Ronde gouden nanodeeltjes:effect van deeltjesgrootte en concentratie op de wortelgroei van Arabidopsis thaliana

Resultaten en discussie

Nanaodeeltjeskarakterisering

Grootte en grootteverdeling van AuNP's werden bepaald door TEM- en DLS-analyses. De resultaten zijn samengevat in tabel 1, samen met AuNP-concentraties bepaald door AAS onmiddellijk na NP-synthese en concentraties van resterende Au-ionen bepaald door ICP-MS. Uit deze gegevens blijkt dat ons syntheseprotocol goed op grootte gecontroleerde Au-nanodeeltjes biedt met een vrij smalle grootteverdeling. Hier hebben we een aangepaste methode gebruikt die is gepubliceerd door Batús et al. [20] voor de synthese van grootte- en vormgecontroleerde citraat-gestabiliseerde AuNP's. Ontwikkeld protocol maakt gerichte uitbreiding van de grootte mogelijk op basis van vergroting van voorgesynthetiseerde AuNP's door middel van oppervlaktegekatalyseerde reductie van Au ³⁺ samen met effectieve gelijktijdige remming van secundaire kiemvorming.

Wang et al. [21] ontdekte dat tijdens een 3-daagse blootstelling aan hydrocultuur van A. thaliana aan Ag ⁺ en AgNP's (5 nm) bij dezelfde concentratie, nam de Ag-concentratie sneller af in de Ag ⁺ -behandelde oplossing dan in de AgNP-oplossing, wat wijst op een snellere opname van Ag ⁺ ionen. Daarom hebben we speciale aandacht besteed aan het minimaliseren van het mogelijke effect van Au-ionen in resultaatvervorming. As-gesynthetiseerde AuNP's werden gecentrifugeerd tot een concentratie van 2000 mg/L en verdund met MS-medium tot de vereiste concentraties (1, 10 en 100 mg/L). Na deze procedure werd de concentratie van resterende Au-ionen in oplossingen met 100 mg/L AuNP's bepaald door ICP-MS (zie tabel 1). Blijkbaar had de centrifugatie een positief effect op zowel de aanwezigheid van resterende Au-ionen, waarvan de concentraties met twee ordes van grootte waren verlaagd in vergelijking met gesynthetiseerde oplossingen (tabel 1, AAS) en de inhoud van de citraatbuffer zelf.

Om NP-polydispersiteit te kwantificeren, hebben we DLS-meting uitgevoerd, die erg gevoelig is voor de aanwezigheid van uiteindelijk gevormde deeltjesconglomeraten (figuur 1). Bij deze meting veroorzaakt zelfs een kleine hoeveelheid geagglomereerde NP's de dominantie van de overeenkomstige piek bij aanzienlijk hogere diameters, vooral in de intensiteitsgewogen grootteverdeling (zie inzet in figuur 1). Gelukkig werd er geen deeltjesagglomeratie gedetecteerd, en dus kan de geloofwaardigheid van de grootte-evaluatie alleen worden beïnvloed door sferische benadering [22]. Ondanks dit nadeel geeft DLS-meting een statistisch significanter algemeen beeld van de deeltjesgrootteverdeling in vergelijking met TEM, omdat het het volledige monstervolume in één keer evalueert. Vanwege de overwegend ronde aard van geprepareerde NP's (zie figuur 2), kwamen de van DLS afgeleide maten goed overeen met die verkregen door TEM (tabel 1). Schijnbare deeltjesagglomeraten, zichtbaar in TEM-afbeelding (Fig. 2, 10 nm), werden waarschijnlijker veroorzaakt door de noodzaak van verwijdering van oplosmiddel in TEM-metingen, in plaats van onderlinge verbinding van individuele deeltjes in colloïde-oplossing zelf.

Dynamische lichtverstrooiingsanalyse (aantalgewogen grootteverdeling) van waterige oplossingen van AuNP's van verschillende groottes. Inzet toont "onbewerkte" intensiteitsgewogen gegevens. Cijfers verwijzen naar gemiddelde deeltjesdiameter in nm

TEM-afbeeldingen van voorbereide set AuNP's. Houd er rekening mee dat de beeldvergroting verschilt voor bepaalde NP's-formaten

Aanpassing van nanodeeltjesoplossingen om te voldoen aan plantbiologische voorwaarden

Vanwege de sterke neiging tot aggregatie van AuNP's in plantengroeimedia (MS-medium), dat vaak wordt gebruikt voor plantengroei in vitro [23], moesten we de onderlinge verhouding van deze twee componenten optimaliseren om NP's-aggregatie te voorkomen terwijl acceptabele omstandigheden voor plantengroei werden behouden. Verschillende verdunningen van MS werden getest. Aggregatie van AuNP's was gemakkelijk zichtbaar door de verandering van de kleur (overgang van rood naar paars). Vanwege de lage initiële concentratie van gesynthetiseerde AuNP's (ongeveer 30 mg/L, zie tabel 1), onvoldoende voor biologische experimenten, was het noodzakelijk om de NP-concentratie te verhogen door middel van centrifugatie. Door deze procedure hebben we de deeltjesconcentratie verhoogd tot de grenswaarde van 2000 mg/L. Dergelijke NP's-oplossingen werden vervolgens verdund tot eindconcentraties, waardoor ook de concentratie van de citraatbuffer in onze experimenten daalde. Voor kweekexperimenten van A. thaliana , hebben we AuNP's verdund in 1/16 MS-medium. Minimale NP's-aggregatie was detecteerbaar in dit medium en NP's waren veel stabieler in vergelijking met 1/2 MS, 1/4 MS en 1/8 MS met bijna ongewijzigde plantengroei. Concentratie van AuNP's in eindoplossingen werd bepaald door AAS. Omdat plantengroei-experimenten in in vitro (in steriele omstandigheden) werden uitgevoerd, werd ook het effect van de sterilisatieprocedure op NP's bestudeerd. Veelgebruikte autoclaveren (121 ° C, 20 min) van bereide groeimedia veroorzaakte volledige aggregatie van onderzochte NP's. Daarom was deze procedure niet geschikt voor onze experimenten. Toevoeging van NP's aan ongeveer 60 ° C geautoclaveerd agarmedium werd uiteindelijk gebruikt als een alternatieve procedure waarbij geen NP-aggregatie werd gedetecteerd en het sterilisatieproces nog steeds effectief was.

Effect van NP's op de wortelgroei van Arabidopsis thaliana in vitro

Modelplanten zoals dicot A. thaliana hebben het potentieel om stressfactoren te helpen begrijpen die de wereldwijde gewasopbrengsten verminderen met als doel genen te identificeren die de levensvatbaarheid onder stressomstandigheden kunnen verbeteren [24]. Alle geteste vormen van AuNP's hadden een significant effect op zijwortels (LR's). Zowel de lengte (figuur 3a) als het aantal (figuur 3b) LR's waren verminderd in met AuNP behandelde planten. De hoogste concentraties AuNP's (100 mg/L) van alle onderzochte deeltjesgrootten veroorzaakten een afname van de lengte van de LR's tot ongeveer 50%. Het aantal LR's neemt af tot ongeveer 70% bij 18 nm AuNP's en de hoogste concentratie (100 mg/L). Een iets kleinere vermindering van het aantal LR's werd waargenomen wanneer de hoogste concentratie kleinere AuNP's (14 en 10 nm) werd gebruikt (figuur 3b). De lengte van de primaire wortels was ook afgenomen na AuNP-behandeling (figuur 3c). Het negatieve effect van 10-nm AuNP was aanzienlijk, vooral bij hogere deeltjesconcentraties. Het effect van grotere deeltjes (14, 18 nm) was veel kleiner en vergelijkbaar met het effect van natriumcitraatbuffer die als controle werd gebruikt. De meeste gepubliceerde onderzoeken met gemanipuleerde NP's wezen op een zekere mate van fytotoxiciteit, vooral bij hoge NP-concentraties. Met citraat gecoate AgNP's remden bijvoorbeeld A. thaliana Verlenging van de wortel van zaailingen met een lineaire dosisrespons van 67 tot 535 μg/L na 2 weken [25]. Verschillende andere onderzoeken waarbij gebruik werd gemaakt van de wortelverlengings- en zaadkiemingsassays hebben aangetoond dat fytotoxiciteit werd beïnvloed door de grootte van NP's. Veel studies hebben geconcludeerd dat hoe kleiner de NP's, hoe fytotoxischer ze zijn. Deze generalisatie over de grootte-afhankelijke toxiciteit van gemanipuleerde nanomaterialen is echter niet altijd waar voor alle combinaties van planten en NP's [21, 25]. Daarentegen hadden enkelwandige koolstofnanobuisjes een positieve invloed op de wortelverlenging van tomaat, kool, wortel en sla in 24 tot 48 uur [26]. Een positief effect van 24 nm AuNP's op de kiemkracht van zaden en vegetatieve groei werd gerapporteerd door Kumar et al. [13].

Effect van AuNP's op a lengte en b aantal zijwortels en c verlenging van de primaire wortel van A. thaliana zaailingen. Planten werden blootgesteld aan verschillende concentraties (0,1, 10 en 100 mg/L) van 10, 14 en 18 nm AuNP's. Gegevens zijn gemiddelden + SD van 19–20 planten. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001; t testen

Aanzienlijk positief effect van 10 nm AuNP's op de haargroei van een wortel werd waargenomen tijdens wortelgroei-experimenten (Fig. 4). Dit effect vertoonde een sterke concentratieafhankelijkheid. Toenemende NP-concentratie induceerde een meer uitgesproken groei van wortelharen (figuur 4e). Dit gedrag is vaak waargenomen bij wortels die zijn gekweekt in fosforarme bodems [27]. Een vergelijkbaar effect werd niet waargenomen bij 14 en 18 nm AuNP's. In tegenstelling daarmee hebben García-Sánchez et al. [28] waargenomen, tijdens A. thaliana behandeling met in de handel verkrijgbare AgNP's, remming van een aantal wortelharen gerelateerd aan 1 cm plantenwortel. Bij alle geteste deeltjes werd een afname van haarwortels waargenomen, ongeacht hun specifieke grootte (10, 20, 40 en 80 nm), met een uniforme concentratie van behandelingsoplossingen van 200 mg/L. Wortelharen vergroten het worteloppervlak in contact met de grond aanzienlijk en het meeste water en de voedingsstoffen die de plant binnenkomen, worden erdoor opgenomen. Hun ontwikkeling wordt dus aanzienlijk beïnvloed door omgevingsstimuli en stresssignalen [29].

Effect van verschillende concentraties van 10 nm AuNP's op wortelhaargroei in A. thaliana zaailingen. een Controle, b –d zaailingen behandeld met respectievelijk 1, 10 en 100 mg/l AuNP's, en e detail van geïnduceerde wortelhaargroei in planten die zijn blootgesteld aan 100 mg / l AuNP's. De schaalbalken komen overeen met 1 cm