Thiacalix[4]arenes Verwijdert de remmende effecten van Zn-kationen op de myosine-ATPase-activiteit

Abstract

Talrijke vrouwelijke voortplantingsafwijkingen worden veroorzaakt door aandoeningen van het gladde spierweefsel (myometrium) van de baarmoeder. Zware metalen hebben een nadelig effect op de contractiliteit van de gladde spieren van de baarmoeder. Hoewel zink voor de meeste organismen een essentieel biogeen element is, zijn hoge doses van dit element giftig. De studie van 0,5−5 mM Zn²⁺ effect op myosine S1 ATPase-activiteit uit de baarmoeder bleek dat 5 mM Zn²⁺ kationen hebben het meest uitgesproken remmende effect. De berekening van de kinetische parameters (K _m en V _max , _ATP ) onthulde dat de schijnbare maximale snelheid van de hydrolyse ATP gekatalyseerd door myosine in aanwezigheid van 5 mM Zn²⁺ 1,6 keer gedaald. De waarde van К _m voor ATP-hydrolyse door myosine S1 in aanwezigheid van Zn²⁺ verandert statistisch niet, hoewel het de neiging heeft af te nemen. Er werd vastgesteld dat de activiteit van myosine S1 ATPase in de baarmoeder niet afhangt van de concentratie van Mg²⁺ in aanwezigheid van 5 mM Zn²⁺ . Ook werd aangetoond dat tetrahydroxythiacalix[4]areen-tetrasulfosfonaat (C-798) en tetrahydroxythiacalix[4]areen-tetrafosfonaat (C-800) de myosine S1 ATPase-activiteit herstelden tot het controleniveau in de aanwezigheid van 5 mM Zn²⁺ . Een van de meest waarschijnlijke mechanismen voor het herstellen van de werking van het beschermende effect van deze thiacalix[4]arenen is gebaseerd op het vermogen ervan om zware metaalkationen uit het incubatiemedium te cheleren. De moleculaire koppeling van C-798 en C-800 in het myosine S1-gebied toonde aan dat deze thiacalix[4]arenen een interactie konden aangaan met Zn-kationbinding door myosine-aminozuurresiduen nabij de actieve plaats van ATPase. Daarom kunnen thiacalix[4]arenen de interactie tussen dit kation en myosine S1 verzwakken. Er werd gespeculeerd dat de verkregen resultaten gebruikt zouden kunnen worden voor verder onderzoek met als doel deze thiacalix[4]arenen in te zetten als farmacologische verbindingen in geval van vergiftiging met hoge concentraties zink.

Achtergrond

Het probleem van de vervuiling van het milieu met zware metalen en het zoeken naar manieren om hun impact op levende objecten te verminderen is relevant [1, 2].

Zink is een essentieel biogeen element voor de meeste organismen. [3]. Zinkionen vormen complexen met meerdere eiwitten die vitale metabolische functies uitvoeren. Het zinkion is een bestanddeel van minstens 300 metallo-enzymen die meer dan 50 verschillende biochemische (fysiologische) reacties katalyseren [4, 5].

Zink is echter een zwaar metaal. Het is te vinden in groep IIb van het periodiek systeem der elementen, samen met de twee giftige metalen cadmium en kwik. Niettemin wordt zink als relatief niet-toxisch voor de mens beschouwd [6]. Dit element is alleen schadelijk bij te hoge doses [7].

De orale LD₅₀ voor zink ligt dicht bij 3 g/kg lichaamsgewicht volgens de TOXNET-database van de Amerikaanse National Library of Medicine. Het is meer dan 10 keer hoger dan cadmium en 50 keer hoger dan kwik [6]. De overschrijding van de normale concentratie van dit micro-element bij mensen wordt meestal veroorzaakt door de inname van medicijnen en biologisch actieve additieven die overtollig zink in hun samenstelling bevatten. Het werd geregistreerd als individuele gevallen van intoxicatie met zink als gevolg van het eten van voedsel dat was bewaard in verzinkte of volledig zinken containers. Zinkoxide, chloride en zinksulfaat worden op grote schaal gebruikt in de industrie voor de productie van glas; bij de vervaardiging van kunstmatige vezels, zinkverven, keramiek, lucifers en tandcement; in de pulp- en papierindustrie, voor het conserveren van hout en voor vertinnen en solderen.

Een hoge concentratie zinkinname veranderde de immuunrespons [8]. Volgens sommige epidemiologische onderzoeken kunnen de verhoogde niveaus van Zn, Al, Cu en Fe in de hersenen de ontwikkeling of progressie van de ziekte van Alzheimer vergemakkelijken [9, 10].

Zware metalen kunnen de vrouwelijke voortplanting beïnvloeden in verschillende stadia, zoals het begin van het foetale leven, vroege ontwikkeling en rijping. Kationen van zware metalen kunnen ook de oorzaak zijn van subfertiliteit, onvruchtbaarheid, intra-uteriene groeivertraging, spontane abortussen, misvormingen, geboorteafwijkingen, postnatale sterfte, vroegtijdige veroudering en leer- en gedragsstoornissen [11, 12].

De samentrekkende functie van de baarmoeder is geassocieerd met de activiteit van het eiwitcomplex - actomyosine - waarin myosine enzymactiviteit vertoont, namelijk het vermogen om ATP te hydrolyseren. Myosine ATPase gelokaliseerd in het katalytische domein van het subfragment-1 (S1 of kop) transformeert chemische energie die is afgezet in macro-erge bindingen van ATP in mechanische beweging. Als gevolg hiervan beweegt myosine langs het actinefilament, waardoor de spiersamentrekking ontstaat. Daarom wordt ATP-hydrolyse, gekatalyseerd door myosine, beschouwd als een van de essentiële processen in het moleculaire mechanisme van de myometriale functie [13, 14].

Het myosine-subfragment-1 is een N-terminaal deel van de zware keten van myosine dat uit twee domeinen bestaat:het N-terminale bolvormige motor (katalytische) domein dat de ATP-ase-plaats en de actine-bindingsplaats bevat, en het regulerende domein, of hefboomarm die verantwoordelijk is voor de beweging van myosine langs de actinefilamenten. De kern van het myosine-motordomein wordt gevormd door een centrale, zevenstrengige -sheet die wordt omgeven door α-helices. Een groot structureel domein dat verantwoordelijk is voor zes van de zeven strengen van de centrale β-sheet wordt gewoonlijk het bovenste domein van 50 kDa (U50) genoemd. Een grote spleet scheidt het bovenste 50-kDa-domein van het goed gedefinieerde structurele onderste 50-kDa-domein (L50) dat wordt gevormd door aminozuurresiduen van 465 tot 590. Het actine-bindende gebied en de nucleotide-bindende plaats van myosine bevinden zich op tegenoverliggende zijden van de zevenstrengige β-sheet met de fosfaatgroep van de nucleotide aan de achterkant van de nucleotide-bindende pocket. De P-lus, schakelaar 1 en schakelaar 2 bevinden zich in het bovenste domein van 50 kDa, dicht bij de top van de grote spleet. Alle drie de nucleotide-bindende motieven maken contact met de fosfaatgroep van het nucleotide aan de achterkant van de nucleotide-bindende pocket en werken als γ-fosfaatsensoren [15].

In onze eerdere onderzoeken werd gevonden dat kationen van zware metalen de myosine-ATPase-activiteit van de gladde spier van de baarmoeder remden [16, 17], wat de contractiele eigenschappen van het myometrium negatief kan beïnvloeden.

De nadelige invloed van zware metalen op de contractiliteit van de baarmoeder vereist de ontwikkeling van farmacologische stoffen die deze schadelijke effecten kunnen elimineren.

Calixarenen hebben momenteel de aandacht van onderzoekers getrokken als potentiële kunstmatige effectoren voor verschillende biochemische processen. Deze verbindingen zijn synthetische macrocyclische fenololigomeren die een komvormige structuur hebben. Hun boven- en onderranden kunnen worden gefunctionaliseerd met verschillende chemische substituenten. Calix[4]arenen worden gevormd door vier gefunctionaliseerde areenfragmenten en worden gekenmerkt door een vrij flexibele macrocyclische conformatie. Calix[4]arenes vertoonde een lage toxiciteit van de matrix en het vermogen om in de cellen door te dringen. Daarom worden deze verbindingen beschouwd als veelbelovende middelen voor het ontwikkelen van nieuwe effectieve medicijnen [18, 19].

Een veelbelovende klasse van dergelijke stoffen zijn in water oplosbare thiacalixarenen [18] die de metaalcomplexerende groepen op het macrocyclische moleculaire platform bezitten. De calixarenen zijn vanwege hun vermogen om supramoleculaire complexen te vormen met (bio)metaalkationen ook gebruikt in biomedisch onderzoek als extractiemiddelen van zware metalen [20,21,22].

We hebben eerder aangetoond dat tetrahydroxy-thiacalix[4]areen-tetrasulfonaat (С-798) de remmende effecten van Pb²⁺ elimineerde. , Cd²⁺ , en Ni²⁺ op ATP-hydrolyse gekatalyseerd door myosine S1 uit varkensmyometrium [23].

Deze studie had tot doel het effect te onderzoeken van hoge concentraties zinkkationen en hun gezamenlijke werking met tetrahydroxy-thiacalix[4]areen-tetrasulfonaat (С-798) en tetrahydroxy-thiacalix[4]areen-tetrafosfonaat (C-800) op de myosine S1 ATPase-activiteit vanuit de baarmoeder. Deze studie was nodig om het vermogen van deze thiacalixarenen om de nadelige effecten van hoge concentraties zink op de enzymatische activiteit van de uteriene myosine te elimineren, te testen.

Thiacalix[4]arenen C-798 en C-800 bestaan uit een kom gevormd door vier fenolische fragmenten die aan de bovenrand zijn gemodificeerd met respectievelijk vier anionische sulfonaat- en vier fosfonaatgroepen. Beide thiacalix[4]arenen hebben hydroxylgroepen en tweewaardige zwavelatomen die dicht op de onderrand zijn geplaatst, waardoor ze zware metalen kunnen cheleren met de vorming van stabiele metaalcomplexen [21] (Fig. 1).

De chemische structuur van het tetrahydroxy-thiacalix[4]areen-tetrasulfonaat (C-798) (a ), tetrahydroxy-thiacalix[4]areen-tetrafosfonaat (C-800) (b ), en het schema van het chelerende complex van het thiacalixareen met metaalkation op de onderrand (omgekeerde positie) (c )

Dit werk is het resultaat van een gezamenlijk project, Palladin Institute of Biochemistry en Institute of Organic Chemistry van NAS of Ukraine, gericht op de interactie van myosine-ATPase van myometrium met calix[4]arenen die remmers of activatoren (effectors) zijn van uteriene myosine-ATPase.

Resultaten

Myosine S1 ATPase-activiteit Afhankelijkheid van Zn²⁺ Concentratie

Er werd gevonden dat het meest uitgesproken remmende effect op myosine S1 ATPase-activiteit vanuit de baarmoeder 5 mM (43 ± 8%, M ± SD) was voor Zn-kationen. Het concentratiebereik van Zn²⁺ was 0,5-5 mM in het incubatiemedium (met 3 mM ATP, 5 mM Mg²⁺ , en 0,01 mM Ca²⁺ ). Honderd procent is de waarde van ATPase-activiteit zonder toevoeging van Zn-kationen (controle) (Fig. 2). Zo werden de nadelige effecten van Zn-kationen op de myosine S1 ATP-hydrolyse verder bestudeerd met 5 mM Zn²⁺ .

Myosine S1 ATPase-activiteit van het myometrium in aanwezigheid van 0,5-5,0 mM concentraties van Zn-kationen (M ± SD, n = 6). 100% is de waarde van ATPase-activiteit zonder toevoeging van Zn-kationen

Myosine S1 ATPase-activiteit Afhankelijkheid van aanwezige ATP-concentratie 5 mM Zn²⁺

De Zn²⁺ effect op de affiniteit van de myosine S1 ATPase-activiteit voor zijn substraat (ATP) werd onderzocht. Verhoging van de ATP-concentratie in het incubatiemedium van 0,5 tot 5 mM bij een vast MgCl₂ concentratie (5 mM) zowel in de controle als in aanwezigheid van 5 mM Zn²⁺ resulteerde in een koepelvormige grafiek met een maximale waarde van ATPase-activiteit bij 3 mM ATP. De waarde van enzymatische activiteit bij deze piek in aanwezigheid van zink was 30% lager dan die van de controle (Fig. 3). De grafieken van de afhankelijkheid van de myosine S1 ATPase-activiteit van de ATP-concentratie in de controle en de aanwezigheid van de 5 mM Zn²⁺ in het oplopende deel werden gelineariseerd volgens de Lineweaver-Burk-methode [27]. De berekening van de kinetische parameters namelijk de denkbeeldige constante van Michaelis (K _m ) en maximale snelheid van myosine S1 ATPase voor ATP (V _{max, ATP} ) onthulde dat V _{max, ATP} van de enzymatische activiteit van myosine in aanwezigheid van 5 mM Zn²⁺ 1,6 keer verlaagd (38 ± 7 en 22 ± 6 nmol Pi/min per 1 mg eiwit in de controle en de aanwezigheid van Zn²⁺ respectievelijk, n = 5). De waarde van К _m voor ATP-hydrolyse door myosine verandert S1 statistisch niet, hoewel het de neiging heeft af te nemen (0,49 ± 0,15 mM in de controle, 0,38 ± 0,12 mM in aanwezigheid van Zn²⁺ ; M ± SD; n = 5).

De invloed van 0,5-5 mM ATP op myosine S1 ATPase-activiteit vanuit de baarmoeder in aanwezigheid van 5 mM Zn²⁺ in vergelijking met een controle (M ± SD, n = 5)

Afhankelijkheid van Myosine S1 ATPase-activiteit van Mg²⁺ Concentratie in aanwezigheid 5 mM Zn²⁺

Het effect van 5 mM Zn²⁺ op Mg²⁺ concentratieafhankelijkheid van ATPase-activiteit van uteriene myosine werd bestudeerd. De Mg²⁺ . verhogen concentratie in het incubatiemedium van 0,5 tot 5 mM bij een vaste ATP-concentratie (3 mM) in aanwezigheid van 5 mM Zn²⁺ resulteert niet in een verandering van myosine S1 ATPase-activiteit. Tegelijkertijd is de Mg²⁺ concentratieafhankelijkheid van ATPase-activiteit in de controle (in de standaardomstandigheden) werd gedetecteerd. Het hoogste niveau van myosine-ATP-hydrolyse in de controlegroep werd bereikt bij 3 mM Mg²⁺ (Afb. 4). Daarom is de myosine S1-enzymactiviteit van de baarmoeder niet afhankelijk van de concentratie van Mg²⁺ in aanwezigheid van Zn hoge concentraties (5 mM).

Myosine S1 ATPase-activiteitsafhankelijkheid van Mg²⁺ concentratie in aanwezigheid van 5 mM Zn²⁺ in vergelijking met een controle (M ± SD, n = 6)

Zn-bindende sites in Myosin S1

De computersimulatie laat zien dat Zn-kationen verschillende bindingsgebieden in de myosinekop hebben. Een ervan bevindt zich in het onderste deel van de spleet tussen de bovenste en onderste subdomeinen van 50 kDa, dicht bij de nucleotide-bindingsplaats en direct bij de P-lus. Zn²⁺ is gecoördineerd met de zuurstofatomen Glu177 (bindingslengte 0,23 en 0,39 nm), met het Ser178 zuurstofatoom (bindingslengte 0,31 nm) en Arg236 (bindingslengte 0,32 nm).

Een ander Zn-bindend gebied bevindt zich aan de onderkant van het bovenste subdomein van 50 kDa (Leu218-Asp463, Glu605-Phe621) en dicht bij switch 1 (Gly233-Phe246) en P-loop. Zn²⁺ kan coördineren met het Glu327 zuurstofatoom (bindingslengte 0,21 nm), met een zuurstofatoom Glu326 (bindingslengte van 0,34 nm) en een zuurstofatoom Asp323 (bindingslengte 0,32 nm). Het Zn-kation kan ook interageren met de myosine S1 in het gebied dat contact maakt met schakelaar 2, interagerend met Glu 465 (0,24 nm), Asp468 (bindingslengte 0,31 nm) en Leu653 (bindingslengte 0,37 nm). Dit bindingsgebied bevindt zich in de buurt van de actine-bindingsplaats en de spleet tussen de bovenste en onderste subdomeinen van 50 kDa. De onderkant van deze spleet bevindt zich in de ATP-bindende zak. Deze bindende Zn²⁺ myosine S1-domeinen spelen een essentiële rol bij de binding en hydrolyse van het ATP. Deze regio's ondergaan complexe conformationele transformaties tijdens het overbrengen van energie van de ATP-hydrolyseplaats naar het actine-bindende oppervlak.

Thiacalix[4]arenen elimineren de remmende effecten van Zn²⁺ op de Myosine ATPase-activiteit

Honderd micromolair C-800- of C-798-oplossingen in 50 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,2) werden toegevoegd aan het incubatiemedium met 5 mM Zn-kationen om de negatieve impact van Zn²⁺ te verwijderen op de ATPase-activiteit van myosine S1 van het gladde spierweefsel van de baarmoeder. Als controle werd het gebruikt als enzymatische activiteit zonder toevoeging van zink en/of thiacalix[4]arenen aan het incubatiemedium. Er werd aangetoond (Fig. 5) dat verbinding C-800 de ATPase-activiteit van myosine S1 van het myometrium niet beïnvloedt. Hoewel verbinding C-798 een klein remmend effect heeft op de myosine S1 ATPase-activiteit die hoogstwaarschijnlijk verband houdt met de extractie van een bepaalde hoeveelheid Mg²⁺ [21], essentieel voor ATP-binding in het actieve centrum en de hydrolyse ervan, uit het incubatiemedium. Niettemin verwijderden 100 μM C-798, evenals C-800, de remmende effecten van 5 mM Zn²⁺ over het proces van ATP-hydrolyse gekatalyseerd door myosine S1.

Effect van 100 μM C-798 en C-800 op myosine S1 ATPase-activiteit in aanwezigheid van 5 mM Zn²⁺ (M ± SD, n = 5–6). 100% is de waarde van ATPase-activiteit zonder toevoeging van Zn-kation. Het verschil tussen de "Zn" en "Zn + C-798", evenals tussen de waarden van "Zn" en "Zn + C-800", is statistisch significant (p < 0.05) en weergegeven als respectievelijk * en **

Waarschijnlijke mechanismen van C-798 en C-800 die de werking van de myosine S1 ATPase-activiteit herstellen in aanwezigheid van de Zn²⁺

Een van de meest waarschijnlijke mechanismen van C-798 en C-800 die de werking van de myosine S1 ATPase-activiteit in Zn²⁺ herstellen aanwezigheid kan het vermogen zijn van thiacalix[4]arenen om Zn-kationen te binden en bijgevolg deze kationen uit te sluiten van het incubatiemedium. Het was interessant of deze thiacalix[4]arenen kunnen binden aan zinkkationen die al aan myosine zijn gebonden.

De computersimulatie toonde aan dat thiacalix[4]arenen C-798 en C-800 met zwavelbruggen tussen aromatische ringen zich in de conformatie van "kegel" bevinden, gestabiliseerd door intra-waterstofbindingen tussen de fenolische groepen. De energie-geminimaliseerde structuur van deze calixes[4]arenen werd verkregen. De totale energie van C-798 na de minimalisatie was 64,5 kcal/mol. De aanwezigheid van geïoniseerde groepen op de calix[4]arene-randen (met name de onderste) verhoogt de bijdrage van elektrostatische interacties aan de totale energie van de interactie van de gastheer-gast aanzienlijk. We hebben ook de "minimalisatie" van de C-798 uitgevoerd:Zn²⁺ complex; de totale energie was 83 kcal/mol.

C-798 was ingebed in de structuur van het myosine S1 dat samenwerkte met het Zn-kation dat eerder was gebonden aan het eiwit in het gebied van de lus P. In dit geval Zn²⁺ interageert met de onderste rand zuurstofatomen en overbrugt zwavel van C-798 (O3, 0,21 nm; S1, 0,30 nm; O2, 0,34 nm). Er wordt aangetoond dat Zn²⁺ wijkt enigszins af van de aminozuurresiduen van de P-lus en verzwakt de interactie met het Glu177-zuurstofatoom (0,43 nm bindingslengte) (Fig. 6).

Geometrische parameters van de interactie van Zn²⁺ met het P-lusgebied van myosine S1 (a ) en de invloed van C-798 op de samenwerking van Zn-kation met deze regio (b )

Fixatie van de C-798 in de "holte" van het ATP-bindende gebied van myosine vindt plaats met de deelname van verschillende aminozuurresiduen. In het bijzonder is de hydrofobe mand van thiacalixareen gefixeerd door de myosine aromatische aminozuurresiduen van Phe467 en Phe469; thiacalixareen negatief geladen zuurstofatomen interageren met positief geladen aminozuurresiduen van Arg570, Asn572 en His689.

De studie van de invloed van de C-798 op de verandering van de Zn²⁺ positie tijdens het aanmeren in het gebied nabij de myosine ATP-bindingsplaats toonde aan dat Zn²⁺ in aanwezigheid van thiacalix[4]areen interageert met de zuurstofatomen van de derde sulfonylgroep (O16-0,26 nm; O15-0,27 nm), heeft bijna geen interactie met de zuurstofatomen Asp134 en Glu326, en coördinatie met Glu327 is veel zwakker (0,43 nm koppelingslengte) (Fig. 7). In dit geval wordt thiacalixareen gefixeerd in de "holte" van het eiwit met de deelname van verschillende aminozuurresiduen. Met name negatief geladen zuurstofatomen van thiacalixareensulfonylgroepen interageren met myosine positief geladen aminozuurresiduen van Lys188, Lys195 en Gln221.

Geometrische parameters van de interactie van Zn²⁺ in het gebied nabij de myosineschakelaar 1 en P-lus van myosine S1 (a ) en de invloed van C-798 op de samenwerking van Zn²⁺ met deze regio (b )

Het is aangetoond dat de conditionele energiesfeer van Zn-kation contact maakt met en zelfs enigszins overlapt met het oppervlak van de verspreiding van elektrostatische interacties vanwege de aanwezigheid van zuurstofatomen en zwavelatomen in C-798. Dit geeft aan dat het kation dat wordt bestudeerd in nauw genoeg wisselwerking staat met negatief geladen atomen van de bovenste en onderste C-798-kronen. Het is waarschijnlijk dat thiacalixareen een Zn²⁺ aan zichzelf trekt , waardoor de interactie van kationen met de aminozuurresten van het enzym verzwakt.

Bijgevolg zijn de resultaten van de C-798-docking in de myosine S1-regio, die Zn²⁺ bevat gebonden, wijzen op de mogelijkheid van de interactie van C-798 functionele groepen met Zn-kation. In dit geval was de Zn-kationbinding met de aminozuurresiduen van de myosine S1 significant verzwakt en de afstand tussen hen nam toe. Als gevolg hiervan kan het nadelige effect van Zn-kation op de ATPase-activiteit van myosine worden geëlimineerd.

We hebben ook een computersimulatie uitgevoerd van het effect van calix[4]arene C-800, met docking in het gebied dicht bij het ATP-bindende gebied van S1-myosine, om de geometrie van het kation Zn te veranderen. Tegelijkertijd, Zn²⁺ staat in contact met Arg236 (0,37 nm bindingslengte), Glu675 (0,41 nm bindingslengte) en atomen van de bovenste functionele calix[4]areenresiduen (H26, 2,36 nm; H30, 2,96 nm; C30, 0,31 nm; O5, 3,7 nm; O16, 0,4 nm; O7, 0,48 nm en O11, 0,51 nm bindingslengte). Zn²⁺ interageert met calix[4]areen C-800, vergelijkbaar met C-798. Het kation trekt zich ook terug van de vorige bindingsplaats in dit gebied en staat in contact met Asp468 (0,2 nm bindingslengte) en atomen van de onderste calixareenkroon (C4, 1,96 nm; C14, 2,07 nm; S3, 2,16 nm; O2 , 2,26 nm; C3, 2,97 nm; C20, 3,10 nm; O4, 4,2 nm; C14, 3,0 nm en O3, 4,1 nm).

C-798 en C-800 die aan het myosine-subfragment-1-gebied koppelden, toonden aan dat deze thiacalix[4]arenen een interactie konden aangaan met Zn-kationen die binden aan myosine-aminozuurresiduen nabij de actieve plaats van ATPase. Daarom kan hun beschermende effect het gevolg zijn van de verzwakking van de interactie tussen deze kationen en myosine S1.

Discussie

Myosine in fysiologische omstandigheden is een Mg²⁺ -afhankelijke ATPase. Magnesiumkation is betrokken bij ATP-binding in de actieve plaats van myosine, evenals bij ATP-hydrolyse. De Mg²⁺ is gecoördineerd in de actieve plaats van het enzym met de laterale ketens van de myosine-aminozuurresiduen Thr-186 en Ser-237 evenals β- en γ-fosfaatgroepen van het ATP-molecuul met de vorming van de β- en γ- bidentaatcomplex en met actieve watermoleculen, waarvan er één een nucleofiele aanval uitvoert op γ-fosfaat-ATP [33, 34]. Mg²⁺ interageert met ATP negatief geladen fosforgroepen, polariseert ze en vergemakkelijkt zo een nucleofiele aanval op terminaal γ-fosfaat [14].

Er werd gevonden dat de myosine S1 ATPase-activiteit niet gevoelig is voor de aanwezigheid van Mg²⁺ bij een concentratie van 5 mM Zn²⁺ in tegenstelling tot de controle wanneer zink afwezig was in het incubatiemedium [35, 36].

De myosine-ATPase-activiteit hangt af van de aard van het metaalkation en correleert goed met hun ionische straal. De ionenstralen Mg²⁺ en Zn²⁺ in de oplossingen lijken erg op elkaar (respectievelijk 0,070 en 0,076 nm) [37]. Daarom is de interactie van Zn²⁺ kationen met de Mg²⁺ -bindingsplaatsen van myosine mogelijk. Dus de Mg²⁺ -bindingssites kunnen bezet worden door Zn²⁺ kationen in hoge concentraties. ATPase-activiteit van het myosine S1 kan onder dergelijke omstandigheden ongevoelig zijn voor magnesiumkationen. Myosine bevat twee sites met hoge affiniteit voor Mg²⁺ , en Mg²⁺ gebonden op deze plaatsen speelt een belangrijke fysiologische rol in het energietransductieproces tijdens spiercontractie. Er zijn nog verschillende Mg²⁺ -bindingsplaatsen naast de ATPase-plaats in het myosinemolecuul, die verschillen in de bindingsenergie van magnesiumionen en hun affiniteit [35]. Daarom kan worden aangenomen dat Zn²⁺ kan ook binden aan andere functioneel belangrijke plaatsen van myosine S1 die de binding en hydrolyse van ATP beïnvloeden.

De computersimulatie laat zien dat Zn-kationen verschillende bindingsgebieden hebben in de myosinekop die zich dicht bij de ATP-bindingsplaats bevinden, namelijk P-loop en bovenste en onderste subdomeinen van 50 kDa schakelaar 2. Deze bindende Zn²⁺ myosine S1-domeinen spelen een essentiële rol bij de binding en hydrolyse van het ATP. Deze regio's ondergaan complexe conformationele transformaties tijdens het overbrengen van energie van de ATP-hydrolyseplaats naar het actinebindende oppervlak.

De analyseresultaten verkregen door Zn²⁺ docking in myosine S1 geeft aan dat een sleutelrol in de binding van dit kation aan het myosinemolecuul zijn interactie speelt met negatief geladen groepen van de aminozuurresiduen van het enzym, in het bijzonder Glu en Asp.

De schadelijke invloed van toxische concentraties van Zn²⁺ kationen op de myosine S1 ATPase-activiteit vereist het zoeken naar farmacologische verbindingen die de werking van dit metaal kunnen elimineren. De objecten van onze studie waren tetrahydroxythiacalix [4] areen-tetrasulfonaat (C-798) en tetrahydroxythiacalix [4] areen-tetrafosfonaat (C-800) die in staat zijn om overgangs- en zware metalen te chelateren met de vorming van stabiele metaalcomplexen (Fig. 1). De bovenste macrocyclische kroon van C-798 en C-800 bevat respectievelijk vier anionische sulfonaatgroepen of vier fosfonaten, die zorgen voor een goede oplosbaarheid in water van thiacalixareen en hechting aan eiwitmoleculen dankzij elektrostatische contacten met positief geladen stikstofatomen van aminozuurfragmenten [21] ].

C-798 en C-800 die in het myosine S1-gebied koppelden, toonden aan dat deze thiacalix[4]arenen een interactie konden aangaan met Zn-kationen die binden aan myosine-aminozuurresiduen nabij de actieve plaats van ATPase. Daarom kan hun beschermende effect het gevolg zijn van de verzwakking van de interactie tussen deze kationen en myosine S1. Er werd gespeculeerd dat de verkregen resultaten gebruikt zouden kunnen worden voor verder onderzoek met als doel deze thiacalix[4]arenen in te zetten als farmacologische verbindingen in geval van vergiftiging met hoge concentraties zink.

Conclusies

Hoge concentratie (5 mM) Zn-kation remde myosine S1 ATPase-activiteit uit de baarmoeder. Geremde invloed van Zn is gerelateerd aan een afname van de maximale snelheid van de hydrolyse ATP gekatalyseerd door myosine S1 in aanwezigheid van 5 mM Zn²⁺ . De waarde van К _m voor ATP verandert statistisch niet, hoewel het de neiging heeft af te nemen.

Tetrahydroxythiacalix[4]arene-tetrasulfosfonaat (C-798) en tetrahydroxythiacalix[4]arene-tetrafosfonaat (C-800) herstelden de myosine S1 ATPase-activiteit tot het controleniveau in de aanwezigheid van 5 mM Zn²⁺ .

Zn-kationen hebben verschillende bindingsgebieden in myosine S1 die zich dicht bij de actieve plaats van ATPase bevinden. Het koppelen van C-798 en C-800 in het myosine S1-gebied, dat Zn²⁺ bevat gebonden, geeft de mogelijkheid aan van de interactie van deze thiacalix[4]areen-functionele groepen met gebonden Zn-kationen. De Zn-kationbinding met de aminozuurresten van de myosine S1 was significant verzwakt en de afstand tussen hen nam toe. Als gevolg hiervan kan het nadelige effect van Zn-kation op de ATPase-activiteit van myosine worden geëlimineerd.

Aangenomen wordt dat de verkregen resultaten gebruikt kunnen worden voor verder onderzoek met als doel deze thiacalix[4]arenen in te zetten als farmacologische verbindingen bij vergiftiging met hoge concentraties zink.

Methoden

Reagentia

De volgende reagentia werden gebruikt:serumalbumine, EGTA, EDTA, ATP, ascorbinezuur, Tris, tricine, dithiothreitol, acrylamide, (Sigma, VS), glycine (Merck, Duitsland), N, N′-methyleenbisacrylamide (Acros Organics, België ) N,N,N′,N′-tetramethyleendiamine (Reanal, Hongarije), en reagentia voor binnenlandse productie (R-kwaliteit). De oplossingen werden bereid in water gezuiverd op Crystal Bio system (Adrona, Letland). De watergeleiding was minder dan 0,1 S. De concentratie van de tweewaardige metaalkationen in oplossing werd bepaald met de Mohr-methode.

Actomyosine en Myosine subfragment-1 isolatie

Actomyosine werd geïsoleerd uit de gladde spieren van de baarmoeder van een varken met de gemodificeerde Barany-methode zoals beschreven in [17]. Myosine S1 werd verkregen uit actomyosine van varken met de gemodificeerde Suzuki-methode [24]. The purity of the samples was controlled by PAAG-SDS electrophoresis [25].

ATPase Activity Assay

ATPase activity of myosin S1 was determined in a 96-well plate at 37 °C in an incubation medium (total volume 0.1 ml) of the following composition (mM):Tris-HCl buffer (pH 7.2), 20; KCl, 100; CaCl₂ , 0.01; MgCl₂ , 5; and ATP, 3 (standard conditions). Protein (myosin S1) concentration was 20 μg/ml. Incubation time was 5 min. Samples containing all components of the incubation medium without myosin S1 were taken as control of non-enzyme hydrolysis of ATP. The amount of inorganic phosphate released during ATP hydrolysis reaction was determined by the Chen method [26] by the measurement of optical absorbance of the solution at 820 nm using a microplate reader μQuwant (Biotek^@ Instruments, Inc., USA) and specified as P_i nmol/min per 1 mg of protein.

The Zn²⁺ and thiacalix[4]arene effects on the ATPase activity of myosin S1 were studied using standard incubation medium with solutions of ZnCl₂ and thiacalix[4]arenes at the corresponding concentrations. The value of ATPase activity in the absence of ZnCl₂ and/or calix[4]arenes in the incubation medium was taken as 100% (control).

Kinetic and Statistical Analysis

The values of the imaginary constant of Michaelis (K _m ) and maximal rate of myosin S1 ATPase for ATP (V _{max, ATP} ) were calculated using the graph of the dependence of ATPase activity on the ATP concentration according to Lineweaver–Burk method [27]. Statistical processing of the obtained data was performed using standard methods of variation statistics. Experimental data were analyzed by using the standard software “MS Office” and “Statistica 4.5.” The statistical comparisons were performed using two-way analysis of variances (ANOVA).

Thiacalix[4]Arene Synthesis and Characterization

Tetrahydroxy-thiacalix[4]arene-tetrasulphonate and tetrahydroxy-thiacalix[4]arene-tetraphosphonate were synthesized and characterized using NMR techniques and IR spectroscopy in the Phosphoranes Chemistry Department of the Institute of Organic Chemistry, NAS of Ukraine. Infrared and NMR spectroscopy confirmed the structure of these synthesized thiacalix[4]arenes. This thiacalix[4]arenes were dissolved in water.

Computer Modeling

Computer modeling of the interaction between ligands (thiacalix[4]arenes, Zn²⁺ , model bindings) and receptor (myosin S1) was performed using AutoDock software, version 4.2 [28]. We used the three-dimensional enzyme structure with the 1b7t identifier in RSCB PDB in our research [29]. Computer modeling of the thiacalix[4]arene structural peculiarities was carried out using HyperChem 7.01. Molecular dynamics calculations were performed by the MM2 method with the semi-empirical methods (CNDO).

Program AutoDockTools was used for preliminary “processing” of interacting molecules. One hundred runs of Lamarkian genetic algorithms (population size, 100; the maximal number of energy evaluations, 10⁶ ) were conducted. To analyze and visualize the docking results, we used the programs Chimera [30] and Yassara [31]. Calculation of the minimal total binding energy was implemented considering Van der Waals forces, electrostatic and hydrophobic interactions, and hydrogen bonds. The optimal ligand positions in the complex “receptor-ligand” were determined according to the energy values obtained by docking software calculator for binding energy in complex “receptor-ligand.” Thus, we selected a series of complexes with the lowest total energy and then calculated the optimal geometry of the complexes and determined the most energetically preferred arrangement of the ligands in the space of myosin subfragment-1 binding domain.

Afkortingen

C-798:: Tetrahydroxythiacalix[4]arene-tetrasulfosphonate
C-800:: Tetrahydroxythiacalix[4]arene-tetraphosphonate
CNDO:: Complete Neglect of Differential Overlap (methods)
K _m :: Michaelis constant, the substrate concentration at which the reaction rate of the enzyme is half of the maximal velocity
L50:: Lower 50-kDa domain of myosin
LD₅₀ :: Lethal dose is the amount of an ingested substance that kills 50% of a test sample
MM2:: A class of force fields
Myosin S1:: Myosin subfragment-1
NASU:: National Academy of Science of Ukraine
PDB:: Protein Data Bank
P-loop:: Phosphate-binding loop of myosin
RCSB:: Research Collaboratory for Structural Bioinformatics
U50:: The upper 50-kDa domain of myosin
V _max :: Maximal velocity of the enzyme
V _{max, ATP} :: V _max for ATP

Elektromagnetische veldherverdeling in metalen nanodeeltjes op grafeen Loodrechte magnetische anisotropie en door hydrogenering geïnduceerde magnetische verandering van Ta/Pd/CoFeMnSi/MgO/Pd meerlagen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal