Groeiende gouden nanostructuren voor vormselectieve cellulaire opname

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering van anisotrope Au NS's

Anisotrope Au NS's werden gesynthetiseerd via een zaadgemedieerde groeibenadering waarbij gebruik werd gemaakt van binaire mengsels van oppervlakteactieve stoffen. Toen CTAB-afgetopte Au-zaden (~ -5 nm) werden toegevoegd aan de groeioplossing van binaire mengsels van oppervlakteactieve stoffen (molverhouding van OA CTAB ~ 20:1), vormden Au NR's met een lage aspectverhouding (Fig. 2a en Tabel 2). HRTEM-afbeelding onthulde de enkelvoudige kristallijne en hondenbotmorfologie van NR's (inzet in figuur 2a). OA, een vetzuur dat ook werkt als een zwak reductiemiddel, vergemakkelijkt de reductie van Au ³⁺ tot Au ⁺ . De verandering in de kleur van de groeioplossing van geel naar transparant (~  15 min) bevestigde onze waarneming. Verdere toevoeging van ascorbinezuur aan de groeioplossing verhoogt de reductiesnelheid van Au ⁺ . Dientengevolge diffunderen Au-atomen snel op uiteinde {111} [16] facetten van de NR's omdat de pakking van gemengde micelstructuren minder dicht is in vergelijking met de zijkant {110} en uiteinde {100} van de NR's [25]. Daarom leidt de overgroei van NR's aan het einde van {111} facetten dan aan de zijkant {110} en {100} facetten tot de vorming van NR's van hondenbotmorfologie. Onze resultaten suggereren ook dat het onwaarschijnlijk is dat {110} facetten gecoat zijn met Au vanwege de sterke interactie van deze facetten met oppervlakteactieve moleculen in vergelijking met andere facetten. We bevestigden ook de rol van OA en ascorbinezuur bij de vorming van Au NR's van hondenbotmorfologie. Wanneer de concentratie van OA of ascorbinezuur in de groeioplossing werd verlaagd, werden alleen Au NR's verkregen. Deze resultaten duiden op de afname van de reductiesnelheid en diffusiesnelheid van goudatomen, wat leidt tot de vorming van Au NR's (aanvullend bestand 1:Afbeelding S1, ESI†).

STEM-beelden en UV-Vis-spectra van Au NS s van verschillende vormen. een BF-STEM-afbeelding van Au NR's van hondenbotmorfologie en HRTEM-afbeelding in inzet toont de enkelvoudige kristallijne aard van NR's. b BF-STEM-afbeelding van langwerpige tetrahexahedral Au NSs (inzet is SEM-afbeelding). c SEM-afbeelding van Au BP's (inzet is SEM-afbeelding van enkele BP). d TEM-afbeelding van Au-bolvormige deeltjes (HRTEM-afbeelding in inzet toont de polykristallijne aard van Au-deeltjes). e BF-STEM-afbeelding van Au NM's. v UV-vis-spectra van Au NS's met verschillende vormen

Toen de concentratie van OA ten opzichte van CTAB in de groeioplossing werd verhoogd (tabel 1), werden Au NS's met een langwerpige THH-vorm verkregen (figuur 2b en tabel 2). De verandering in de vorm van Au NS's kan worden verklaard op basis van de modificatie van gemengde micelstructuren door OA. De staafvormige gemengde micelstructuren worden gevormd bij een lage concentratie OA. De verhoogde hoeveelheid OA in de gemengde micelstructuren wijzigt de structuur ervan om convex te worden en de vorming van langwerpige THH Au NS's te vergemakkelijken. Onze eerdere studie onthulde ook dat een toename van de concentratie van co-surfactant de gemengde micelstructuren meer convex maakt [25]. De vorm van Au NS's kan ook worden gewijzigd door OA te vervangen door DDAB. We hebben Au NS's met een bipyramid (BP) -vorm verkregen door het gebruik van CTAB en DDAB (Fig. 2c en Tabel 2) zoals gerapporteerd in ons vorige werk [25]. Verder werden bolvormige Au-deeltjes gesynthetiseerd door een aangepaste Turkevich-methode (Fig. 2d).

We hebben ook de invloed van zaadoplossing op de vorm van Au NS's onderzocht. De zaadoplossing werd na 1 minuut van de reactie uit de groeioplossing van CTAB en OA (OA:CTAB ~-20:1) gehaald en toegevoegd aan de verse groeioplossing die OA:CTAB ~20:1 bevat. Au NS's van nanomakura (NM) morfologie werd verkregen na voltooiing van de groeireactie (figuur 2e). De morfologie van NM lijkt op hondenbot. Omdat de NS's echter in alle richtingen groeien, zoals weergegeven in TEM-afbeeldingen die onder verschillende hoeken zijn genomen (Fig. 3a en Tabel 2), noemen we deze NS's daarom NM. Om het groeimechanisme van Au NM's te illustreren, werd met verschillende tijdsintervallen een klein volume uit de groeioplossing genomen en de tussenreactie werd geanalyseerd met behulp van STEM-beeldvorming (figuur 3b). Toen CTAB-gecoate zaaddeeltjes aan de eerste groeioplossing werden toegevoegd, veranderde de kleur van de groeioplossing snel in donkerviolet, wat wijst op de vorming van anisotrope Au NS's. Een 300 μL oplossing van de eerste groeioplossing werd toegevoegd aan de tweede groeioplossing en daarna werden onmiddellijk enkele druppels van de oplossing aan het TEM-raster toegevoegd.

Morfologie en groei van Au NM (nanomakura ). een TEM-beelden van NM genomen onder verschillende hoeken. b BF-STEM-afbeeldingen tonen de groeistappen in de vorming van NM-type Au NS's. De oplossing die op verschillende tijdstippen uit de groeioplossing werd gehaald, werd zonder zuivering rechtstreeks aan het TEM-raster toegevoegd

Representatieve STEM-afbeeldingen vertoonden een relatief snellere groei van Au NM in de lengterichting dan in transversale (0 s). Na 30 s werden NS's gezien die op een vlinderdasconfiguratie leken. NM met uiteindelijke afmetingen werden al waargenomen rond 3 min van de reactie. We zagen geen verdere verandering in de vorm en grootte van NS's na 30 minuten en 8 uur. Op basis van onze analyse kan worden aangenomen dat de algehele groei van Au NM's een stochastisch, "popcorn"-achtig autokatalytisch groeimechanisme volgt, waarbij individuele zaden enige tijd inactief zijn voordat ze plotseling en snel groeien tot de uiteindelijke vormen, zoals heeft waargenomen voor NR's door Cortie et al. [47]. De NM's hebben een driedimensionale structuur, getoond door HRTEM-afbeeldingen van de NM's verkregen onder verschillende rotatiehoeken (figuur 3a) in tegenstelling tot eerder gerapporteerde hondenbotvormige NS's [48, 49].

De optische eigenschappen van de Au NS's van verschillende vormen werden gemeten en de resultaten worden getoond in Fig. 2f. Au NS's geven afstembare LSPR-kenmerken weer over het UV-Vis-zichtbare-nabij-infrarood (IR) bereik. De plasmonbanden splitsen zich op in multiplets voor anisotrope structuren - de longitudinale en transversale banden, als gevolg van resonantie-oscillaties langs verschillende assen. NR's vertonen ten minste drie verschillende banden:-516 nm, 679 nm en 796 nm, waarbij de sterkste de middelste is. De opkomst van een derde band kan worden geassocieerd met de polydispersiteit van de NR's veroorzaakt door het etsende effect van oliezuur. Dit leidt tot de vorming van nanostaafjes met ruwe randen. Zowel transversale als longitudinale resonantiepieken (respectievelijk 557 en 760 nm) worden waargenomen voor NM, dat een meer gekarteld oppervlak heeft dan de nanostaafjes. Voor grotere structuren (THH en BP's) worden echter enkele en brede LSPR-pieken waargenomen bij respectievelijk 568 nm en 593 nm. Hoewel de UV-vis-spectra voor THH een vergelijkbare gelijkenis vertonen met eerdere onderzoeken [50], lijken de twee modi voor BP's te versmelten tot een brede piek, zoals anders wordt waargenomen [51]. Dit kan worden toegeschreven aan een lage opbrengst van de BP-vorm of niet-vormselectieve centrifugatie toegepast op de Au NS of een ongelijkmatige coating die leidt tot vormanisotropie in oplossing.

Oppervlaktefunctionalisering van Au NS's

Au NS's van verschillende vormen werden gefunctionaliseerd met behulp van een tweestapsmethode - waarbij de dubbellaagse CTAB werd vervangen door O-[2-(3-mercaptopropionylamino) ethyl]-O-methylpolyethyleenglycol (PEG-SH) en vervolgens door MUA. Figuur 4a toont de hydrodynamische diameters van de NS's in elke fase van de functionalisering. Een sequentiële toename van de maten wordt verkregen in vergelijking met CTAB-gecoate NS's, voor elke NS (behalve voor BP's) wat wijst op succesvolle functionalisering. Aangezien DLS-metingen zijn gebaseerd op aannames van sferische deeltjes, moet de analyse van de groottebepaling voor de anisotrope NS's worden benaderd met sferische NS's met dezelfde diffusiecoëfficiënten als die van de anisotrope NS's.

Maten en zeta-potentialen van Au NS's. een Variatie van DLS-groottes van de Au NS's na elke fase van functionalisering. b Variatie van zeta-potentialen van Au NS's met elke fase van functionalisering. X -as vertegenwoordigt Au nanostructuur van verschillende vormen (NR nanostaafjes, THH tetrahexahedra, NM nanomakura , BP bipiramide, SP bolvormig)

Dit verduidelijkt een lichte afname in grootte voor PEG-SH-gecoate BP's en ondersteunt ook de bovenstaande UV-vis-gegevens. Als gevolg van de functionalisering nemen de oppervlakteladingen van de NS's enorm af, zoals weergegeven in figuur 4b. De kationische oppervlakteactieve stof wordt gemakkelijk verdrongen door PEG-SH, dat verder wordt vervangen door MUA vanwege een hogere affiniteit voor het Au-oppervlak. Vanwege de kleine omvang van MUA heeft het een hogere flexibiliteit om CTAB te verplaatsen dat op de NS's blijft, zelfs na PEGylatie. De uiteindelijke zeta-potentiaalwaarden van met MUA gecoate NS's weerspiegelen negatief geladen oppervlakken voor alle NS's behalve NR's. Deze discrepantie kan worden gekoppeld aan de ongelijkmatige coating van de kleine NR's of hun polydispersiteit, en het toegepaste meetprincipe. Voor de bolvormige NS's is de aanvankelijke negatieve oppervlaktelading te wijten aan citraatcoating. Hoge magnitudes van de zeta-potentialen voor alle NS's zorgen echter voor de stabiliteit van de NS's in waterige oplossingen. XPS-metingen uitgevoerd op de Au NS's na elke fase van functionalisering, d.w.z. met PEG-SH gevolgd door MUA, tonen een zeer laag broomgehalte op het oppervlak, wat de verwijdering van gebonden CTAB in grote hoeveelheden van de oppervlakken van de NS's bevestigt. (Tabel 1, ESI).

Verder verandert een coating van de NS's met PEG-SH en MUA hun optische kenmerken niet dramatisch. Sequentiële piekverbreding wordt echter verkregen na functionalisering voor de anisotrope NS's (aanvullend bestand 1:figuur S3, ESI†). Dit kan zijn vanwege verschillende rotatie-assen van de NS's als gevolg van anisotropie, niet-uniforme coating, vergroting van de grootte (DLS-gegevens), een polydispersiteit van de monsters of een combinatie van het bovenstaande. Omdat de optische eigenschappen van Au NS's afhankelijk zijn van vorm, oppervlak, grootte en aggregatietoestand, geldt dit ook voor hun interacties met cellen. Celinteractiestudies kunnen onthullen in welke mate Au NS's worden opgenomen, hun cytotoxische effecten, en kunnen wijzen op toekomstige therapeutische en diagnostische toepassingen.

Cellulaire interactie van Au NS's met verschillende vormen

Over het algemeen komen Au NS's de cel binnen via endocytose, die receptor-gemedieerd of receptor-onafhankelijk kan zijn, via actine-afhankelijke fagocytose, of via andere momenteel onbekende endocytische routes [52]. Het is van cruciaal belang om te beschrijven welke route de NS neemt, omdat deze uiteindelijk het intracellulaire lot van de NS bepaalt [53]. Studies hebben aangetoond dat het mechanisme van intracellulaire opname afhangt van de fysisch-chemische eigenschappen, AR, en de oppervlakte-eigenschappen van de NS, evenals het celtype [54,55,56,57,58]. De lading van de oppervlaktestabiliserende moleculen zal in feite de lading van de NS zijn [59]. Positief geladen NS's hebben een sterke eiwitadsorptie in biologische media en kunnen de membranen van cellen ernstig beschadigen. Hierdoor heeft een neutrale of negatieve lading de voorkeur om sterke adsorptie op celmembranen en/of eiwitadsorptie te vermijden [26, 60]. Verder zal de vorm van NS's bepalen in hoeverre de oppervlaktedekking van stabiliserende moleculen uniform is of niet [61].

Hier werden alle Au NS's, behalve de bolvormige NS's, gesynthetiseerd met de oppervlakteactieve stof CTAB. Au NS's werden gefunctionaliseerd met MUA om een ​​negatief geladen oppervlak te krijgen voorafgaand aan de celinteractiestudies. Stabiele MUA-gecoate Au NS's werden vervolgens gedurende 24 uur co-geïncubeerd met menselijke glioblastoma-astrocytoomcellen, en het effect van vorm en concentratie op cytotoxiciteit werd beoordeeld met een LIVE/DEAD®-assay, aangevuld met een nucleaire kleuring om intracellulaire Au NS te benadrukken .

De hoogste celdood werd waargenomen met de NM in hoge concentratie (figuur 5a), met een celdood van bijna 20% na blanco-correctie. De andere NS's vertoonden niet dezelfde trend in cytotoxiciteit, wat erop zou kunnen wijzen dat NM's met een hogere snelheid/volume worden opgenomen dan de andere vormen [62]. Het tellen van cellen voor deze vormen vertoonde een cytotoxiciteit van minder dan 5% na blancocorrectie (voor afbeeldingen van alle vormen, zie Aanvullend bestand 1:Afbeelding S4, ESI†).

Effect van Au NS's op glioblastoma-astrocytoomcellen. een Percentage cell death of glioblastoma-astrocytoma cells as a function of concentration of AuNSs. Incubation time was 24 h. Images b –m are acquired after incubation of makura -shaped AuNSs in glioblastoma-astrocytoma cells taken at several time points up to 24 h. b TEM shows an invagination of the cellular membrane (m membrane, scale bar = 1 μm), and c halogen and d fluorescence images show association of makura-shaped AuNSs at the cellular membrane. e Uptake of makura-shaped AuNSs were observed after 6 h (scale bar = 500 nm), f with uptake in intracellular vesicles (v vesicle, scale bar = 2 μm). g Staining of the nucleus (n ) suggests that makura-shaped Au NSs were excluded from the nucleus. u TEM images taken after 12 h suggest uptake via macropinocytosis (scale bar = 500 nm), with i intravesicular location of makura-shaped AuNSs (vm vesicular membrane, scale bar = 500 nm). j Intracellular compartmentalization was also visible from the microscopy. Uptake of makura-shaped AuNSs continued at 24 h as seen in TEM images k (scale bar = 2 μm) and l (scale bar = 5 μm). m Detachment of glioblastoma-astrocytoma cells from the surface was observed, which most likely is an indication of cell death

The data presented here suggest that size plays a minor role in cytotoxicity in glioblastoma-astrocytoma cells. For instance, the small spherical NSs (15 nm) showed the same uptake/cytotoxicity as the large BPs (650/270 nm). Based on previous studies, we expected the NRs to give the highest cytotoxicity, due to their AR and surface charge. Positively charged NSs are considered to be particularly toxic as they can induce apoptosis [63] and cause the production of reactive oxygen species [64]. However, in the data presented here, the positively charged NRs did not show increased cell death compared to any other shape (Fig. 5a). This might be explained as follows:the surface charge of NS was determined with zeta potential measurements, an approach based on spherical particle assumption (Table 2). Thus, the reported charge of the NRs most likely misrepresents their actual charge. Although the AR of the rods synthesized here is large (2.8), their overall size falls in a size range that shows good uptake in cells (20–50 nm). [30, 65] A previous study has suggested that the size of NS does not only seem to govern endocytosis but also exocytosis. For instance, the removal half-life of 14 nm AuNS was much faster than removal half-life of 74 nm AuNS [26]. Here, the smaller Au rods and spheres, may, therefore, have been removed via exocytosis, which may explain their low cytotoxicity.

The main feature of the NM is not their size, but their irregular structure, and it appears from the image in Fig. 5a that shape has been the determining factor for the high uptake. However, an irregular morphology may have undermined the surface coverage of MUA and as such decreased the solution stability of the NM. Also, we cannot exclude that as two-dimensional cell studies are affected by gravity, a low stability in the cell medium increases the likelihood of sedimentation which can propel the endocytosis.

To get further insight into the uptake mechanism and interactions, we followed uptake of NM at high concentration (2 mg mL ⁻¹ ) with light microscopy and TEM for 24 h. The images show that after 2 h of co-incubation, the NM associate with the cellular membrane (Fig. 5c, d) and are engulfed by the cells (Fig. 5b, e). The mechanism of endocytosis seems to be initially receptor-mediated (Fig. 5b) and at later stages through macropinocytosis (Fig. 5h). The latter is believed to occur when large objects enter a cell, and the aggregation of NSs may have induced macropinocytosis. This might mean that the initial solution stability of the Au NM is sufficient, but that with time they aggregate and are taken up as larger species, most likely due to protein adsorption. Uptake of any extracellular NS in an intracellular vesicle involves wrapping of the cell membrane. If many such wrapping events occur, this alters the global elasticity of the cell membrane, which in turn affects the membrane integrity. If many macropinocytosis events occur, the membrane integrity may be severely impaired. This is believed to be one of the effects for the cytotoxicity observed for the NM.

Once inside the cell, it appears that the Au NM align at the periphery of the vesicles, adhering to the vesicular membrane (Fig. 5i). The endosome seems to be trafficked towards the nucleus (Fig. 5f, g, and l), which is consistent with previous studies that show that Au NSs taken up via receptor-mediated endocytosis may eventually end up in the Golgi apparatus [53, 66]. The uptake appears to continue upto 24 h (Fig. 5k), owing to the high concentration gradient of Au NS in the cell culture media [59].

At 24 h with co-incubation, the morphology of the cells changes (Fig. 5m), going from star-shaped to a more rounded shape with less visible filopodia [67], followed by detachment from the surface. Although this study does not go further in the molecular events following uptake of NS, a detachment of filopodia may suggest that NM can interact with the cytoskeleton and cause detachment and apoptosis.

We extended the cytotoxicity assay beyond 24 h and investigated the result of co-incubation at 48 and 72 h, the reason being that few cell studies are performed at these time points [68, 69], and the main argument being that cellular uptake reaches a plateau at 24 h [70]. Our results show (Additional file 1:Figure S5, ESI†) that beyond 24 h, the cells continued to detach from the flask surface, i.e., cell death and uptake continue beyond 24 h. As we cannot exclude that starvation of the cells would have increased the cytotoxicity and detachment, a cytotoxic response is a dynamic process likely to evolve over time differentially.