Gefunctionaliseerd nano-adsorbens voor affiniteitsscheiding van eiwitten

Abstract

Thiol-gefunctionaliseerde silica nanosferen (SiO₂ -SH NS's) met een gemiddelde diameter van 460 nm werden gesynthetiseerd via een hydrothermale route. Vervolgens wordt de voorbereide SiO₂ -SH NS's zijn gewijzigd door SnO₂ kwantumdots om SnO₂ . te betalen /SiO₂ samengestelde NS's met duidelijke fluorescentie, die kunnen worden gebruikt om het doeleiwit te traceren. De SnO₂ /SiO₂ NS's werden verder gemodificeerd door gereduceerd glutathion (GSH) om SnO₂ te verkrijgen /SiO₂ -GSH NS's, die specifiek glutathion S . kunnen scheiden -transferase-gelabeld (GST-gelabeld) eiwit. Bovendien is de peroxidase-activiteit van glutathionperoxidase 3 (GPX3) gescheiden van SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's in vitro werden geëvalueerd. De resultaten laten zien dat de voorbereide SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's vertonen verwaarloosbare niet-specifieke adsorptie, hoge concentratie van eiwitbinding (7,4 mg/g) en goede eigenschappen voor hergebruik. In de tussentijd kan de GST-gelabelde GPX3 die door deze NS's wordt gescheiden, zijn redox-toestand en peroxidase-activiteit behouden. Daarom is de voorbereide SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's zouden een veelbelovende toepassing kunnen vinden bij de snelle scheiding en zuivering van GST-gelabelde eiwitten.

Achtergrond

De gemakkelijke scheiding en zuivering van eiwitten is erg belangrijk bij xenobiotische biotransformatie, geneesmiddelmetabolisme, biosynthese van prostaglandinen en steroïde hormonen en afbraak van aromatische aminozuren [1,2,3,4,5,6]. De gescheiden eiwitten kunnen worden gebruikt voor antigeen- en vaccinproductie, moleculaire immunologie en structurele en biochemische en celbiologische studies. Glutathion S -transferase (GST) vertegenwoordigt een belangrijke groep van iso-enzymen voor ontgifting die kunnen worden gebruikt in het GST-genfusiesysteem en het targetingveld van medicijneffecten of als tumormarkers [7, 8]. Verschillende methoden zoals precipitatie, chromatografie, ultrafiltratie en dialyse zijn momenteel beschikbaar voor het zuiveren van verschillende eiwitten, en in het bijzonder is affiniteitsscheiding op basis van de natuurlijke biologische affiniteit tussen biologische macromoleculen en complementaire liganden van buitengewoon belang [9,10,11,12 ,13,14]. De succesvolle productie en zuivering van volledige, oplosbare en natuurlijke fusie-eiwitten worden echter nog steeds vertraagd door verschillende obstakels, zoals de noodzaak van voorbehandeling om celresten en colloïde verontreinigingen te verwijderen, een relatief lange bedrijfstijd en eiwitoplosbaarheid. Deze nadelen kunnen gelukkig worden overwonnen door nanomaterialen toe te passen om de scheiding en zuivering van de doeleiwitten te vergemakkelijken [15,16,17,18,19]. Bijvoorbeeld magnetische SiO₂ -NiO-nanocomposiet is in staat om His-gelabelde eiwitten te scheiden [20]. Nanomaterialen hebben echter nog steeds korte pootjes bij het scheiden van verschillende eiwitten, omdat ze vaak inactief zijn voor visualisatie- en fluorescentietechnieken die kunnen worden gebruikt als gevoelige biomoleculaire en medische diagnostische hulpmiddelen om biologische oorlogsvoering te bestrijden [21,22,23]. In die zin is het absoluut noodzakelijk om nanomaterialen met fluorescerende reacties te vinden om hun toepassing bij de scheiding en zuivering van recombinante eiwitten zoals glutathionperoxidase 3 (GPX3) te bevorderen.

We besteden bijzondere aandacht aan SnO₂ . op nanoschaal kwantumdots (QD's), omdat SnO₂ als een n-type wide-bandgap (3,6 eV) halfgeleider met goede chemische stabiliteit en biocompatibiliteit vertoont optische absorptie in het zichtbare spectrale gebied. Hierin stellen we een slim pad vast om fluorescerende SnO₂ . te introduceren QD's op het oppervlak van silica nanosferen (NS's), in de hoop een gewenste SnO₂ te ontwikkelen /SiO₂ nanostructuur met mogelijke toepassing bij de scheiding en zuivering van GST-gelabelde eiwitten. Ten eerste, thiol-gefunctionaliseerde silica nanobolletjes (SiO₂ -SH NS's) werden bereid via een hydrothermale route. Resulterende SiO₂ -SH NS's werden verergerd met SnO₂ kwantumdots om SiO₂ . te betalen /SnO₂ samengestelde NS's met duidelijke fluorescentie-absorptie. De SiO₂ /SnO₂ NS's werden verder gemodificeerd door gereduceerd glutathion (GSH) om SiO₂ . te verkrijgen /SnO₂ -GSH NS's met potentieel voor de affiniteitsscheiding van GST-gelabeld eiwit. Het vermogen en de peroxidase-activiteit van het bereide SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's bij het scheiden van GST-gelabelde eiwitten werden geëvalueerd door SDS-PAGE-analyse.

Experimenteel

Materiaal en methoden

Hexadecyltrimethylammoniumbromide (CTAB), tin (IV)chloride (SnCl₄ ), triethylamine (TEA) en isopropanol werden geleverd door Tianjin Kermel Chemicals Reagent Company (Tianjin, China). AgNO₃ werd gekocht van Tianjin Fuchen Technology Development Co., Ltd. (Tianjin, China). 3-Mercaptopropyl-trimethoxysilaan (MPS) werd aangeboden door Alfa-Aesar (Shanghai, China). Tetraethylorthosilicaat (TEOS) werd geleverd door Tianjin Fuchen Chemicals (Tianjin, China). Dihydronicotinamide-adenine-dinuclectidefosfaat (NADPH), thioredoxine en thioredoxine-reductase werden verkregen van Sigma (Beijing, China). Glutathion Sepharose 4B (Stockholm, VS) was van GE Healthcare. Dithiothreitol (DTT) was verkrijgbaar bij Aladdin Industrial Corporation (Inalco SPA, Italië). Alle chemische reagentia waren van analytische reagens en werden zonder verdere zuivering gebruikt.

Voorbereiding van SnO₂ Kwantumstippen

In een typische synthese [24], 3,5 g SnCl₄ ·5H₂ O is toegevoegd aan 50 ml H₂ 0, vervolgens werd 5 ml ammoniak onder roeren aan de oplossing toegevoegd. Vervolgens werd het door centrifugeren verkregen neerslag meerdere keren gewassen met gedeïoniseerd water om het overtollige Cl⁻ te verwijderen. ionen. Dertig milliliter gedeïoniseerd water werd aan het verkregen neerslag toegevoegd en vervolgens werd de pH van de oplossing met 2 mol/L ammoniak op 12 ingesteld. De gemengde oplossing werd overgebracht naar een met Teflon beklede roestvrijstalen autoclaaf, afgesloten en 24 uur verwarmd op 150°C. Na voltooiing van het verwarmen werd de gemengde oplossing afgekoeld, gecentrifugeerd en volledig gewassen met ethanol-isopropanol (volumeverhouding 1:1) om SnO₂ te verkrijgen. QD's.

Voorbereiding van SnO₂ /SiO₂ -SH NS's

In een typische synthese, 0,2 g SnO₂ QD's en 0,09 g CTAB werden opgelost in het gemengde oplosmiddel van H₂ O (42,5 ml) en absolute alcohol (7 ml) onder magnetisch roeren (200 G, r = 180 mm). Aan de resulterende oplossing werd onder nog eens 20 min roeren 2,7 ml TEA toegevoegd. De gemengde oplossing werd gedurende 5 uur op 60 °C verwarmd, terwijl 3,5 ml TEOS en 0,35 ml MPS langzaam werden gedruppeld, gevolgd door centrifugeren (12.800 G, r = 180 mm) en volledig wassen met HCl-ethanol (30 ml) en water (30 ml) om SnO₂ te verkrijgen /SiO₂ -SH NS's voor drie keer, die werd gedispergeerd in water (0,12 g/ml).

Oppervlaktemodificatie van SnO₂ /SiO₂ -SH NS's

Vier milliliter van 0,12 g/ml SnO₂ /SiO₂ -SH NS's werden drie keer gewassen met PBS (0,01 mol / L, pH =-7,4). Deze SnO₂ /SiO₂ -SH NS's werden toegevoegd aan 30 ml 16,7 mg/ml GSH-oplossing en geoscilleerd bij 37 °C gedurende 24 uur (120 omw/min) met een constante temperatuuroscillator. Aan het einde van de oscillatie werd de gemengde oplossing gecentrifugeerd om SnO₂ . te verkrijgen /SiO₂ -GSH NS's; vervolgens werd het neerslag driemaal volledig gewassen met 30 ml PBS (0,01 mol/L, pH = 7.4) om overmatig GSH te verwijderen via fysieke adsorptie, waardoor het gewenste SnO₂ werd verkregen. /SiO₂ -GSH NS'en. De resulterende SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's werden toegevoegd aan alcohol (25%, v /v ) en bewaard bij 4 °C.

Scheiding van GST-gelabelde eiwitten

De gemengde eiwitten werden verzameld uit het cellysaat van Escherichia coli , namelijk door lysis van water (concentratie 0,01 mol/L, pH 7,4). Voor in vitro eiwitexpressie, het eiwitgebied dat de coderende sequentie van glutathionperoxidase 3 (GPX3, aminozuren 37–206), open huidmondjes 1 (OST1) en ABA ongevoelig 2 (ABI2, aminozuren 100–423) bevat in Arabidopsis thaliana werd gekloneerd en in frame ingevoegd in het plasmide pGEX-6pl (GPX3 werd gebruikt als controle). pGEX-GPX3-, pGEX-OST1- en pGEX-ABI2-constructen werden geïntroduceerd in E. coli BL21 (DE3)-cellen. De recombinante GST-gelabelde eiwitten werden gezuiverd met behulp van Glutathion Sepharose 4B en SnO₂ /SiO₂ -GSH NS'en. De primers die werden gebruikt voor het klonen van de genen waren als volgt:voor GPX3, forward primer, 5'-GATGGATCCTCGCCATCGACGGTGGAACAA-3'; reverse primer, 5'-CACCTCGAGTCAAGCAGATGCCAATAGCTT-3'; voor OST1, voorwaartse primer, 5'-GCCGAATTCATGGATCGACCAGCAGTGA-3'; reverse primer, 5'-CCCGTCGACTCACATTGCGTACACAATC-3'; voor ABI2, voorwaartse primer, 5'-GCGGAATTCGAGAGTAGAAGTCTGTTTG-3'; reverse primer, 5′- GCGCTCGAGTCAATTCAAGGATTTGCTC-3′.

Na te zijn gewassen met PBS-oplossing (0,01 mol/L, pH = 7.4), wordt de bereide SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's werden rechtstreeks geïntroduceerd in 1000 μL E. coli lysaat en geschud bij 4 °C gedurende 2 uur (rotatiesnelheid:90 omw/min) om de SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's om GST-gelabelde eiwitten te vangen. Na voltooiing van het schudden werden deze NS's door centrifugatie uit de oplossing geïsoleerd en volledig gewassen met PBS-oplossing om alle resterende niet-gevangen eiwitten te verwijderen. De GST-gelabelde eiwitgebonden SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's werden drie keer gewassen met 300 μL en 0, 5 mol / L GSH-oplossing om GST-gelabelde eiwitten van hun oppervlak te scheiden. Afzonderlijk verzamelde eiwitoplossingen werden gedetecteerd door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE). De concentratie van de gescheiden eiwitten werd bepaald met BCA-eiwitassaykit. De SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's kunnen meerdere keren worden hergebruikt om de doeleiwitten met dezelfde methode te scheiden.

Meting van glutathionperoxidase-activiteit

De gescheiden GPX3-activiteit werd gemeten door de spectrometrische bepaling van het NADPH-verbruik bij 340 nm zoals beschreven door Delaunay et al. [25]. De GST-tag werd afgesneden door PreScission-protease van GPX3 met GST-tag en vervolgens werd de GPX3 gebruikt voor activiteitsanalyse. Ten eerste 98 μL reactiebufferoplossing (inclusief 100 mmol/L Tris-Cl, 0,3 mmol/L NADPH, 1,34 μmol/L thioredoxine en 0,18 μmol/L thioredoxine-reductase van E. coli lysaat) werd toegevoegd aan een buis; na volledig mengen werd 1,35 μmol gezuiverd GPX3 toegevoegd aan de resulterende reactiebufferoplossing. Vervolgens werd de gemengde oplossing toegevoegd aan 2 μL H₂ O₂ (5 mmol/L) om de reactie te starten en het NADPH-verbruik bij 340 nm werd verzameld door de spectrometrische bepaling.

Analyse van Redox-toestanden van gezuiverde GPX3

De GST-tag werd door PreScission-protease afgesneden van GST-getagde GPX3. De afgescheiden GPX3 werd behandeld met 5 mmol/L H₂ O₂ en 1 mmol/L DTT gedurende 10 minuten om de redoxtoestanden van de gezuiverde GPX3 te wijzigen. De resulterende GPX3 werd gebruikt voor in vitro analyse van redoxtoestanden. Extracten werden geëvalueerd door niet-reducerende 15% SDS-PAGE-gel.

Karakterisering

De morfologie en samenstelling van de bereide SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's werden geanalyseerd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, JEM-2010, Japan), scanning-elektronenmicroscopie (SEM, JSM 5600LV, Japan), röntgendiffractie (XRD, X 'Pert Philips, Holland) en fluorescentiespectrometer ( FL, FluoroSENS, Groot-Brittannië, bij de excitatiegolflengte van 260 nm). De gescheiden GST-gelabelde eiwitten werden gedetecteerd met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE, Power PAC 300, China), met de preconcentratiespanning van 70 V en de scheidingsspanning van 120 V. De constante temperatuuroscillator was van Shanghai ChemStar Instruments , Co., Ltd. (ATS-03M2R, China). De concentratie van de gescheiden eiwitten werd bepaald door BCA-eiwit Assay Kit (Beijing CoWin Biotech, China).

Resultaten en discussie

TEM-, SEM-, XRD- en fluorescentieanalyses van SnO₂ QD's en SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's

Afbeelding 1 geeft de TEM-beelden (HRTEM) met hoge resolutie en het XRD-patroon van de gesynthetiseerde SnO₂ QD's. Het is te zien dat de gesynthetiseerde SnO₂ QD's zijn bolvormig en hebben een gemiddelde diameter van 5 nm, die een smalle deeltjesgrootteverdeling vertoont (figuur 1a), en hun roosterafstand van (110) vlak is 0,29 nm (figuur 1b). Het goed opgeloste roosterbeeld laat zien dat de voorbereide SnO₂ QD's hebben een sterk geordende kristallijne structuur. Overeenkomstig geselecteerd gebiedselektronendiffractiepatroon van SnO₂ QD's (Fig. 1c) kunnen worden geïndexeerd tot een enkele Cassiteriet-fase, wat consistent is met het relevante XRD-patroon (Fig. 1d). Namelijk, de karakteristieke pieken bij 2 theta = 26,6° (110), 33,9° (101), 38,0° (200), 51,8° (211), 65,9° (301) en 78,7° (321) komen overeen met de standaard XRD-gegevens van Cassiterite SnO₂ (JCPDS-kaart nr. 41-1445). Bovendien geven de intense XRD-pieken aan dat de bereide SnO₂ QD's zijn goed gekristalliseerd en de afwezigheid van andere karakteristieke pieken suggereert dat ze geen hematiet- of hydroxide-onzuiverheden bevatten.

TEM (a ), HRTEM (b ) afbeeldingen, elektronendiffractiepatroon met geselecteerd gebied (c ) en XRD-patroon (d ) van bereide SnO₂ QD's

Afbeelding 2 geeft de SEM- en TEM-afbeeldingen van SnO₂ /SiO₂ -GSH NS'en. Het is te zien dat de voorbereide SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's hebben een bolvorm en hebben een gemiddelde diameter van ongeveer 430 nm, en hun oppervlak lijkt enigszins ruw te zijn (Fig. 2a, b). In de tussentijd is te zien dat de SnO₂ QD's (ongeveer 5-15 nm) worden gewijzigd op het oppervlak van SiO₂ microsferen (Fig. 2c, d), wat consistent is met de overeenkomstige SEM-afbeeldingen. Er wordt aangegeven dat de SnO₂ en silica NS's zijn geaggregeerd.

SEM (een , b ) en TEM (c , d ) afbeeldingen van de voorbereide SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's

Afbeelding 3a geeft het XRD-patroon van de gesynthetiseerde SnO₂ /SiO₂ -GSH NS'en. De belangrijkste pieken bij 2 theta = 110°, 101°, 200°, 211°, 301° en 321° komen overeen met die van SnO₂ (Fig. 1d). Trouwens, SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's vertonen een intense karakteristieke piek van amorf silica rond 23° (JCPDS-kaart nr. 76-0933), wat aangeeft dat SnO₂ met een zichtbare lichtrespons is met succes geïntroduceerd op het oppervlak van SiO₂ NS'en. Afbeelding 3b toont het fluorescentiespectrum van SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's bij 368 nm. Het is te zien dat SnO₂ /SiO₂ -GSH vertoont intense fluorescentie-emissie, die wordt toegeschreven aan zuurstofvacatures van SnO₂ . Afbeelding 3c geeft de fluorescentiebeeldvorming van SnO₂ . weer /SiO₂ -GSH NS's wanneer deze NS's worden gebruikt om GST-gelabelde GPX3 te scheiden in E. spoel lysaat. Het is te zien dat er duidelijke groene fluorescentie is waar de bereide SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's worden gebruikt. Het geeft aan dat SnO₂ werd gemodificeerd op het oppervlak van SiO₂ en de SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's hebben goede fluorescentie-eigenschappen.

XRD-patroon (a ), fluorescentiespectrum (b ), en fluorescentiebeeldvorming (c ) van bereide SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's

SDS-PAGE-analyse

Om het vermogen van de voorbereide SnO₂ . te schatten /SiO₂ -GSH NS's bij het scheiden van GST-gelabelde eiwitten, we hebben SDS-PAGE-analyse uitgevoerd. Afbeelding 4 toont het SDS-PAGE-analyseresultaat van de GST-gelabelde GPX3, gescheiden door SnO₂ /SiO₂ -GSH NS'en. Het is te zien dat de SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's kunnen doeleiwitten van E. coli lysaat, en in het bijzonder de hoeveelheid van de gedissocieerde eiwitten heeft de neiging toe te nemen met een toenemende concentratie van GSH in het bereik van 10-100 mmol/L (lanen 3-6 in Fig. 4a). Het is duidelijk dat de doeleiwitten specifiek kunnen worden gescheiden door de bereide SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's van de E. coli lysaat en er was nauwelijks niet-specifiek.

SDS-PAGE-analyse van gezuiverde GST-gelabelde eiwitten gescheiden door SnO₂ /SiO₂ -GSH NS'en. een Baan 1, markering; baan 2, E. coli lysaat; lanen 3-6 verwijzen naar de fracties die zijn afgewassen van de SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's met verschillende concentraties GSH-oplossing (baan 1, 10 mmol/L; baan 2, 20 mmol/L; baan 3, 50 mmol/L; baan 4, 100 mmol/L). b Baan 1, markering; baan 2, E. coli lysaat; baan 3, 1e scheiding; baan 4, 2e scheiding; baan 5, 3e scheiding; en baan 6, de fracties zijn afgewassen van de Glutathion Sepharose 4B

Om de hergebruikte eigenschappen van de geprepareerde SnO₂ . te onderzoeken /SiO₂ -GSH NS's, we hebben ze herhaaldelijk gebruikt om GST-gelabelde GPX3 te scheiden. Zoals weergegeven in Fig. 4b (baan 1 verwijst naar de marker, baan 2 verwijst naar GST-GPX3-bevatte E. coli lysaat, baan 3 verwijst naar de eerste scheiding, baan 4 verwijst naar de tweede scheiding, baan 5 verwijst naar de derde scheiding en baan 6 verwijst naar de fracties die zijn afgewassen van Glutathion Sepharose 4B), het gesynthetiseerde SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's vertonen speciale selectiviteit naar GST-gelabelde GPX3 geëxtraheerd uit E. coli lysaat, en hun specificiteit en affiniteit blijven onaangetast na drie cycli van herhaalde scheiding.

Om de universaliteit van de gesynthetiseerde SnO₂ . te testen /SiO₂ -GSH NS's voor het zuiveren van GST-gelabelde eiwitten, selecteerden we drie soorten GST-gelabelde eiwitten (GST-gelabeld GPX3, GST-gelabeld OST1 en GST-gelabeld ABI2) om experimenten uit te voeren. Zoals weergegeven in figuur 5, kunnen GST-gelabelde GPX3-, OST1- en ABI2-eiwitten specifiek worden gescheiden door SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's van de E. coli lysaat (lanen 3, 6, 9); dan kunnen we beide GPX3 krijgen (afgesneden van de GST-tag van SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's die GST-gelabeld GPX3) binden en GST-tag geëlueerd van SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's (baan 13, de GPX3; baan 14, de GST-tag), die een soortgelijk effect heeft met Glutathion Sepharose 4B (baan 2, 5, 8, 11, 12). De concentraties van gezuiverde eiwitten door SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's waren 7,4 mg/g (GST-gelabeld GPX3), 7,1 mg/g (GST-gelabeld OST1) en 6,8 mg/g (GST-gelabeld ABI2), wat aangeeft dat SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's zijn goed voor het zuiveren van GST-gelabelde eiwitten uit de E. coli lysaat. Om de bindingscapaciteit tussen de bereide SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's en het andere materiaal, Glutathione Sepharose 4B (gekocht in Stockholm, VS) werd gebruikt als vergelijkingsexperimentmateriaal. De totale eiwitten die door Glutathion Sepharose 4B werden gezuiverd, waren respectievelijk 7,1 mg/ml (GST-gelabeld GPX3), 6,9 mg/ml (GST-gelabeld OST1) en 5,6 mg/ml (GST-gelabeld ABI2). Het is te zien dat de bindingscapaciteit van het bereide SnO₂ /SiO₂ -GSH NSs is hoger dan die van product 4B.

SDS-PAGE-analyse van de gezuiverde recombinante GPX3-, OST1- en ABI2-eiwitten. Baan 1, 4 en 7, E. coli lysaat; lanen 2, 5 en 8, de eiwitten geëlueerd uit commerciële Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare, VS); lanen 3, 6 en 9, de eiwitten elueerden van SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's; baan 10, de markering; lanen 11 en 13, GPX3 verkregen nadat de GST-tag is afgesneden van Glutathion Sepharose 4B gebonden GST-GPX3 en SnO₂ /SiO₂ -GSH NSs gebonden GST-gelabelde GPX3; lanen 12 en 14, GST-tag geëlueerd van Glutathion Sepharose 4B en SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's

Analyse van Redox State en Peroxidase Activiteit van GST-Tagged GPX3

Om de redox-toestand en activiteit van GST-gelabelde GPX3 te analyseren, gescheiden door de voorbereide SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's, we hebben de GST-tag afgesneden om de gescheiden GPX3 te verkrijgen. Figuur 6a toont gegeven in vitro-assays van GPX3-redoxtoestand (overeenkomend met een representatieve gel uit drie onafhankelijke experimenten). Lanen 1 en 2 verwijzen naar GPX3 die is verkregen nadat de GST-tag is afgesneden van Glutathion Sepharose 4B-gebonden GST-gelabelde GPX3 (laan 1 is de geoxideerde GPX3 en laan 2 is de gereduceerde GPX3); lanen 3 en 4 verwijzen naar GPX3 verkregen nadat de GST-tag is afgesneden van SnO₂ /SiO₂ -GSH gebonden GST-gelabelde GPX3 (baan 3 is de geoxideerde GPX3 en baan 4 is de gereduceerde GPX3); baan 5 verwijst naar de markering. Zoals getoond in Fig. 6a, scheidde de gezuiverde GPX3 zich van Glutathion Sepharose 4B (lanen 1 en 2) en SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's (lanen 3 en 4) hebben de geoxideerde en gereduceerde toestand, en de gereduceerde GPX3 migreert langzamer dan de geoxideerde tegenhanger. Dit komt goed overeen met onze eerdere bevindingen dat GPX3 in vitro aanwezig is in geoxideerde en gereduceerde toestanden, en de gereduceerde en geoxideerde vormen kunnen worden gescheiden als gevolg van modificatie van de gereduceerde Cys-residuen [26,27,28].

een In vitro-assays van GPX3-redoxtoestand:lanen 1 en 3 (de geoxideerde GPX3) en 2 en 4 (de gereduceerde GPX3) verwijzen naar GPX3 die is verkregen nadat de GST-tag is afgesneden van Glutathion Sepharose 4B en SnO₂ /SiO₂ -GSH gebonden GST-gelabelde GPX3, respectievelijk; baan 5, markering. b Testen van peroxidase-activiteit van GPX3

Figuur 6b toont de testen van peroxidase-activiteit van GPX3:lijn GPX3*, volledige test van de gezuiverde GPX3 in aanwezigheid van glutathion-sepharose 4B, thioredoxine, thioredoxine-reductase, NADPH en H₂ O₂; lijn GPX3, volledige reactie tussen SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's scheidden GPX3, thioredoxine, thioredoxine-reductase, NADPH en H₂ O₂; regel Geen GPX3, volledige reactie in afwezigheid van GPX3; en regel No Trx, volledige reactie in afwezigheid van thioredoxine. Figuur 6b toont de glutathionperoxidase-activiteit van de gezuiverde GPX3 gescheiden van Glutathion Sepharose 4B en SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's in vitro. Het kan worden gezien dat, met thioredoxine als substraat, de gezuiverde GPX3 significante peroxidase-activiteit vertoont, wat aangeeft dat de GPX3 gescheiden is van SnO₂ /SiO₂ -GSH NSs bestaat in de natuurlijke staat.

Conclusies

Er is een gemakkelijke methode ontwikkeld om met silica beschermd SnO₂ . te vervaardigen QD-nanobolletjes (SnO₂ /SiO₂ NS). De SnO₂ /SiO₂ NS's worden verder gemodificeerd door glutathion om SnO₂ . te verkrijgen /SiO₂ -GSH NS's voor de affiniteitsscheiding van glutathion S -transferase-gelabeld (GST-gelabeld) recombinant eiwit. Bevindingen geven aan dat, in termen van het vermogen om GST-getagde GPX3, GST-tagged LOV en GST-tagged ABI2, de voorbereide SiO₂ /SiO₂ -GSH NS's vertonen specifieke scheiding, hoge concentratie van eiwitbinding en goede hergebruikte eigenschappen. Bovendien behoudt de GPX3 die is gescheiden van de GST-gelabelde GPX3 zijn redoxtoestanden in vitro en GPX-activiteit ook, wat betekent dat de bereide SnO₂ /SiO₂ -GSH NS's hebben mogelijk een veelbelovend potentieel voor de snelle scheiding en zuivering van GST-gelabelde eiwitten.