Opeenvolgende afgifte van weefselremmers van metalloproteinase-1 via op grafeenoxide gebaseerd toedieningssysteem kan huidregeneratie bevorderen

Materialen en methoden

Celcultuur

Rattenfibroblasten werden gekocht van het Institute of Biochemistry and Cell Biology, CAS (Shanghai, China) en gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's-medium (DMEM, GibcoBRL, Gaithersburg, MD, VS) dat 10% (v bevat) /v ) foetaal runderserum (FBS, Gibco). Het medium werd elke twee dagen verwisseld. Alle cellen werden bewaard bij 37 °C.

GO-karakterisering

GO-vlokken werden gekocht bij Chengdu Organic Chemicals Co., Ltd. Chinese Academy of Science (Chengdu, China) en gekarakteriseerd met behulp van scanning-elektronenmicroscopie (SEM, JSM-6701F, JEOL, Tokyo, Japan) na platinacoating. De monsters werden gescand onder een scanning-elektronenmicroscoop (Hitachi S3000N) bij een versnellingsspanning van 15 kV. De grootteverdeling van de GO-vlokken werd bepaald met een op zeta elektrische potentiaal gebaseerde spectrofotometer (Zetasizer 3000 HSA, Malvern, VK). De morfologie van de GO-vlokken werd bepaald met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM, MultiMode, VEECO, VS) in combinatie met een omgekeerde microscoop (IX71 omgekeerde microscoop, Olympus, Tokyo, Japan). Thermische gravimetrische analyse en differentiële scanningcalorimetrie werden uitgevoerd met behulp van een TGA/DSC thermogravimetrische analysator (Pyris 1 TGA, Perkin-Elmer, VS) door de monsters in aluminiumoxidepannen te plaatsen en een verwarmingshelling toe te passen van 25 tot 1100 °C bij 10 °C/ min.

TIMP-1 Adsorptie op GO

GO-vlokken werden gelabeld met 1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetram-ethylindocarbocyanineperchloraat (DiI, rood, Sigma) vóór adsorptie van menselijke recombinante TIMP-1 (Huaan Co., Hangzhou, China). Voor TIMP-1-adsorptie werden fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC, groen, Thermo Scientific, Rockford, IL, VS)-geconjugeerd TIMP-1 (Huaan Co., Hangzhou, China) en DiI-gelabeld GO toegevoegd aan fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS ) en gedurende 4 uur bij 4 ° C geïncubeerd. De verhouding van GO tot recombinant TIMP-1 was 1:1 op gewichtsbasis. Om de TIMP-1-lading op GO te bepalen, werd TIMP-1 (1 g) toegevoegd aan 20 μl PBS met GO en gedurende 4 uur bij 4 ° C geïncubeerd. TIMP-1 geadsorbeerd aan GO werd gevisualiseerd met behulp van een laser scanning confocale microscoop (IX81-FV1000 omgekeerde microscoop, Olympus). Om TIMP-1-adsorptie op GO te bevestigen, werd Fourier-getransformeerde infraroodspectroscopie (FTIR) uitgevoerd met behulp van een Nicolet 5700-spectroscopie (ThermoFisher Co., SGE, Australië) op pellets (diameter 10 mm) bereid door 2 mg GO te mengen met 100 mg KBr en persen om de te analyseren pellet te produceren. Spectra werden geanalyseerd na basislijncorrectie door de software EZ OMNIC (Nicolet).

Kinetiek vrijgeven van TIMP-1-eiwit

De afgifteprofielen van TIMP-1 uit verschillende GO-concentraties (10, 20 en 30 g/ml) werden bepaald met behulp van commerciële menselijke TIMP-1-specifieke enzymgekoppelde immunosorbentassays (ELISA's, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, VS). Na incubatie gedurende 4 uur bij 4 ° C toonde een ELISA van het supernatant aan dat vrijwel al het TIMP-1 op de GO was geadsorbeerd. De met TIMP-1 geladen GO werd gesuspendeerd in kweekschalen van 60 mm die 1,5 ml PBS bevatten. De schalen werden vervolgens bij 37 ° C geïncubeerd. Op verschillende tijdstippen werd het supernatant verzameld na continu roeren en werd verse buffer aan de kweekschalen toegevoegd. De concentratie van humaan TIMP-1 in het supernatant werd bepaald met ELISA.

GO-biocompatibiliteitstest

Twintig microgram per milliliter GO-vlokken geladen met een concentratie van 20 μg / ml TIMP-1 werden toegevoegd aan rattenfibroblastculturen en de cellen werden 6, 24, 48 en 72 uur gekweekt. De levensvatbaarheid van de cellen werd geëvalueerd met behulp van de celtelling-8 (CCK8)-assay zoals beschreven in de instructies van de fabrikant. De absorptie van het monster werd uitgedrukt als absorptiewaarde bij 450 nm (n = 5 voor elke groep).

Flowcytometrische karakterisering

Fibroblasten werden geoogst door trypsinisatie en gelabeld met Hoechst 33258 en Annexin-V-FITC/PI. Celcyclusactiviteit en celapoptose werden vervolgens bepaald door flowcytometrie-analysekit (Lianke, Hangzhou, China). Labeling werd gedurende 30 minuten bij 4 ° C uitgevoerd in aanwezigheid van blokkerend reagens (Lianke, Hangzhou, China), gevolgd door twee wasstappen met PBS. Na wassen en fixeren, minimaal 10 ⁴ cellen werden verkregen en geanalyseerd. Flowcytometrische analyse werd uitgevoerd met behulp van een Becton Dickinson FACSCanto II.

In vivo-experiment

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de NIH in de VS. De dieren voor experimentele procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Zhejiang University. Vier weken oude mannelijke Sprague-Dawley-ratten kregen huiddefectchirurgie (SDS) zoals eerder beschreven (Fig. 4a) [22]. De grootte van de huidafwijking was 10 mm × 10 mm. Na de operatie werden de dieren teruggebracht naar hun individuele kooien. Veertien dagen na SDS werden de dieren willekeurig in vier groepen verdeeld en werd de therapie gestart. Lokale injecties van controlemiddel (alleen 4 ml PBS), GO-middel (4 ml GO met PBS, 1:20), TIMP-1-middel (4 ml TIMP-1 met PBS 1:20) of TIMP-1-GO-middel (4 ml GO met TIMP-1, 1:1 v /w ) werden subcutaan toegediend. De injecties werden wekelijks gegeven rond het huiddefect (in totaal 4 punten, elk 1 ml) voor in totaal twee behandelingen gedurende een tijdsbestek van 2 weken. De ratten werden 4 weken na de operatie opgeofferd (figuur 4a). De geregenereerde huid werd ontleed, ingebed in paraffine en onderzocht met hematoxyline-eosine-kleuring en Masson-kleuring.

Histologische en immunohistochemische analyse

De geregenereerde huiden werden 72 uur gefixeerd in 4% formaline. Vervolgens werden de monsters gedurende 2 weken bij kamertemperatuur ontkalkt in 9% mierenzuur. De huidmonsters werden gedehydrateerd met graduele ethanol. De opeenvolgende secties werden gekleurd met hematoxyline-eosine (HE) en Masson. Expressie van CD34 bij het huiddefect werd geanalyseerd door middel van immunohistochemische kleuring. De coupes werden van was ontdaan in xyleen en gehydrateerd door gegradeerde alcoholen. Na blokkering met 1% geitenserum (1:100 verdunning, Sigma), werden de coupes een nacht bij 4 ° C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen CD34 (Abcam, Cambridge, VK). Na drie keer wassen met PBS werden de coupes 1 uur bij 37 °C met secundair antilichaam geïncubeerd. Kleuring werd ontwikkeld met 3,3'-diaminobenzidine (DAB) -oplossing (Dako, Hamburg, Duitsland). De geregenereerde huid werd geobserveerd door drie getrainde waarnemers. De immunohistochemische secties werden geënsceneerd met behulp van het percentage DBA.

Statistische analyse

Alle experimenten werden drie keer herhaald en de gegevens werden gepresenteerd als gemiddelden ± standaarddeviatie. Eenrichtings-ANOVA en de post-hoctest Student-Newman-Keuls bepaalden het significantieniveau. p waarden die kleiner zijn dan 0,05 en 0,01 werden respectievelijk als significant en zeer significant beschouwd. Statistische analyse werd uitgevoerd met SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, VS).

Resultaten

GO-karakterisering

De 2D-weergave van GO-afbeeldingen wordt getoond bij AFM (Fig. 1a). Een SEM toonde aan dat de GO-vlokken onregelmatig gevormde vellen waren (figuur 1b). De grootteverdeling van de GO-vlokken werd gemeten met een op elektrische potentiaal gebaseerde spectrofotometer. De grootste intensiteit van de grootteverdeling was 1140 nm en het volume met de meeste intensiteit van de GO was 10.674.1 nm (Fig. 2a).

GO absorptie. een 2D-weergave van GO-afbeeldingen getoond bij AFM. b SEM laat zien dat GO-vlokken onregelmatig gevormde platen zijn. De GO-vlokken waren onregelmatig gevormde platen. c De grootteverdeling van de GO-vlokken. De grootste intensiteit was 1140 nm en het volume met de meeste intensiteit was 10.674.1 nm

GO en TIMP-1-GO karakterisering. een TIMP-1 werd geabsorbeerd op GO. Uit de analyse bleek dat 75 ± 1,2% van GO werd geabsorbeerd in TIMP-1. b De cumulatieve afgifteprofielen van TIMP-1 werden geregistreerd. TIMP-1 ingebed in GO vertegenwoordigt een geschikt systeem voor langdurige TIMP-1-afgifte van ongeveer 40 dagen. c De chemische samenstelling tussen de GO en TIMP-1-GO is onderzocht met behulp van FTIR-spectroscopie. De golfvorm en de golfpiek van GO waren significant verschillend van die van TIMP-1-GO. d De curve van thermische gravimetrische analyse toont geen grote verschillen tussen GO en TIMP-1-GO van 50 tot 800 ° C. De curve van thermische gravimetrische analyse toonde geen merkbare verschillen tussen controle GO en TIMP-1-GO

TIMP-1 Adsorptie op GO

Hieronder volgt de incubatie van FITC-geconjugeerde TIMP-1 (groen) en DiI-gelabelde GO (rood) in PBS gedurende 4 uur; TIMP-1 werd geadsorbeerd op de GO. Uit de analyse bleek dat 75 ± 1,2% van GO na 4 uur werd geabsorbeerd door TIMP-1, wat suggereerde dat GO zich efficiënt bindt aan TIMP-1-eiwit (figuur 1c). We onderzochten de chemische samenstelling van TIMP-1-GO met behulp van FTIR-spectroscopie (figuur 2b). De golfvorm en de golfpiek van GO waren significant verschillend van die van TIMP-1-GO. We hebben de thermische gravimetrische analyse tussen controle GO en TIMP-1-GO verder onderzocht (figuur 2d). De curve van thermische gravimetrische analyse toonde geen merkbare verschillen tussen controle GO en TIMP-1-GO.

TIMP-1-release

Verschillende concentraties TIMP-1 (groep 1 3 g/ml, groep 2 2 μg/ml en groep 3 10 g/ml) werden op GO geladen. De cumulatieve afgifteprofielen van TIMP-1 worden getoond in figuur 2c. De afgifte van 2 μg/ml TIMP-1-GO bereikte sneller 50% cumulatieve afgifte in vergelijking met de dosis van 10 en 30 μg/ml TIMP-1. TIMP-1 werd gedurende ongeveer 40 dagen continu vrijgegeven. Dit suggereert dat de toepassing van TIMP-1 ingebed in GO een geschikt systeem kan zijn voor langdurige TIMP-1-afgifte (Fig. 2c).

Celproliferatie en levensvatbaarheid op TIMP-1-GO

De proliferatie en levensvatbaarheid van rattenfibroblasten gekweekt in controle, GO en TIMP-1, waren niet merkbaar verschillend van die van de cellen die waren gekweekt in de verschillende monsters van TIMP-1-GO (p> 0,05). De celcyclus en apoptose van fibroblasten gekweekt in controle, GO en TIMP-1, waren niet merkbaar anders dan die van cellen gekweekt in de monsters van TIMP-1-GO (p> 0.05) (Fig. 3a–c).

Het effect van TIMP-1-GO op de proliferatie en levensvatbaarheid van rattenfibroblastcellen. een De levensvatbaarheid van fibroblasten gekweekt in verschillende groepen vertonen geen significante verschillen in verschillende tijdstippen (p> 0,05). b De celcyclus van fibroblast was niet significant verschillend van die van cellen gekweekt in verschillende groepen (p> 0,05). c De celapoptose van fibroblast was niet significant verschillend van die van cellen die in verschillende groepen waren gekweekt (p> 0,05)

Werkzaamheid van TIMP-1-GO in excisiemodel voor huidwonden

TIMP-1-GO werd subcutaan toegediend aan ratten om te bepalen of het de genezing van de experimentele wond kon bevorderen. Vier weken na de operatie vertoonden, in vergelijking met de controlegroep, huidafwijkingen die werden behandeld met TIMP-1-GO significante verschillen in terminale punt (p < 0,05), terwijl huidafwijkingen behandeld met TIMP-1 significante verschillen vertoonden met de controlegroep en de GO-groep op het eindpunt (p < 0.05). Bovendien vertoonde de TIMP-1-GO-groep een versterkt therapeutisch effect bij de regeneratie van haarzakjes (p < 0.05). Huidafwijkingen behandeld met TIMP-1 vertoonden significante verschillen met controlegroep en GO-groep in eindpunt (p < 0.05) (Fig. 4b).

In vivo-experiment. een Schema en het VIB en model. b Histologische en immunohistochemische analyse in vivo (1 cm). Continue collageenvezel is zichtbaar in de TIMP-1-GO-groep. c Kwantitatieve beoordeling bracht significante verschillen aan het licht tussen controle en GO vergeleken met TIMP-1 en TIMP-1-GO (p <0,05). De haarzakjes van verschillende groepen waren significant verschillend (p <0,05). Huidafwijkingen behandeld met TIMP-1 vertoonden significante verschillen met de controlegroep en de GO-groep per semi-kwantitatief (p < 0.05)

Histologische en immunohistochemische analyse

Histologische kenmerken van huidregeneratie na behandeling met PBS worden weergegeven in figuur 4b. De kenmerken in controlegroepen na huidafwijkingen tonen gebroken collageenvezels zichtbaar in de monsters 4 weken na de behandeling. Daarentegen is continue collageenvezel zichtbaar in de TIMP-1-GO-groepen op hetzelfde tijdstip en vertoont een statistisch verschil met de controlegroep. Immunohistochemische kenmerken van vascularisatie na behandeling van TIMP-1-GO worden weergegeven in Fig. 3c. CD34+ subcutane cellen zijn zichtbaar in de monsters na 4 weken in de met TIMP-1-GO behandelde groepen. De kwantitatieve beoordeling bracht significante verschillen aan het licht tussen de controlegroepen en de TIMP-1-GO-behandelingsgroep (p < 0.05) (Fig. 4c).

Discussie

In de huidige studie hebben we een mogelijke nieuwe benadering geanalyseerd voor het verbeteren van excisiewondherstel door recombinant TIMP-1-eiwit te combineren met gecontroleerde afgifte van GO. GO heeft in vitro een goede biocompatibiliteit aangetoond. En het is aangetoond dat TIMP-1 gedurende maximaal 40 dagen continu wordt vrijgegeven uit het GO-voertuig. Het is aangetoond dat de combinatie van TIMP-1 met GO de vascularisatie en collageenregeneratie bevordert in een experimenteel huiddefectmodel.

Een verscheidenheid aan biomedische materialen is geëvalueerd als therapievehikels voor de afgifte van middelen bij weefselregeneratie. Hulpmiddelen zoals collageen, zijde, titanium, calciumfosfaatcement en polymelkzuur-polyglycolzuur hebben de neiging om een ​​snelle afgifte van biologisch agens te produceren, wat in sommige therapie-instellingen ongewenst kan zijn [23]. Daarom kan het vermogen van een biomedische vector om te voorzien in een langzame continue afgifte van biologische moleculen als een belangrijk kenmerk worden gezien. Een vereiste voor deze kwaliteit is een flexibel die wordt gebruikt om het medicijn te laden met behulp van een elektrische lading [24]. Grafeenoxide (GO) biedt een "off-start" -effect dat nuttig is gebleken voor de langzame afgifte van verschillende biologische agentia, zowel in vitro als in vivo [25,26,27]. Hier hebben we aangetoond dat GO kan worden gebruikt om een ​​aanhoudende afgifte van recombinant humaan TIMP-1-eiwit uit te oefenen. De interactie tussen hydrofobe π domeinen van GO en elektrostatische interactie kunnen de negatief geladen domeinen van GO activeren en efficiënte TIMP-1-eiwitabsorptie via de binnenste hydrofobe gebieden mogelijk maken. De lange afgifte van TIMP-1 van GO is bij uitstek geschikt voor de noodzakelijke revascularisatie bij huidwondherstel.

Er wordt gesuggereerd dat koolstofdeeltjes met een concentratie van meer dan 50 mg/ml in weefsels kunnen worden afgezet [28]. Wang et al. suggereerde dat dit ontstekingsreacties kan veroorzaken vanwege de extreem kleine diameter en toch een groot functioneel oppervlak van GO [29]. In tegenstelling tot eerdere studies werd GO-afzetting niet gedetecteerd in onze studie. Gezien het ontbreken van een duidelijke bijwerking die hier wordt gezien, kan het potentiële negatieve van GO-nanodeeltjes niet worden ondersteund. Verdere studies hebben gesuggereerd over grafeen, waaronder biologische respons en veiligheidstest [30].

Het onderzoek naar het effect van de interactie van het grafeenoxide op cellen is een belangrijk onderwerp. Grafeen is een nieuw ontwikkeld biomedisch materiaal waarvan de eigenschappen suggereren dat het in veel biologische toepassingen kan worden gebruikt. De potentiële biologie van tweedimensionale koolstofstructuur/grafeentoxicologie en algemene biologische interacties zijn echter niet volledig begrepen, wat uitgebreide aanvullende studies vereist.

Conclusie

Grafeenoxide (GO) vertoont aanhoudende biocompatibiliteit bij gebruik als vehikel voor de langzame afgifte van recombinant TIMP-1. Het is aangetoond dat TIMP-1 gedurende maximaal 40 dagen continu door GO wordt afgegeven, en het is aangetoond dat de combinatie van TIMP-1 met GO de revascularisatie en collageenregeneratie bevordert in een huidregeneratiemodel.