Silica-nanodeeltjes voor intracellulaire eiwitafgifte:een nieuwe synthesebenadering met behulp van groene fluorescerende eiwitten

Resultaten en discussie

Deze studie is gericht op het functionaliseren van silica-nanodeeltjes met GFP onder geschikte omstandigheden die de biochemische kenmerken en functionaliteit van het eiwit behouden. In eerder werk hebben we bijna met IR-kleurstof gedoteerde monodisperse fluorescerende silica-nanodeeltjes in het groottebereik tussen 15 en 80 nm gesynthetiseerd, met behulp van een ʟ-arginine-gecontroleerde hydrolyse van tetraethoxysilaan (TEOS) in een bifasisch cyclohexaan/watersysteem [26]. Hier hebben we deze syntheseprocedure aangenomen om GFP, als een modeleiwit, in de silicamatrix in te bedden. In Schema 1 is de procedure voor de deeltjessynthese schematisch weergegeven. GFP-gedoteerde en niet-gedoteerde structuren (kern/schillen) zijn respectievelijk groen en grijs gemarkeerd. In een eerste stap werden GFP-gedoteerde silicakerndeeltjes (C_F ) waren verkregen. Daaropvolgende hergroeistappen (C_F S₁ en C_F S₁ S₂ ) maakte de synthese van grotere deeltjesgroottes mogelijk. Tijdens de eerste hergroeistap werd de schaal gewijzigd met (C_F S_1F ) of zonder (C_F S_1U ) opname van eiwitten. Evenzo, in de tweede hergroeistap, ofwel een gelabelde (C_F S_1F S_2F , C_F S_1U S_2F ) of een niet-gelabelde (C_F S_1F S_2U , C_F S_1U S_2U ) shell is toegevoegd. Deze variaties zorgen voor een uitstekende controle over de hoeveelheid ingebed eiwit en de op maat gemaakte rangschikking ervan in aangewezen omhulsels of de deeltjeskern. Bovendien, pure silica nanodeeltjes zonder ingebedde GFP (C_U , C_U S_1U , en C_U S_1U S_2U ) werden gesynthetiseerd om een ​​mogelijke invloed van de eiwitinbedding op de deeltjeseigenschappen te onderzoeken. Bovendien werd voor al deze stappen het GFP opgelost in twee verschillende buffersystemen (ʟ-arginine en NaHCO₃ ) van verschillende pH-waarden, om de invloed van het eiwitoplosmiddel op de deeltjessynthese, de morfologie, de fluorescentie-intensiteit, de emissiegolflengte en de ζ-potentiaal te bepalen.

Overzicht van de gesynthetiseerde deeltjes en hun deeltjesstructuur. Groene kleur geeft aan dat GFP is ingebed in respectievelijk de kern of de schelpen. Grijze kleur vertegenwoordigt de schelpen zonder enige GFP (C_F = kern fluorescerend, C_U =kern zonder label, S_F = omhulsel fluorescerend, S_U =shell zonder label, S₁ = eerste schaallaag, S₂ = tweede schaallaag)

Nanodeeltjeskarakterisering

Bepaling van fysieke deeltjesattributen

Om de deeltjesgrootte en morfologie na opname van GFP te beschrijven en om de invloed van de twee verschillende buffersystemen op deze eigenschappen te bepalen, werden TEM-beelden opgenomen (Fig. 1). Verdere TEM-beelden van GFP(NaHCO₃ ) gewijzigd, GFP(ʟ-arginine) gewijzigd en niet-gelabelde nanodeeltjes worden gepresenteerd in de SI (aanvullend bestand 1:figuur S1, aanvullend bestand 2:figuur S2, aanvullend bestand 3:figuur S3, aanvullend bestand 4:figuur S4). Na de syntheseprocedure met twee hergroeistappen werden drie verschillende deeltjesgroottes verkregen. De kerndeeltjes hadden een grootte van ongeveer 15 nm, de deeltjes na de eerste hergroeistap ongeveer 22 nm en de deeltjes na de tweede stap ongeveer 32 nm. Samengevat waren alle nanodeeltjes ongeveer bolvormig en vertoonden ze een smalle grootteverdeling (p < 10%). De drie generaties volledig geverfde GFP(ʟ-arginine) nanodeeltjes (C_F , C_F S_1F , en C_F S_1F S_2F ) en de GFP(NaHCO₃ ) (C_F ) kern nanodeeltjes werden gekozen als model.

TEM-beelden van drie generaties GFP-ʟ-arginine-gemodificeerde nanodeeltjes en kerndeeltjes van GFP(NaHCO₃ ) gemodificeerde nanodeeltjes. In een , c en d , worden de drie generaties GFP(ʟ-arginine) getoond:C_F kerndeeltjes (a , d_TEM =15,5 ± 1,1 nm); C_F S_1F nanodeeltjes na de eerste hergroeistap (kern + schil 1) (c , d_TEM = 23.5 ± 2.0 nm) en C_F S_1F S_2F na de tweede hergroeistap (core + shell 1 + shell 2) (d , d_TEM =35,3 ± 2,0 nm). In b , de GFP(NaHCO₃ )-gelabelde kern nanodeeltjes (d_TEM = 15.2 ± 1.2 nm) worden weergegeven

Als we de grootte van de verschillende met GFP gedoteerde en niet-gelabelde nanodeeltjes vergelijken (Tabel 1), is het opmerkelijk dat hetzelfde aantal hergroeistappen resulteerde in dezelfde gemiddelde deeltjesgrootte, onafhankelijk van de aanwezigheid van eiwit of de gebruikte bufferoplossing. De niet-gelabelde deeltjes hadden ook vergelijkbare groottes (C_U :d_TEM = 13.4 ± 0.4 nm, d_DLS = 10 ± 3 nm; C_U S_1U :d_TEM = 20.9 ± 1.3 nm, d_DLS = 20 ± 6 nm; C_U S_1U S_2U :d_TEM = 33.2 ± 1.0 nm, d_DLS = 38 ± 10 nm).

Concluderend werd aangetoond dat de opname van eiwit in de silicamatrix en de bufferoplossing, waarin het eiwit werd verschaft, geen significante invloed had op de resulterende deeltjesgrootte en morfologie.

Voor zover wij weten, zijn er geen andere GFP-ingebedde silica-nanodeeltjes beschreven in de literatuur, die vergelijkbare kleine afmetingen en even smalle grootteverdelingen vertonen (<-10%) [20, 27]. Dergelijke kleine nanodeeltjes hebben een veelbelovend toepassingspotentieel op het gebied van intracellulaire eiwitafgifte, evenals bij de diagnose en therapie van kanker [28].

ζ-Potentieel

Het ζ-potentieel van alle nanodeeltjes werd bepaald door middel van berekeningen met behulp van hun elektroforetische mobiliteit. Alle soorten gedoteerde nanodeeltjes vertoonden een negatief ζ-potentiaal met absolute waarden variërend van -28 tot -36 mV (figuur 2). Ter vergelijking:de ζ-potentiaal van niet-gelabelde deeltjes geeft zeer vergelijkbare waarden aan met − 35,5 ± 2,0 mV voor de kerndeeltjes, − 34,0 ± 3,7 mV na de eerste hergroeistap en − 34,5 ±-1,2 mV na de tweede hergroeistap. Deze zeer negatieve ζ-potentiaal (< − 28 mV) waarden duiden op een hoge stabiliteit van de nanodeeltjes tegen agglomeratie als gevolg van elektrostatische afstoting. Vergeleken met het ζ-potentieel van niet-gelabelde nanodeeltjes, geven de gegevens aan dat noch de resulterende deeltjesgrootte, noch de opname van GFP in de deeltjesmatrix van de deeltjeskern of -schil een significante invloed had op de deeltjeslading.

ζ-potentiaal [mV] van gelabelde nanodeeltjes. De nanodeeltjes werden bereid uitgaande van GFP opgelost in 7,2 mM ʟ-arginine of 10 mM NaHCO₃ . Foutbalken geef de standaarddeviatie aan die is afgeleid van drie metingen

Spectroscopie-onderzoeken

Fluorescentiespectroscopie

Alle GFP-gedoteerde silica-nanodeeltjes vertoonden een vergelijkbaar emissiemaximum (λ _em = 508 nm), wat ook vergelijkbaar was met het emissiemaximum van gratis GFP (SI, Aanvullend bestand 5:Figuur S5). Om de fluorescentie-intensiteit van de verschillende gelabelde nanodeeltjes te vergelijken, werd de nanodeeltjesconcentratie genormaliseerd (berekeningen in SI 5.). Zoals verwacht veroorzaakte de stapsgewijze toevoeging van gelabelde schelpen een toename van de fluorescentie van de nanodeeltjes (Fig. 3).

Genormaliseerde fluorescentie-intensiteit van het emissiemaximum bij 508 nm, voor elk van de verschillende deeltjessystemen. Verder is de theoretische fluorescentie-intensiteit (grijze punten ) van de deeltjes in relatie tot de toename van het deeltjesvolume wordt weergegeven

Nanodeeltjes met alleen een gelabelde kern, maar met niet-gedoteerde omhulsels, vertoonden de laagste fluorescentie. Nanodeeltjes met één extra, gelabelde schil vertoonden een intermediaire fluorescentie, en nanodeeltjes met twee gelabelde schillen vertoonden de sterkste fluorescentie (Fig. 3). Opmerkelijk was dat de toevoeging van een niet-gedoteerde buitenste schil de fluorescentie van nanodeeltjes enigszins leek te verminderen in vergelijking met nanodeeltjes met een gedoteerde buitenlaag. Dit effect kan worden uitgelokt door afschermende effecten van de niet-gelabelde silicaschaal. Samenvattend, de toevoeging van met GFP gedoteerde schelpen aan kerndeeltjes veroorzaakte een toename van de fluorescentie-intensiteit van de resulterende nanodeeltjes die gecorreleerd leek te zijn met de volumeverandering die gepaard gaat met de groei van nanodeeltjes.

De inbedding van GFP dat aanvankelijk was opgelost in ʟ-arginine na zuivering resulteerde in een 1,3 maal hogere fluorescentie-intensiteit van de resulterende nanodeeltjes in vergelijking met de nanodeeltjes verkregen via het analoge inbeddingsproces uitgaande van GFP opgelost in NaHCO₃ . Evenzo vertoonde GFP verdund in ʟ-arginine een hogere fluorescentie-intensiteit vergeleken met GFP verdund in NaHCO₃ (Extra bestand 5:Figuur S5). Het effect kan worden verklaard door de verschillende pH-waarden van de buffers (pH_ʟ-arginine = 10.3, pH\( _{{\mathrm{NaHCO}}_3} \) = 9.2).

Om deze reden werd de fluorescentie van de pure GFP systematisch gemeten als een functie van de pH-waarde (SI, aanvullend bestand 6:figuur S6). De gegevens toonden een hyperbolisch gevormde toename van de fluorescentie met toenemende pH in het bereik van pH 5,5 - 10,5. De resultaten zijn consistent met andere rapporten over pH-afhankelijke fluorescentie van GFP. Voor wildtype GFP is gemeld dat de fluorescentie ongewijzigd is in het bereik van pH 6 - 10, maar afneemt bij een lagere pH en toeneemt bij pH-waarden> 10 [29]. Bovendien zou de pH-gevoeligheid van GFP kunnen worden gewijzigd door het introduceren van puntmutaties [30]. De GFP die in deze studie is gebruikt, heeft driepuntsmutaties in vergelijking met de Aequorea wildtype eiwit, namelijk S2A, F64L, S65T. Hiervan is aangetoond dat de substitutie van serine op positie 65 tegen threonine de fluorescentie-intensiteit van het eiwit verhoogt, wanneer het wordt geëxciteerd bij 480 nm, aangezien dit aminozuur betrokken is bij de vorming van de chromofoor. Bovendien vertoont de S65T/F64L-variant een pH-afhankelijke fluorescentie [30]. De met GFP gedoteerde nanodeeltjes (C_F ) vertoonden een vergelijkbare pH-afhankelijke fluorescentie (Fig. 3), wat aangeeft dat het mechanisme van pH-afhankelijkheid niet werd beïnvloed door het inbeddingsproces.

Fluorescentie kwantumopbrengst

Om de eigenschappen van de fluorescerende nanodeeltjes verder te karakteriseren, werden hun kwantumopbrengsten bepaald. Dit werd bereikt door de geïntegreerde fluorescentie-intensiteit uit te zetten tegen de absorptie bij 488 nm (figuur 4). Vervolgens werden de kwantumopbrengsten berekend met behulp van Vgl. 2. Met rhodamine 6G als referentie, de kwantumopbrengsten van de met GFP gedoteerde nanodeeltjes C_F S_1F en de zuivere GFP werd bepaald als φ\( _{{\mathrm{C}}_{\mathrm{F}}{\mathrm{S}}_{1\mathrm{F}}} \) = 0.62 en φ_pureGFP =0,38, respectievelijk. De resultaten werden bevestigd door Atto488 als tweede referentie te gebruiken (SI, aanvullend bestand 7:figuur S7). De hogere kwantumopbrengst van met GFP gedoteerde nanodeeltjes in vergelijking met de zuivere GFP leek te worden veroorzaakt door de inkapseling van GFP in de silicamatrix en kon ofwel worden gekoppeld aan de ruimtelijke immobilisatie van het eiwit of de veranderde chemische omgeving die door de silicamatrix wordt verschaft .

Plots van geïntegreerde fluorescentie-intensiteit van GFP-gedoteerde deeltjes en pure GFP versus absorptie bij 488 nm. Rhodamine 6G werd als referentie gebruikt. De lineaire correlatie werd aangepast door de rechte lijnen . De bijbehorende lineaire vergelijkingen zijn als volgt:y _pureGFP = 1.00554 × 10 ¹⁰ × x , R ² = 0.97712; y\( _{C_F{S}_{1F}} \) = 6.12332 × 10 ⁹ × x , R ² = 0.99331; j _rhodamine6G = 4.1772 × 10 ⁹ × x , R ² = 0.99678

Stabiliteit van deeltjes

Eiwitlekkage

Uitloogexperimenten werden uitgevoerd om de bindingsstabiliteit van de met GFP gedoteerde nanodeeltjes te bewijzen. Na ultrafiltratie door membranen met een MWCO die de doorgang van GFP (MW ~ 27 kDa) mogelijk maakt maar nanodeeltjes vasthoudt, kon geen fluorescentie worden gedetecteerd in het filtraat, wat wijst op een permanente koppeling van GFP aan de silicamatrix.

Analytische ultracentrifugatie

Om de verkregen resultaten te ondersteunen en om het type GFP-binding aan de deeltjesmatrix te bepalen, werd analytische ultracentrifugatie uitgevoerd. Voor dit doel, gelabeld C_F S_1F S_2F deeltjes en ongelabelde C_U S_1U S_2U particles mixed with GFP were measured at the same particle and GFP concentrations. The results (Additional file 8:Figure S8 in the SI) indicate that most of the GFP molecules are embedded into the silica matrix during the synthesis.

Thermal Stability

To determine their thermal stability, the fluorescence signals of C_F in comparison to pure GFP were measured after incubation at room temperature and 60 °C respectively (Fig. 5). After 24 h at room temperature, no decrease in the fluorescence of both samples was detectable, indicating no influence on the protein stability. However, after 24 h at elevated temperature of 60 °C, only 20% of the initial fluorescence intensity of C_F could be observed, whereas no fluorescence signal of pure GFP reverted. This strongly indicates a higher thermal stability of GFP-embedded silica compared to pure GFP. Since an elevated temperature leads to a significant increase in the thermal motions of the protein molecule, which can disrupt its structure, it is hypothesised that the surrounding silica matrix protected the GFP against external influences by spatial constraints.

Influence of temperature (r.t., 60 °C) on the fluorescence of GFP-doped particles (C_F , ʟ-arginine) and pure GFP. The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm versus time [h] is shown

Photostability

Furthermore, the photostability of the samples was tested. For measurements, the nanoparticle stock suspension (C_F , ʟ-arginine) was diluted tenfold. Pure GFP was diluted in ʟ-arginine according to the calculated concentration of GFP in the nanoparticle suspension. After exposure of the samples to light of a green LED array over a period of time up to 20 min, the fluorescence intensity was measured (Fig. 6). Within 20 min, the fluorescence intensity of the nanoparticle suspension decreased only slightly. After 20 min, 89% of the initial fluorescence (100%) of the nanoparticles was preserved. In comparison, the pure GFP seemed to be more affected by light exposure. After 20 min, only 81% of the initial fluorescence of pure GFP remained. This result indicated, that GFP, when embedded into silica nanoparticles, was better protected from photochemical alterations induced by the LED light than the pure protein.

Photostability of GFP-doped nanoparticles (C_F ) and pure GFP in ʟ-arginine. The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm was measured after exposure to LED light for the given times. Data are mean values. Error bars indicate the standard deviation

Stability Against Protein Degradation

As a further characterisation step, the degradation of GFP in the presence of proteinase K was tested. Therefore, three different systems were used (pure GFP, unlabelled C_U S_1U S_2U mixed with GFP and labelled C_F S_1F S_2F ). For all systems, equal amounts of GFP and particles were used. After 90 min of incubation, the fluorescence intensity of pure GFP and unlabelled particles with added GFP decreased to 5 - 7% of the initial fluorescence intensity, whereas the one of the labelled particles decreased to 52% (Fig. 7). This result indicates that the GFP is protected by the silica matrix and is degraded slower than free GFP in presence of proteolytic enzymes.

Stability against protein degradation of pure GFP (grey ), unlabelled particles mixed with GFP (C_U S_1U S_2U , blue ), and GFP-doped silica nanoparticles (C_F S_1F S_2F , green ). The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm was plotted against the incubation time [min] with proteinase K

To conclude, the encapsulation of GFP into silica matrix appeared to bring about significant advantages:The stability of the protein was increased not only against elevated temperatures and light-induced photobleaching but also against the degradation through enzymes. Therefore, the silica matrix seems to protect the embedded GFP as compared to the free GFP.

Cellular Uptake Experiments

In order to determine, if the GFP-doped nanoparticles are able to deliver their cargo into cells, uptake experiments were performed (Fig. 8). A549 cells were exposed to GFP-doped nanoparticles and for comparison to the pure protein. In order to optimise the GFP load of the particles for imaging, a higher amount of GFP as compared to the nanoparticles described before was embedded into the particles. More specifically, a 20-fold amount of GFP in ʟ-arginine was used to label the second shell of the C_F S_1F S_2F particles. These nanoparticles were diluted to a final concentration of 37 μg SiO₂ per millilitre in cell culture medium and incubated for 24 h with the cells. The amount of GFP in both samples (nanoparticles and pure GFP) was 5 μg mL ⁻¹ .

Confocal microscopy images of A549 cells after 24 h exposure to GFP dissolved in ʟ-arginine (A1 –A3 ) and GFP-doped nanoparticles C_F S_1F S_2F (B1 –B3 ), and control cells (C ). Top (1):merge-images; middle (2):Cell membrane (WGA):red; bottom (3):GFP, green . Arrows indicate internalised nanoparticles. Contrast and brightness were enhanced by using the ImageJ software

In order to visualise the cells, the cell membrane was labelled, using tetramethylrhodamine-coupled WGA (wheat germ agglutinin). Confocal imaging was used to localise the GFP-doped nanoparticles and the pure GFP in the cells. After exposure of cells to GFP, no signal related to GFP was observed inside the cell bodies (Fig. 8a). Compared to the control cells, no difference in signal intensity of both channels could be observed (Fig. 8c).

In contrast, after exposure of the cells to the GFP-loaded nanoparticles, bright fluorescence signals were detected in the perinuclear region, indicating internalisation of the loaded nanoparticles through endocytosis. The GFP-loaded nanoparticles appeared to be excluded from the nuclear compartment. A second fraction of agglomerated nanoparticles was detected on top of the cell membrane (Fig. 8b).

In conclusion, the GFP-doped nanoparticles are internalised by the cells and are able to transport their cargo into the cells. After exposure of the cells to GFP, fluorescence signals were not detected inside the cell body. This finding is in line with the results of Pesce et al. [31], who did not observe cell-associated fluorescence after incubation of A549 cells with GFP for 24 h. The lack of cell-associated GFP signals might be due to the fact that GFP is not internalised by the cells. Alternatively, GFP fluorescence might be quenched by the low pH value present in endocytic vesicles or lysosomes or degraded by proteolytic enzymes. Therefore, the fluorescence signals of the nanoparticles might indicate a protective effect of the silica nanoparticle matrix against lysosomal degradation.