercentage werd bepaald door cytotoxiciteitsparameters en werd weergegeven door de vergelijking:Overlevingspercentage (%) = (OD_T /OD_C ) × 100. Hier, OD_T en OD_C verwijzen naar de absorptiewaarde (gemeten met de spectrofotometerlezer bij 570 nm) van respectievelijk met PEG-PCCL of PEI-nanodeeltjes behandelde cellen en van onbehandelde cellen.

LDH-lekkage in kweekmedium werd onderzocht met behulp van de LDH-assaykit (Biotech, China). Alle spectrometrische metingen van met nanodeeltjes behandelde groepen werden gecorrigeerd door een celvrije controle. Voor de morfologische studie werden HepG2-cellen gezaaid en blootgesteld op dezelfde manier als in de cytotoxiciteitstests. Cellen werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde en werden waargenomen onder de transmissie-elektronenmicroscoop (TEM).

Apoptose-assays

Apoptose werd bepaald door Annexine V-FITC en PI dubbele kleuring [22]. In het kort werden HepG2-cellen gezaaid in platen met 12 putjes met een dichtheid van 4 × 10 ⁴ cellen/putje en 48 uur behandeld met PEG-PCCL (0,5 mg/ml) en PEI (0,5 mg/ml). Vervolgens werden de cellen driemaal gewassen met koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door Annexin V-FITC-incubatie gedurende 15 minuten en PI-kleuring gedurende nog eens 15 minuten bij 4 ° C in het donker. De gekleurde cellen werden binnen 30 min waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop (Olympus Co. Ltd., Tokyo, Japan).

Hemocompatibiliteitstest

De hemocompatibiliteit van PEG/PCCL werd geëvalueerd volgens de eerder gerapporteerde in vitro hemolysetest voor rode bloedcellen (RBC) [23]. De bloedmonsters van de muizen werden verzameld en de erytrocyten werden opgelost in PBS (2% RBC-oplossing). Fysiologische zoutoplossing, PEI of PEG-PCCL van 0,5 mg/ml werden gemengd met de 2% RBC-oplossing. Een positieve hemolysecontrole werd bereid door een gelijk volume erytrocytensuspensie en gedestilleerd water toe te voegen. Nadat het mengsel 1 en 3 uur op 37 ° C was gehouden en vervolgens gedurende 5 minuten bij 2000 r/min was gecentrifugeerd, werden de supernatanten gedetecteerd met een microplaatlezer (Bio-Rad, CA, VS) bij 570 nm. Het percentage hemolyse werd berekend met de vergelijking:hemolyse % = (OD_T –OD_NC )/(OD_PC –OD_NC ) × 100. Hier, OD_T , OD_NC , en OD_PC verwijzen naar de absorptiewaarden van respectievelijk monster, negatieve controle en positieve controle. Bovendien werd de in vivo hemolyse bepaald door het RBC-nummer te tellen van het bloedmonster verzameld via de staartader van de muizen die waren behandeld met normale zoutoplossing, PEI (20 mg/kg) of PEG-PCCL (20 mg/kg) gedurende 3 uur.

Konijnenflebitis

Aders in beide oren van konijnen werden gebruikt om de infiltratie van ontstekingscellen en epidermale degeneratie te vergelijken [24, 25]. De konijnen werden willekeurig in twee groepen verdeeld; elk kreeg ofwel 1 ml fysiologische zoutoplossing of 0,5 mg/ml PEG-PCCL via de auriculaire ader. Konijnen werden 24 uur na infusie van nanodeeltjes gedood door een overdosis chloraalhydraat (4%, Sigma, VS). Er werden twee ooradermonsters verkregen, inclusief het gebied 10-15 mm vanaf de kathetertip, zowel proximaal als distaal. Deze aderen werden gefixeerd in een 4% paraformaldehyde-oplossing. Vervolgens werden paraffinedoorsneden gemaakt en gekleurd met hematoxyline en eosine (HE). Histopathologisch onderzoek werd blind uitgevoerd. De bevindingen werden beoordeeld volgens de criteria in de tabel die waren gebaseerd op die van Kuwahara [17] met toevoeging van epidermale degeneratie.

Hepatorenale functietests

Na 7 dagen PEG-PCCL (0,5 ml, 20 mg/kg) toediening aan muizen, werden de bloedmonsters geëxtraheerd uit de orbitale veneuze plexus (2 ml) en onmiddellijk gecentrifugeerd bij 1300 g, 4 °C. Het supernatant werd teruggetrokken. Vervolgens werden de serumbiochemische parameters [26], waaronder aspartaataminotransferase (AST), alanineaminotransferase (ALT), alkalische fosfatase (ALP), bilirubi, creatinine, urinezuur en albumine geëvalueerd met behulp van een biochemische automatische analyser voor dieren (Dri-Chem 3000 , Fuji Photo, Tokyo, Japan), die indirecte indicatoren zijn voor de lever- en nierfunctie.

Histopathologisch onderzoek

De histopathologische veranderingen van de longen, lever en nieren werden onderzocht met H&E-kleuring 24 uur, 48 uur en 7 dagen na injectie van PEG-PCCL, PEI-oplossing of normale zoutoplossing (0,5 ml, 20 mg/kg) via muizen staart ader. Deze organen werden verkregen na het offeren van dieren. Histopathologiesectie en H &E-kleuring werden uitgevoerd zoals elders beschreven [26]. De histopathologische veranderingen werden waargenomen onder een lichtmicroscoop en werden vastgelegd met diverse camera's (Leica, Co. Ltd., Duitsland).

Bloedconcentratie

Bloedconcentratie van PTX werd berekend met behulp van spectrofotometer (LAMBDA 950, PerkinElmer, China). Bloedmonsters werden getrokken uit de baan van muizen op 0,08, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 6, 12, 24 uur na de behandeling. Supernatant (100 L) werd verzameld na 10 minuten gecentrifugeerd bij 1300 g. De PTX-concentratie in elk bloedmonster werd bepaald met een spectrofotometer bij 760 nm.

Muistumormodellen en behandeling

H22-celsuspensie (0,25 ml, 4 × 10 ⁶ cellen/muis) werd op dag 0 intraperitoneaal in Balb/C-muizen geïnjecteerd. Toen de ascites zich vormde (op dag 3-5), werden tumordragende muizen willekeurig in drie groepen verdeeld (n = 5) en de behandeling werd gestart. De muizen werden op dag 3 en 10 intraperitoneaal geïnjecteerd met normale zoutoplossing, PEG-PCCL/PTX (20 mg/kg) of PTX (10 mg/kg) met een volume van 0,5 ml om de werkzaamheid tegen tumoren te evalueren. De buikomtrek (AP) werd elke dag gemeten om het verhoogde percentage AP (IPAP) te berekenen als de volgende formulering:IPAP = (P _n − P ₀ )/P _n . Op dag 10 werden de overlevende muizen opgeofferd door cervicale dislocatie en werden de ascites verzameld en gewogen. De overlevingstijd van muizen werd waargenomen tot dag 20. Tumordragende muizen werden geëxecuteerd op het eindpunt met tekenen van angst, waaronder een hoge ademhalingsfrequentie, ruige vacht, gebogen houding, verminderde activiteit en progressieve vorming van ascites [27]. De antitumoractiviteit werd uitgebreid geëvalueerd door overlevingsdagen, buikomtrek en het volume van ascites. De muizen werden gevoerd onder standaard laboratoriumomstandigheden.

Statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met SPSS 19.0 (IBM, NY, VS). Elke experimentele behandeling werd minstens drie keer onafhankelijk herhaald. Gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde   ±   standaarddeviatie (SD). Variantieanalyse (ANOVA) werd gebruikt voor statistische analyse. De graad van elke flebitisbevinding werd geanalyseerd met de Wilcoxon-rangsomtest. De test van Dunnett werd gebruikt om de individuele interventies te vergelijken. Statistische significantie werd aangegeven bij P < 0.05.

Resultaten

Morfologie, diameter en zeta-potentieel van PEG-PCCL

De resultaten van de laserdeeltjesgrootte-analysator toonden aan dat de gemiddelde diameter van PEG-PCCL 97 ± 2.6 nm was. De TEM-resultaten van PEG-PCCL (Fig. 2) onthulden dat PEG-PCCL bolvormige vormen had en uniform was in de oplossing. De gemiddelde zeta-potentiaal van PEG-PCCL was -18,4 mV. De centrifugatiemethode met minikolommen toonde aan dat het EE% 55,98% was.

Het kenmerk van PEG-PCCL:TEM-beeld. Schaalbalken waren 100 nm

Cytotoxiciteit

De cytotoxiciteit van PEG-PCCL werd geëvalueerd door vergelijking met PEI, een typisch vehikel op nanoschaal, in HEK293T- en Hep-G2-cellijnen. Binnen het concentratiebereik (van 0 tot 1 mg/ml) van PEG-PCCL of PEI daalde de levensvatbaarheid van zowel HEK293T-cellen (Fig. 3a) als tumorcellen (Hep-G2) (Fig. 3b) in een concentratieafhankelijke wijze. De embryonale cellen leken gevoeliger bij een concentratie van 0,25 mg/ml, terwijl tumorcellen hoger dan 1 mg/ml. Vergeleken met PEI vertoonde PEG-PCCL minder cytotoxiciteit, vooral bij hogere concentraties, d.w.z. 0,75 en 1 mg/ml (P = 0,023). LDH-assay toonde aan dat het sterftecijfer in zowel embryonale cellen als tumorcellen toenam met de blootstellingstijd; (i) het was 19 en 42% na respectievelijk 24 en 48 uur bij 0,5 mg/ml PEG-PCCL (Fig. 3c) minder dan die van PEI. (ii) Tumorcellen vertoonden een iets lager sterftecijfer (32%) op het moment van 48 uur wanneer cellen werden blootgesteld aan PEG-PCCL in vergelijking met PEI (P = 0.037) (Fig. 3d).

De cytotoxiciteit van PEG-PCCL vergeleken met PEI. een , b MTT-assay toonde het overlevingspercentage van 293 T- en HepG2-concentratie afhankelijk in vergelijking met negatief gecontroleerde groep (PEI). c , d LDH-lektest van 293 T en HepG2 blootstelling aan PEG-PCCL en PEI na 48 uur. *P < 0.05 versus PEI-groep

SEM

De elektronenmicroscopische beelden van intacte Hep-G2-cellen en cellen behandeld met PEG-PCCL-nanodeeltjes werden getoond in Fig. 4. In intacte Hep-G2-cellen waren er overvloedige microvilli (Mv) op elk oppervlak en de kern (N) was meer in de richting van de bases dan het apicale gedeelte. Talrijke mitochondriën (Mt), Golgi-complex (Go) en ruw endoplasmatisch reticulum (RER) werden in het cytoplasma verdeeld. In met PEG-PCCL behandelde cellen waren de pinocytotische blaasjes duidelijk verhoogd. Er werden geen significante histopathologische veranderingen waargenomen en ronde N en cytoplasmatische organellen, waaronder Mt, RER en Go waren intact.

Elektronen microfoto's. een , b Normale HepG2-cellen. c , d Cellen behandeld met PEG-PCCL-nanodeeltjes via SEM (scanning-elektronenmicroscoop). De donkere pijl wijst naar de pinocytotische blaasjes

Apoptose

Aanzienlijke afname van de levensvatbaarheid van cellen kan worden gecorreleerd aan de kenmerken van deeltjesgrootte, oppervlaktechemie en concentratie [28], wat onze interesse opwekte in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de waargenomen celdood in HepG2-cellen. Om te bepalen of de celdood werd toegeschreven aan apoptose of necrose, werden HepG2-cellen behandeld met PEI of PEG-PCCL voor annexine V en PI co-kleuring. Zoals waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop (Fig. 5), vertoonden de cellen behandeld met PEI of PEG-PCCL eerdere apoptose vergeleken met de blanco controlegroep, zoals aangegeven door groene fluorescentie gekleurd door annexine V. PEI-behandelde cellen vertoonden krachtiger apoptose dan die van PEG-PCCL, wat in lijn was met het eerdere resultaat van de MTT-assay.

FITC-Annexine V-kleuring vertegenwoordigde celapoptose. HepG2-cellen die 48 uur waren geïncubeerd met nanodeeltjes in een concentratie van 0,5 mg/ml en vervolgens samen gekleurd met propidiumjodide (rood) en annexine V (groen) werden afgebeeld bij × 40

Biocompatibiliteit

Hemolyse

Omdat biocompatibele nanodeeltjes zijn ontworpen voor endovasculaire toepassingen, is onderzoek naar hemocompatibiliteit en endotheliale cytotoxiciteit vereist. In vitro-test toonde aan dat tijdens de observatie van 3 uur de hemolyse met de tijd toenam, waarbij PEG-PCCL een lagere hemolyseverhouding vertoonde dan normale zoutoplossing (figuur 6a). De in vivo test onthulde dezelfde tendens. Daarentegen veroorzaakte PEI ernstige hemolyse, zowel in vitro als in vivo (Fig. 6b).

Hemolyseverhouding en celgetal (× 10 ⁹ /L) bloedmonster in 3 uur. In vitro (een ) in vivo (b ) *P < 0,05 versus negatieve controlegroep

Konijnenflebitis

Het histopathologische onderzoek (Fig. 7) illustreerde intact vasculair endotheel zonder chondrocytnecrose in het oorkraakbeen. Er werd weinig oedeem van het proximale deel van de ader waargenomen. Met betrekking tot het verlies van veneuze endotheelcellen en infiltratie van ontstekingscellen, had co-infusie (tabel 1) van groepen behandeld met PEG-PCCL na 12 en 24 uur de neiging toe te nemen, maar de verbetering was niet statistisch significant ( P> 0.05).

Microfoto's van de oorader na infusie van 24 uur gekleurd door H&E. een , b Groep van infusie met normale zoutoplossing. c , d Groep van infusie met PEG-PCCL. De naalden vertegenwoordigen het oorkraakbeen. (Linker afbeelding × 10, rechter afbeelding × 40)

Organentoxiciteit

Om de acute toxiciteit van PEG-PCCL in belangrijke organen te evalueren, werd histopathologisch onderzoek in de longen, lever en nieren uitgevoerd na intraveneuze toediening van PEG-PCCL met 0,5 mg/ml gedurende 3 dagen bij muizen (n = 5). Normale zoutoplossing en PEI werden als controles gebruikt. De resultaten toonden aan dat PEI een lichte ontsteking en lobulaire interstitiumdikte en hepatocytkaryopyknosis veroorzaakte (Fig. 8). Hoewel, vergeleken met de normale zoutoplossinggroep, er geen duidelijke histopathologische veranderingen werden waargenomen in alle onderzochte organen in de met PEG-PCCL behandelde groep (Fig. 7); hepatorenale functie werd onderzocht voor verdere bevestiging van de niet-toxiciteit (tabel 2).

De H&E verft lichtmicroscopische beelden van de longen, lever en nieren. De beelden worden verzameld van muizen die intraveneus zijn toegediend met NS, PEI en PEG-PCCL. De naalden vertegenwoordigen de karyopyknosis van hepatocyten. (Afbeeldingen van linkerkolommen, × 10; afbeeldingen van rechterkolommen × 40)

Farmacokinetische studie

Farmacokinetische studie werd uitgevoerd na intraveneuze injectie van 10 mg/kg PTX Taxol® of 20 mg/kg PEG-PCCL/PTX (PP + PTX) (50% laadratio). De piek van de plasmaconcentratie (Cmax) was 312 ± 2,59 g/ml (PTX) en 283  ±  2,79 g/Ml (PP + PTX). De tijd van maximale concentratie (Tmax) en het gebied onder de plasmaconcentratie-tijdcurve waren 0,54 ± 0,20 uur, 52,00 ± 4,30 μg h/ml en 4 ± 1,22 h, 282,21 ± 21,08 μg h/ml voor PTX en PTX-NP's , respectievelijk. De bloedconcentratie-tijdcurve is weergegeven in Fig. 9.

De bloedconcentratie-tijdcurve. Bij muizen na intraveneuze toediening van PTX of PP + PTX. (n = 6)

Effect van PEG-PCCL/PTX op tumordragende muizen

Om het antitumoreffect van PEG-PCCL / PTX in vivo te onderzoeken, werd (i) het verhoogde percentage van de buikomtrek (IPAP) van H22-tumordragende muizen dagelijks berekend (Fig. 10a). Op dag 3 begonnen de ascites zich te vormen en de IPAP van elke groep was dramatisch verhoogd, waarbij de PP/PTX-groep en de PTX-groep, vergeleken met de NS-groep, in de loop van de tijd een langzamere toename vertoonden. (ii) Ascites werd verzameld op dag 10 en het volume werd gemeten (Fig. 10b). Vergeleken met de NS-groep was het volume van ascites van zowel de PTX-groep als de PP/PTX-groep significant verminderd (P = 0,0005 en P = 0,0052), waarbij de PP/PTX-groep een lager volume vertoonde dan de PTX-groep (P = 0,0138). (iii) de overleving van elke groep werd gedurende 20 dagen vanaf dag 0 waargenomen. De PP/PTX-groep en de PTX-groep hadden een langere levensduur en een hoger overlevingspercentage dan de NS-groep.

Het antitumoreffect van PP/PTX in H22-tumordragende muizen. een Balb/C-muizen (n = 5) werden op dag 3 intraperitoneaal geïnjecteerd met PP/PTX of PTX. b Ascites van elke groep (n = 5) werden verzameld op dag 10. c Het voortbestaan ​​van elke groep (n = 10) werd dagelijks waargenomen. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001

Discussie

Van veel polymeren, waaronder PEI, is gesuggereerd dat ze dragers zijn van chemische en biofarmaceutische geneesmiddelen voor een geschikte conjugatie. PEI is een veel onderzocht kationisch polymeer en wordt beschouwd als de gouden standaard in testen met betrekking tot transfectie-efficiëntie [29]. De bijwerkingen (bijv. cytotoxiciteit) belemmeren echter de toepassing van PEI bij medisch gebruik. Om te zoeken naar een veiliger en effectief op nano gebaseerd materiaal, hebben we met succes een nieuwe kandidaat voor medicijnafgifte voorbereid; PEG-PCCL wordt gekenmerkt door een hoge hydrofiliciteit en gunstige stabiliteit door het effect van de waterstofbinding. Het belangrijkste doel van de studie was om de in vivo en in vitro toxiciteit van PEG-PCCL te beoordelen, wat een potentieel therapeutisch venster opent voor de behandeling van kanker.

Omdat een verbeterde permeabiliteit en retentie-effect wordt beschouwd als tumorselectieve afgiftemechanismen, is er veel aandacht besteed aan de geneesmiddelen van nanoformaat [30, 31]. De nanodeeltjes met een kleinere diameter hebben een betere immunocompatibiliteit [32] en minder opname door de lever, een langere bloedcirculatietijd en een hogere biologische beschikbaarheid [33]. en uit het tumorbloedvat en het immuunsysteem van de gastheer ontwijken, terwijl de kationische polymeren met het positieve zeta-potentieel toxisch waren [34]. Deze toxiciteit van PEG-PCCL met negatief zeta-potentieel zou idealiter vermeden moeten worden. In de toxiciteitsbeoordelingen in de huidige studie waren er inderdaad weinig toxiciteitsproblemen met PEG-PCCL. Vergelijkbare resultaten werden ook gerapporteerd door een ander laboratorium [35,36,37].

De in vitro experimenten onthulden een toxiciteitsvrije eigenschap voor PEG-PCCL. Zoals waargenomen onder SEM (Fig. 4), (i) pinocytotische blaasjes herkend door een donkere pijl gaven een aansprakelijke endocytose [38] aan. (ii) Volledige kern en intacte organellen (Mt, RER en Go) vertoonden weinig cytotoxiciteit en goede biocompatibiliteit van PEG-PCCL op cellulair niveau. In de MTT-test en LDH-lektest (Fig. 3) leidden PEI en PEG-PCCL tot een vergelijkbare trend van cellevensvatbaarheid op een dosis- en tijdsafhankelijke manier in zowel 293 T-cellen als HepG2-cellen, PEG-PCCL vertoonde echter lagere cytotoxiciteit vooral bij een hogere concentratie (P < 0.05). Deze resultaten suggereerden dat de covalente binding van carboxyl de extra toxiciteit niet verhoogt. In vitro hemolyse wordt algemeen aanvaard als een bruikbare en betrouwbare methode om de compatibiliteit van NP-bloed te evalueren. In in vitro hemolysetest vertoonde PEG-PCCL een lagere hemolyseverhouding dan normale zoutoplossing (figuur 6a). Dit kan te wijten zijn aan het negatieve potentieel van PEG-PCCL dat de bloedcellen beschermt. De in vivo hemolysetest onthulde een vergelijkbare tendens. Daarentegen vertoonde PEI ernstige hemolyse. Collectively, PEG-PCCL nanoparticles are hemocompatible as they did not exhibit any hemolytic effect neither in vitro nor in vivo model (Fig. 6b).

The innoxious nature of PEG-PCCL was further proved by in vivo experiments. Since phlebitis induced by intravenously administered antineoplastic agents [24] is frequently seen in clinical practice, we tested the inflammatory reaction after PEG-PCCL injection. In the rabbit phlebitis study (Fig. 7), little inflammatory infiltration or tissue edema was observed, indicating that the new formulation of chemotherapeutic drugs captured by PEG-PCCL is biocompatible, and that co-infusion of PEG-PCCL could be a favorable candidate as intravenous drug deliverer. Meanwhile, in the H&E staining assay (Fig. 8), no obvious histopathological changes of organs were observed in PEG-PCCL nanoparticles treatment group compared to normal group. Further hepatorenal function was investigated for safety evaluation (Table 2), in which no significant differences were shown between normal saline group and PEG-PCCL group. Consequently, it is evident that PEG-PCCL is a kind of safe and non-toxic nanoparticles with potentiality to be applied in targeting intervention.

Furthermore, preliminary evaluation of drug-loaded effect in regard of pharmacokinetics and anti-tumor was carried out in H22 tumor-bearing mice. In the pharmacokinetic study (Fig. 9), Tmax of PP + PTX was 4 ± 1.22 h, which exhibited better persistence than that of PTX (0.54 ± 0.20 h). PP + PTX also performed larger area under the plasma concentration-time curve than PTX. These results showed that PEG-PCCL/PTX lasted longer than PTX alone in blood, which indicated higher stability and more delayed release of PEG-PCCL/PTX. However, the EE% of PEG-PCCL was dissatisfactory (55.98%) and sustained drug release was less than ideal (4 ± 1.22 h). Therefore, more research is needed to modify the nanoparticle to achieve a higher EE and longer drug release. For example, adjusting the proportion of PEG and PCCL can be considered [39]. Although no metastasis was seen in abdominal organs in our model, tissue distribution and concentration of PTX-NPs should be investigated in further study to find out the possible side effects. Moreover, the combination of PEG-PCCL and PTX made an improvement in life expectancy and a reduction in tumor ascites formation (Fig. 10). Notably, the anti-tumor effect was enhanced when PTX was loaded with PEG-PCCL, suggesting a possibility of a promising drug carrier. Besides, nanoparticles may be beneficial to confront anti-tumor drug resistance. Modification with folate [40] has been reported to overcome TLR4 driven chemotherapy resistance, and its co-encapsulation of anti-tumor agents [41] could be a promising option. Nanoparticle modified by additional Fe₃ O₄ [42] may be more easily guided to its targets under the applied magnetic field, which would lower chemotherapeutic drugs-induced systemic toxicity [43].

Conclusions

PEG-PCCL nanospheres showed less cytotoxicity and better biocompatibility than mature medical nanoparticles (PEI) at the therapeutical concentration. PEG-PCCL-loaded PTX revealed higher stability and slower release in tumor mice. These results suggest that PEG-PCCL is a potential candidate of biocompatible drug vehicle for hydrophobic drugs.