Een op grafeenoxide gebaseerde fluorescerende aptasensor voor de inschakeldetectie van CCRF-CEM

Resultaten en discussie

Principe van GO-apt Fluorescent Aptasensor voor detectie van CCRF-CEM

In deze studie werden GO en FAM-apt gebruikt om een ​​fluorescerende aptasensor te ontwerpen om CCRF-CEM-cellen te detecteren. Het principe van de fluorescerende sensor voor detectie van CCRF-CEM-cellen wordt getoond in Fig. 1. Bij afwezigheid van CCRF-CEM-cellen worden de FAM-gemodificeerde aptameren geadsorbeerd op het GO-oppervlak door π -π stapelen. Aangezien GO en de fluorofoor zich te dicht bij de energieoverdracht bevinden, dooft GO als uitdover de fluorescentie van FAM. In aanwezigheid van CCRF-CEM-cellen zorgt de zwakke bindende kracht van het GO-aptamer ervoor dat het aptamer van het GO-oppervlak valt en aan de cellen bindt, waardoor de fluorescentie wordt hersteld. Daarom kan het aantal CCRF-CEM-cellen overeenkomstig het herstel van de FAM-fluorescentie-intensiteit worden gedetecteerd.

Schematische illustratie van GO-apt fluorescente aptasensor voor detectie van CCRF-CEM-cellen

Fluorescentie uitdoving en herstel

Dit continue proces van het uitdoven van de fluorescentie van GO en het terugkeren van de fluorescentie in de aanwezigheid van CCRF-CEM-cellen kan worden waargenomen door een fluorescentiespectrofotometer. Het hele proces van detectie op basis van GO-fluorescentie-aptameren wordt getoond in Fig. 2a. Het fluorescentiespectrum van FAM-apt in 25 nM Tris-HCl-buffer vertoont een sterke fluorescentie-intensiteit dankzij de aanwezigheid van de FAM (Fig. 2a, curve a). Na toevoeging van GO was de fluorescentie-intensiteit echter opmerkelijk verminderd (Fig. 2a, curve b), wat aangeeft dat GO in staat was om de fluorescentie efficiënt te doven wanneer GO en de aptameren dicht bij elkaar waren en aan elkaar werden geadsorbeerd. Verrassend genoeg, wanneer 5 × 10 ⁶ CCRF-CEM-cellen werden toegevoegd, de uitgedoofde fluorescentie kon zich in de tijd herstellen (figuur 2a, curve c). Desalniettemin heeft de fluorescentie-intensiteit van FAM-apt zonder GO-conjugatie geen duidelijke verandering wanneer CCRF-CEM-cellen werden toegevoegd (figuur 2a, curve d). CCRF-CEM is een niet-fluorescerende cel (figuur 2a, curve e); daarom is fluorescentieherstel voornamelijk te wijten aan de dissociatie van het aptameer van het oppervlak van het grafeen en het blootstellen van de fluorescerende groep. Deze experimenten met het uitdoven en herstellen van de fluorescentie illustreerden duidelijk dat het CCRF-CEM-aptamer-complex (CEM-apt) kan voorkomen dat FAM-apt door GO wordt gedoofd, en dat CEM een sterkere bindingsaffiniteit voor zijn aptamer heeft dan GO. Dankzij het structuurverschil tussen enkelstrengs aptamer en CEM-aptameercomplex, kunnen aptameren op het GO-oppervlak interageren met CEM en vervolgens transformeren naar het CEM-aptameercomplex. Dit fenomeen geeft ook duidelijk aan dat de binding van het CEM-aptameercomplex aan het aptameer zwakker is dan die van GO, waardoor het aptameer van het oppervlak van GO kan vallen. Omdat de FAM-apt zich verder van het GO-oppervlak bevindt en de efficiëntie van de energieoverdracht wordt verminderd, wordt de fluorescentie hersteld. Statistische analyse van fluorescentie-emissiespectra van FAM-gelabeld Sgc8-aptameer en CCRF-CEM werd uitgevoerd onder verschillende omstandigheden (Fig. 2b).

Haalbaarheid van Go-apt-detectie van CEM-cellen. een Fluorescentie-emissiespectra van FAM-apt- en CCRF-CEM-cellen onder verschillende omstandigheden:(a) FAM-apt, (b) FAM-apt + GO, (c) FAM-apt + GO + CCFF-CEM, (d) FAM- apt + CCFF-CEM, en (e) CCRF-CEM; FAM-apt (20 nM); GO (25 μg/ml); CCRF-CEM (1 × 10 ⁶ cellen). Excitatie 490 nm. b Statistische analyse van fluorescentie-emissiespectra van FAM-apt en CCRF-CEM onder verschillende omstandigheden. NS niet significant. ****P < 0.0001

Kenmerken van GO-apt Fluorescent Aptasensor

Om de opzet te verifiëren is een uniforme en decentrale GO verkregen. Uit figuur 3a weten we dat een GO-plaat met een dikte van 1,17 nm een ​​typisch tweedimensionaal uiterlijk heeft van AFM. GO-apt met een dikte van 1,94 nm toonde echter aan dat FAM-apt met succes is geabsorbeerd door het GO-oppervlak. Het zeta-potentieel van FAM-apt en GO was respectievelijk -11,35 en -23,90 mV, maar wanneer GO niet-convalent interageert met FAM-apt, nam de absolute waarde van zeta-potentiaal toe (figuur 3b). Deze resultaten gaven aan dat aptasensoren met succes zijn geconstrueerd. Uit figuur 3c weten we dat GO een sterke absorptie vertoonde bij 234 nm, wat wordt toegeschreven aan de π -π * overgangen van aromatische C=C bindingen. FAM-apt wordt gekenmerkt door absorptiebanden van de DNA-sequentie (260 nm) en FAM (503 nm), terwijl de toevoeging van GO aan de oplossing van FAM-apt een roodverschuiving veroorzaakt en de absorptie van FAM bij 503 nm wordt verhoogd. De mogelijke reden is dat FAM-apt wordt geadsorbeerd op het GO-oppervlak, wat wijst op elektronische interacties tussen de twee π systemen van GO en de kleurstoffen in de grondtoestand. Daarom gaven de resultaten aan dat GO-apt met succes is gebouwd.

Karakterisering van GO-apt. een AFM-beelden van GO en CEM-apt. b Oppervlakte-zeta-potentiaal van FAM-apt, GO en CEM-apt. Foutbalken geven ± SD aan (n = 3). c UV-zichtbare absorptiespectra van (a) GO, (b) FAM-apt en (c) GO-apt

Fluorescentiemicroscopie van cellen

Om de specificiteit van gevallen FAM-apt-binding op cellulair niveau direct te visualiseren, hebben we CCRF-CEM- en Ramos-cellen geïncubeerd met Go-apt en deze vervolgens geanalyseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie. In overeenstemming met de fluorescentiespectrale experimenten kan FAM-apt van Go-apt vallen en vervolgens binden aan CCRF-CEM-cellen voor fluorescerende kleuring, maar niet aan Ramos-cellen (Fig. 4).

Fluorescentiemicrofoto's van CCRF-CEM- en Ramos-cellen na mengen met GO-apt. Kernen werden gekleurd met DAPI. Schaalbalken geven 25 μm aan

Optimalisatie van experimentele omstandigheden voor detectie van CCRF-CEM

Om de uitstekende prestaties van de fluorescerende aptasensor te verkrijgen, werden de tijd van het uitdoven en herstellen van de fluorescentie geoptimaliseerd. Het kinetische gedrag van FAM-apt en GO, evenals de FAM-apt in homogene GO-oplossing met CCRF-CEM-cellen, werden onderzocht door de fluorescentie-intensiteit te volgen als een functie van uitdoving en hersteltijd (Fig. 5a, b). Zoals getoond in Fig. 5a, kan het uitdoven van de fluorescentie van FAM-apt als een functie van de incubatietijd in aanwezigheid van GO worden waargenomen. De FAM-apt adsorbeert snel aan het oppervlak van de GO en ondergaat daarna energieoverdracht, en tegelijkertijd wordt de fluorescentie-intensiteit aanzienlijk verminderd en neigt deze na 2 minuten te vertragen. Daarentegen wordt CEM-apt gevormd en is de afgifte van het GO-oppervlak langzamer. De fluorescentie-intensiteit bereikte een platform wanneer de incubatietijd hoger was dan 30 min (Fig. 5b). Deze tijdafhankelijke experimenten tonen aan dat GO, als een uitstekende quencher, snel FAM-apt fluorescentie dooft en geleidelijk de fluorescentie herwint in de aanwezigheid van CEM.

Optimalisatie van experimentele omstandigheden. een Fluorescentie-uitdoving van FAM-apt (20 nM) in Tris-HCl-buffer door GO als functie van de tijd. b Fluorescentieherstel van FAM-apt in GO-oplossing door CCRF-CEM (1 × 10 ⁶ ) als functie van de tijd. c Effect van GO-concentratie op de fluorescentie-intensiteit van FAM-apt bij afwezigheid (curve a) en bij aanwezigheid (curve b) van 1 × 10 ⁶ CCRF-CEM-cellen. d De intensiteit van de fluorescentie (F /F ₀ ) van FAM-apt door 1 × 10 ⁶ CCRF-CEM-cellen als een functie van GO-concentratie. Excitatie 490 nm

Om de fluorescerende aptasensor gevoeliger te maken voor de detectie van CCRF-CEM, wordt het reactiesysteem dat wordt gebruikt om de GO-concentratie te optimaliseren onmisbaar. Figuur 5c, die onze strategie duidelijk illustreert, toont het effect van verschillende GO-concentraties op de fluorescentie-intensiteit van FAM-apt in afwezigheid (Fig. 5c, curve a) en in aanwezigheid (Fig. 5c, curve b) van CCRF -CEM. Zoals we hebben gezien in figuur 5c, wordt na toevoeging van GO de achtergrond van het fluorescentiesignaal aanzienlijk verminderd. Afbeelding 5d toont de herstelde fluorescentie van de FAM-apt met 1 × 10 ⁶ CEM-cellen als functie van GO-concentratie. Uit figuur 5d kunnen we zien dat wanneer de GO-concentratie 20 μg/ml is, de verhouding van F /F ₀ (waar F ₀ en F zijn de fluorescentie-intensiteiten van FAM bij 518 nm in respectievelijk de afwezigheid en aanwezigheid van CCRF-CEM) de hoogste waarde krijgt, namelijk 13,0354. Daarom werd 20 μg/ml als de optimale GO-concentratie beschouwd.

CCRF-CEM-detectie met GO-apt Fluorescent Aptasensor

Om goede experimentele resultaten te verkrijgen, werden optimale experimentele omstandigheden gebruikt om CCRF-CEM te detecteren. Figuur 6a laat zien dat met het toenemende aantal CCRF-CEM van 0 naar 1 × 10 ⁷ , wordt ook de fluorescentie-intensiteit dienovereenkomstig verhoogd. Verder is de F /F ₀ toont een duidelijke lineaire afhankelijkheid van het aantal CCRF-CEM in het bereik van 1 × 10 ² –1 × 10 ⁷ (Fig. 6b). De lineaire regressievergelijking is Y (F /F ₀ ) = 3.2608 × log C − 5.1892 (waar C is het aantal CCRF-CEM) met de regressiecoëfficiënt R ² = 0,9922. De detectielimiet wordt beschouwd als minder dan tien cellen. Daarom heeft op GO gebaseerde fluorescentie-aptamerdetectie een breed detectiebereik, zodat het kan worden gebruikt als een ideale biosensor om CCRF-CEM te detecteren. In vergelijking met de andere methoden heeft deze methode een hogere gevoeligheid (tabel 1) [34,35,36,37,38,39].

Go-apt detectie van CEM-cellen. een Fluorescentie-emissiespectra van GO-apt fluorescerende aptasensor in aanwezigheid van verschillende concentraties CCRF-CEM-cellen. b Lineaire relatie tussen de intensiteit van de fluorescentie (F /F ₀ ) en de concentratie van CCRF-CEM-cellen

Specificatie van GO-apt Fluorescent Aptasensor

Om de specificiteit van GO-apt fluorescerende adapters te onderzoeken, werden verschillende cellen gebruikt om het systeem te testen, zoals Ramos-cellen, H22-cellen en 293T-cellen. Elk van de 100-μL reactiesystemen omvatte 1 × 10 ⁶ cellen. Afbeelding 7 laat zien dat CCRF-CEM een hogere fluorescentie-intensiteit krijgt dan de andere controlegroepen. De resultaten gaven ook duidelijk aan dat de ontworpen fluorescerende aptasensor werd omarmd om zeer specifiek te zijn.

Specificiteit van de fluorescerende aptasensor voor CEM. De intensiteit van de fluorescentie (F /F ₀ ) van GO-apt fluorescente aptasensor in aanwezigheid van respectievelijk CEM-cellen, Ramos-cellen, H22-cellen en 293T-cellen (1 × 10 ⁶ ), waarbij F ₀ en F zijn de fluorescentie-intensiteit zonder en met detectiecellen bij 518 nm. Excitatie 490 nm