Nanodeeltjes van zwarte fosfor bevorderen osteogene differentiatie van EMSC's door verhoogde TG2-expressie

Materialen en methoden

Nanodeeltjes van zwarte fosfor

Bulk BP werd gekocht van door Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd. Dimethylsulfoxide (DMSO), natriumhydroxide (NaOH) en N -methyl-2pyrrolidon (NMP) werden geleverd door Aladdin Industrial Co., Ltd. Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) werd verkregen van Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium/nutriëntenmengsel F12 (DMEM/F12; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences), streptomycine, penicilline, foetaal runderserum (FBS), werden verkregen van BI Science and Technology Co., Ltd.

BP-synthese was vergelijkbaar met die in eerdere rapporten met kleine wijzigingen [24]. Eerst werd 20 mg bulk BP ondergedompeld in verzadigde NaOH/NMP-oplossing en verfijnd met een mechanische maalmethode. Het mengsel werd vervolgens 10 min bij 1500 rpm gecentrifugeerd, waarna het neerslag werd weggegooid. Daarna werd het mengsel 6 uur gesoniceerd in een ijs / waterbad en het mengsel werd vervolgens gefiltreerd door een 100 μm BD Falcon-filter (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Ten slotte werd de suspensie verder gecentrifugeerd (10 min bij 13.000 rpm, 4 °C) en werd het neerslag opgevangen.

Immunofluorescentiekleuring van de EMSC's in het neusslijmvlies

Om de EMSC's in vivo te tonen, werd het ademhalingsslijmvlies van het neustussenschot ontleed en vervolgens gedurende de nacht gefixeerd in 4% PFA voor immunofluorescentiekleuring. De weefsels werden gewassen met PBS en vervolgens gedehydrateerd met gradiënt-sucroseoplossingen. De weefsels werden ingebed in OCT (Sakura Finetek, Japan) voor cryosectie en werden gesneden in coronale seriële secties met een dikte van 25 mm met behulp van een Leica cryo-microtoom. Deze secties werden gedurende 10 minuten in PBS gewassen en gepermeabiliseerd met 1% runderserumalbumine en 0,1% Triton-X 100 in PBS. EMSC's in het neusslijmvlies werden immunofluorescentie gekleurd met het primaire antilichaam van anti-nestine en het Cy3-geconjugeerde secundaire antilichaam. De parallelle negatieve controles werden onderworpen aan dezelfde procedures zonder primaire antilichamen. De gekleurde weefsels werden waargenomen onder een immunofluorescentiemicroscoop (AxioObserver, ZEISS, Duitsland).

Celcultuur

Alle dier procedures werden goedgekeurd door de Jiangnan University Animal Care and Ethics Committee, en de internationale richtlijnen voor dieronderzoek werden strikt gevolgd in deze studie. Primaire ectomesenchymale stamcellen werden geïsoleerd uit respiratoire mucosa van ratten volgens onze eerdere studies [17, 25]. In het kort werden 100 g volwassen Sprague Dawley (SD)-ratten verdoofd met intraperitoneale injecties van pentobarbital-natrium (0,05 g/kg). Het middelste derde deel van het neustussenschot werd fijngehakt en vervolgens gedurende 25 minuten bij 37 ° C in een 0,25% trypsine-oplossing (Hyclone; GE Healthcare Life Sciences) geïncubeerd, waarna het slijmvlies van het neustussenschot voorzichtig werd verwijderd. Tenslotte werd het slijmvliesweefsel van het neustussenschot in stukken gesneden. De resulterende suspensie van de weefsels werd door een zeef van 100 um nylon gaas geleid, gedurende 5 minuten bij 1000 g gecentrifugeerd en vervolgens tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De weefselsuspensie werd in een celkweekkolf in groeimedium (DMEM/12 bevatten 10% FBS, 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine) geplaatst en bij 37°C in 5% CO2 gekweekt. /sub> en 95% lucht met een verzadigde luchtvochtigheid. Het medium werd elke drie dagen vervangen en de cellen werden elke week gepasseerd. Cellen in hun derde passage werden gebruikt voor alle karakteriseringsstudies. Immunofluorescentie werd uitgevoerd om de gekweekte cellen te karakteriseren met antilichamen tegen stamcelmarkers, waaronder vimentine en nestine [26].

Identificatie van multidirectionele differentiatie van EMSC's

De EMSC's werden gezaaid in de platen met 6 putjes en gekweekt met DEME/F12-medium gedurende 24 uur tot 70% confluentie. Het medium werd vervolgens vervangen door osteogeen differentiatiemedium (DMEM aangevuld met 10% FBS, 0,1 mM dexamethason, 10 mM a-glycerofosfaatdinatrium en 0,2 mM l-ascorbinezuur) om osteogenese te induceren. Het medium werd om de zeven dagen vervangen en kleuring met Alizarin Red S werd uitgevoerd met 0,5% Alizarine Red S (Sigma-Aldrich) op dag 28. EMSC's die waren gegroeid tot 90% confluentie werden gekweekt in adipogeen differentiatiemedium om adipogenese gedurende 21 dagen te induceren. De olieroodkleuring is uitgevoerd met de olieroodkleuringskit (Solarbio) volgens de instructies van de fabrikant.

Karakterisering van borderliners

Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) werd gebruikt om de morfologie en grootte van BP te karakteriseren. Monsters werden bereid door een druppel van de BP-oplossing met een concentratie van 1 mg/ml in gedeïoniseerd water op een met formvar bekleed koperen rooster te plaatsen en vervolgens aan de lucht te drogen. Monsters werden gefotografeerd door scanning elektronenmicroscopie (H-7500; Hitachi, Tokyo, Japan). De gemiddelde grootte van de BP's werd geanalyseerd met behulp van image Pro Plus-software (Media Cybernetics Inc., MD, VS). De evaluatie van het zeta-potentieel werd bevestigd door Malvern zeta sizer (ZEN3600). Röntgendiffractie (XRD) werd uitgevoerd met een Bruker D8 Discover-diffractometer in een Bragg-Brentano para-gefocusseerde geometrie en Cu Ka-straling. Diffractiepatronen werden verzameld tussen 10° en 80° van 2θ met een stap van 0,01° 2θ en acquisitietijd van 0,2 s per stap. De resulterende gegevens werden geëvalueerd met behulp van HighScore Plus 3.0e-software. Raman-spectrometer (LabRam HR800) met 514 nm laserexcitatie werd gebruikt om de Raman-spectra van het monster te meten. De oppervlaktesamenstelling van het monster werd gemeten door middel van röntgenfoto-elektronspectroscopie ([XPS] Omicron NanoTechnology GmbH, Duitsland).

Cell Counting Kit‑8 (CCK‑8) Assay

Het effect van BP's op celproliferatie werd geëvalueerd met behulp van de celtellingskit (CCK-8)-assay. In het kort werden EMSC's (3000 cellen/putje) uitgeplaat in platen met 96 putjes en behandeld met BP's (0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 en 512 g/ml) gedurende 24 uur bij 37 °C. Voor CCK8-detectie werd 4 uur vóór analyse 10 μl CCK8-reagens aan het kweekmedium toegevoegd. Optische dichtheid (OD) bij 450 nm werd gemeten met behulp van een microplaatlezer (Thermo Fisher Scientific, Madrid, Spanje) volgens de instructies van de fabrikant. De concentratie van BP's die voor verder onderzoek werd gebruikt, werd geselecteerd op basis van de resultaten van de CCK-8-assay. Wat betreft Ki-67-kleuring, EMSC's (1 × 10 ⁴ ) werden gekweekt in platen met 24 putjes en gekleurd door immunofluorescentie voor Ki-67 (polyklonaal konijn; cat. nr. ab15580; abcam; 1:300). DAPI werd gebruikt om de kernen te kleuren. Beelden werden vastgelegd met fluorescentiemicroscopie (vergroting, 200×; eclipse Ti; nikon corporation) en geanalyseerd met Image Pro Plus-software.

Osteogene differentiatie

Voor osteogene differentiatie werden EMSC's gezaaid met een dichtheid van 3.000 cellen/cm ² en gekweekt in groeimedium tot 70% confluentie. Cellen werden vervolgens gedurende 2 weken geïnduceerd met osteogenese-differentiatiemedium. Om de invloed van β-natriumglycerofosfaat te vermijden, werd het differentiatiemedium voor osteogenese met name aangevuld met 10% FBS, 0,1 mM dexamethason en 0,2 mM l-ascorbinezuur (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS) maar niet met β-natriumglycerofosfaat. Na het induceren van differentiatie, werden alkalische fosfatase (ALP) en Alizarin-roodkleuring en RT-qPCR gebruikt om eventuele effecten van BP's op osteogene differentiatie van EMSC's te beoordelen. EMSC's werden gezaaid met een dichtheid van 2 × 10 ⁵ cellen/putje in platen met 6 putjes en geïncubeerd met osteogeen medium. Volgens de instructies van de fabrikant werd ALP-kleuring beoordeeld met behulp van een ALP-kleuringskit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) op dag 14. Alizarinerood S-kleuring werd toegepast om de afzetting van calciumfosfaat zichtbaar te maken. In het kort werden de gefixeerde cellen opnieuw gewassen met gedeïoniseerd water en geïncubeerd met 1 ml/putje Alizarine rood kleuroplossing (0,5% (w/v) Alizarine Red S (Sigma-Aldrich) in PBS gedurende 10 minuten bij 37 °C. Daarna de oplossing werd verwijderd, het monster werd opnieuw gewassen met gedeïoniseerd water. Positief kleurgebied dat de verkalkte knobbeltjes per veld aangeeft, werd geteld met Image-Pro plus-software en genormaliseerd naar de respectieve controle.

RT-qPCR

RT-qPCR werd uitgevoerd zoals eerder beschreven. In het kort, totaal RNA werd geïsoleerd uit monocultuur of gesorteerd met behulp van de RNA-zuiveringskit (TaKaRa, Japan), volgens de instructies van de fabrikant. Twee microgram mRNA werd omgekeerd getranscribeerd in cDNA met behulp van een cDNA-synthesekit (Fermentas). Primers die voor RT-PCR worden gebruikt, zijn ontworpen en gebouwd door Nanjing GenScript Bioengineering Technology and Services Co., Ltd (Nanjing, China), weergegeven in tabel 1. RT-PCR werd gemanipuleerd met behulp van een SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix-kit (Fermentas) met het ABI Prism 7500-systeem. De gegevens werden genormaliseerd naar glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) om relatieve expressieniveaus aan te geven. Alle metingen werden in drievoud uitgevoerd.

Western Blot

De gekweekte cellen werden tweemaal gewassen met PBS en vervolgens 30 minuten op ijs gelyseerd met RIPA-lysisbuffer die een cocktail van fosfatase en proteaseremmer bevat. Om de totale TG2 te verzamelen, werden de cellysaten en ECM in de platen met 6 putjes verzameld door een celschraper. De platen werden gewassen met PBS en de celwasvloeistoffen werden ook verzameld. De lysaten werden uit het supernatant geoogst door centrifugatie bij 12.000 × g gedurende 5 minuten, gemengd met een gelijk volume SDS-laadbuffer en vervolgens gedurende 5 minuten gekookt. Eiwitconcentraties werden bepaald met behulp van een BCA Protein Assay-kit (Beyotime, Shanghai, China, P0012). Eiwitten werden geëxtraheerd in RIPA-lysisbuffer, gescheiden op natriumdodecylsulfaat (SDS) polyacrylamidegels en elektroforetisch overgebracht op nitrocellulosemembranen (Millipore, LA, VS). Membranen werden geblokkeerd met 1% runderserumalbumine (BSA) in 0,01 M Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 0,5% Tween 20 (Suolaibao, Beijing, China) en geblot met de aangegeven antilichamen, waaronder anti-TG2 (1:200; sc-48387, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-FN (1:500; cat.nr. BA1772; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.) en anti-LN (1:500; cat.nr. BM4921; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.), anti-OCN (1:200; sc-390877, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-OPN (1:200; sc-73631, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti- COL I (1:500; cat. nr. BA0325; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.), bij 4 °C gedurende 12 uur. De membranen werden vervolgens gedurende 2 uur bij kamertemperatuur gereageerd met mierikswortelperoxidase-geconjugeerd geit-anti-konijn-IgG (1:5000; Boster, Wuhan, China). De eiwitbanden werden gevisualiseerd met behulp van een Pierce ECL Plus-substraat (Thermo Fisher Scientific) en vervolgens gescand met een Chemiluminescence Imaging System (Clinx Science Instruments, Shanghai, China).

Remming-experimenten

Om de betrokkenheid van TG2 te bevestigen, werden TG2-remmingsexperimenten uitgevoerd op EMSC's. Neutralisatie-experimenten werden uitgevoerd met een neutraliserend antilichaam tegen TG2 (van BD Biosciences, San Diego, CA). Cellen werden gezaaid in platen met 6 putjes met normaal kweekmedium gedurende 24 uur om te hechten en werden behandeld met anti-TG2-antilichaam (10 μg / ml). Tegelijkertijd werd de controlegroep ingesteld. Na 24 uur in platen met 6 putjes te zijn gezaaid, werd EMSC-osteogenese gedurende 14 dagen geïnduceerd met behulp van osteogeen medium met BP's (2 μg / ml) en het kweekmedium dat remmers bevatte, werd elke 7 dagen vervangen door vers osteogeen medium. Alizarine rood S-kleuring werd toegepast om de afzetting van calciumfosfaat zichtbaar te maken. Western blotting werd gebruikt om de niveaus van osteocalcine, osteopontine en collageen type 1 te bepalen (respectievelijk OCN-, OPN- en COL I-expressie).

Immunofluorescentiekleuring

De gekweekte cellen werden 8 uur bij 4 ° C gefixeerd met 4% paraformaldehyde. De gefixeerde cellen werden driemaal gewassen met PBS en gedurende 30 minuten gepermeabiliseerd in PBS met 0, 2% Triton X-100 en 1% BSA (Suolaibao, Beijing, China). Na permeabilisatie werden deze gefixeerde cellen gewassen met PBS en vervolgens 8 uur geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 ° C, gevolgd door verwijdering van alle primaire antilichamen. Cellen werden vervolgens drie keer gewassen met PBS en 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met secundaire antilichamen Alexa Fluor-594 (1:800, Life Technologies Molecular Probes, Carlsbad, CA, VS) bij 37 ° C gedurende 2 uur. De kernen werden tegengekleurd met 4′6-diamidino-2-fenylindol ([DAPI]; Sigma-Aldrich). Alle geteste groepen werden waargenomen onder een immunofluorescentiemicroscoop.

Statistische analyse

Gegevens werden verkregen uit de drie afzonderlijke experimenten die hierboven zijn beschreven en gepresenteerd als gemiddelde   ±   standaarddeviatie (SD). Analyse van de gegevensdistributie werd uitgevoerd met behulp van de t . van de student -test om de significantie van verschillen tussen de behandelde en controlegroep te analyseren. Eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) gevolgd door de Tukey post-hoc-test werd uitgevoerd om de significante verschillen tussen groepen te beoordelen. p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Karakterisering van borderliners

De BP-grootteverdeling gemeten door dynamische lichtverstrooiing (DLS) was relatief smal in het bereik van 100 tot 200 nm met een piekwaarde bij 132 nm. Het resultaat wordt getoond in Fig. 1A. Het zeta-potentieel van BP's werd bepaald als  − 23.7  ±  0.65 mV (Fig. 1B), wat de stabiliteit van de BP's bevestigt. De grootte van deeltjes werd verder onderzocht door middel van scanning elektronenmicroscopie (SEM) (Fig. 1C). De resultaten komen goed overeen met de meting van de deeltjesgrootteverdeling door DLS.

Karakterisering van borderliners. A Grootteverdeling van zwarte fosfor nanodeeltjes (BP's); B zeta-potentiaalrapport van BP's met een zeta-potentiaal van  − 23,7 ± 0,65 mV; C scanning elektronenmicroscopie (SEM) beelden van de BP nanosheets (BPN's). D Raman-spectra van BP's; E Röntgendiffractogram en F P 2p hoge-resolutie röntgenfoto-elektronenspectroscopie (XPS) spectra van BP's; G XPS-spectra van BP's

Raman-verstrooiing (Fig. 1D) onthulde drie prominente pieken bij 362,3, 438,5 en 466,9 cm ⁻¹ geassocieerd met de out-of-plane fonon-modus (A ¹ _g ) en twee in-plane modi (B ² _g en A ² _g ) van BP, [17, 18], respectievelijk. XRD (Fig. 1E) toont de fasezuiverheid van het bereide materiaal, met een gemiddelde kristallijne grootte van 102,7 nm. Verbreding van het diffractiepatroon geeft de nanometergrootte van individuele kristallieten aan. XPS-spectra met hoge resolutie van P 2 p (Fig. 1F) tonen de hoofdpiek bij 130 eV die overeenkomt met de P-P-binding van zwarte fosfor, naast een extra piek bij 135 eV afkomstig van P-O-bindingen veroorzaakt door oppervlakte-oxidatie van de BP's. BP-oppervlakken werden onderzocht met breedbeeld-röntgenstraling (Fig. 1G).

Karakterisering van EMSC's

De immunofluorescentiekleuring van het neusslijmvlies toonde aan dat de nestine-positieve EMSC's zich in de lamina propria onder het respiratoire epitheel van het neustussenschot bevonden (figuur 2A). De gekweekte EMSC's bij de derde passage verschenen als fibroblastische cellen en prolifereerden snel op plastic platen (figuur 2B). We evalueerden osteogene differentiatie in osteogeen medium door kleuring met alizarinerood op dag 28 (figuur 2C). De adipogene differentiatie in adipogeen inductiemedium werd op dag 21 beoordeeld door kleuring met olie-rood-O-oplossing (figuur 2D). Immunofluorescentiekleuring toonde aan dat bijna alle EMSC's tot expressie gebrachte neurale lijstcelmarkers, zoals nestin (>  95%) zoals getoond in Fig. 2E en vimentin (>~95%) zoals getoond in Fig. 2F. De resultaten voor de co-expressie van stamcelmarkers geven aan dat deze EMSC's een type mesenchymale stamcel zijn.

Identificatie van de ectodermale mesenchymale stamcellen (EMSC's). A De nestin-positieve EMSC's (cy3, rood) bevonden zich in de lamina propria onder het respiratoire epitheel van het neustussenschot; B Een fasecontrastbeeld toonde aan dat de gekweekte EMSC's bij de derde passage eruit zagen als fibroblastische cellen en zich snel vermenigvuldigden op plastic platen; C De osteogene gedifferentieerde EMSC's in osteogeen medium werden gekleurd door alizarinerood; D De adipogene gedifferentieerde EMSC's in adipogeen-inductiemedium werden gekleurd met olie rood-O; E , V Immunofluorescentiekleuring van de neurale lijstcelmarkers toonde aan dat bijna alle EMSC's nestine en vimentine tot expressie brachten. De IgG-Cy3 (rood) werd gebruikt als het tweede antilichaam voor de immunofluorescentiekleuring en de kernen werden tegengekleurd met Hoechst 33342 (blauw)

Cytotoxiciteit

Als inleidend experiment werd een CCK-8-assay uitgevoerd om de cytotoxiciteit van BP's te beoordelen. De levensvatbaarheid van EMSC's na 24 uur blootstelling aan de BP's wordt getoond in Fig. 3. Er werd geen significante cytotoxiciteit waargenomen na blootstelling tot 32 μg/ml BP's. Blootstelling aan BP's veroorzaakt echter significante cytotoxiciteit bij hogere doses (> 32 μg/ml). Ki-67-expressie in de nucleolus en chromosomen werd waargenomen in de groep met lage doses (Fig. 4A-C). De verhouding tussen de Ki-67-positieve kernen en de totale populatie van kernen vertoonde echter geen significant verschil in met lage dosis BP behandelde EMSC's in vergelijking met onbehandelde controles (Fig. 4D). Daarom kiezen we in de huidige studie voor concentraties van 2 en 4 μg/ml BP's in de volgende experimenten waarin geen significante cytotoxiciteit werd waargenomen.

De cytotoxiciteit van BP's. Cellen werden gedurende 24 uur behandeld met BP's (0, 2, 4, 8, 16, 32, 64.128, 256 en 512 µg/ml) en de levensvatbaarheid van EMSC werd getest door middel van een celtellingskit (CCK-8) proliferatietest (n = 9). Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde   ± standaarddeviatie (SD). **p < 0.01.

De evaluatie van celproliferatie van de met BPs behandelde groep. EMSC's werden 24 uur lang behandeld met BP's (0, 2 en 4 g/ml). Celproliferatie werd gemeten door immunofluorescentiekleuring met anti-Ki67-antilichaam (rood) en DAPI (blauw), en samengevoegde afbeeldingen werden getoond (A –C ). Ki67-positieve cellen onder 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)-positieve cellen werden geteld in twee krachtige velden in elk van de drie platen. Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD (D ).

Alizarin Red S-kleuring

Zoals getoond in Fig. 5A, werd mineralisatie in de cellen geëvalueerd door Alizarine rood S-kleuring na 14 dagen te zijn behandeld met het geconditioneerde medium. Calciumknobbeltjes werden allemaal waargenomen in drie groepen, terwijl ongevormde calciumknobbeltjes aanwezig waren in de controlegroep. Vergeleken met de controlegroep waren de calciumknobbeltjes die werden afgezet in de groepen van 2 en 4 μg/ml groter (p < 0,05), maar er werden geen duidelijke verschillen waargenomen tussen de behandelingsgroepen (p> 0.05) zoals weergegeven in Fig. 5C.

Alkalische fosfatase (ALP) en Alizarine Red-kleuringsassays. A Osteogeen-gedifferentieerde EMSC's gekleurd met Alizarine Red-oplossing op dag 14; B ALP-kleuring werd zichtbaar gemaakt onder een microscoop; C de grafiek toont de kwantificering van de rode depositiegebieden van Alizarin; D significant hogere ALP-activiteit werd aangetoond in de met BP behandelde EMSC's-groep dan die van de controlegroep. Gegevens werden uitgedrukt als het gemiddelde   ±  SD. **p < 0.01

ALP-tests

ALP-kleuring werd uitgevoerd om de osteogene differentiatie van EMSC's te bestuderen. Vergeleken met die in de controlegroep waren de EMSC's in de 2 en 4 μg/ml BP-groepen donkerder van kleur (Fig. 5B), wat suggereert dat de toevoeging van BP's een verhoging van ALP-expressie in EMSC's veroorzaakte. De met BP's behandelde cellen hadden op dag 7 een hogere ALP-activiteit dan de controlegroep (p> 0,05), maar er werd geen significant verschil tussen 2 en 4 μg/ml waargenomen (p> 0.05) zoals weergegeven in Fig. 5D.

RT-qPCR

De belangrijkste differentiatiemarkers, waaronder runt-gerelateerde transcriptiefactor 2 (RUNX 2), ALP, COL 1, OCN, OPN en botmorfogeen eiwit 2 (BMP-2), werden geanalyseerd op dag 14, zoals weergegeven in Fig. 6. Expressie van al deze genmarkers werd op dag 7 in de drie groepen cellen gevonden. Er werden geen duidelijke verschillen in genexpressie gevonden tussen groepen van 2 en 4 g/ml. In vergelijking met controlecellen was de expressie van de hierboven beschreven genen in met BP behandelde cellen echter significant verhoogd.

BP's versterken de osteogenese van EMSC's. EMSC's werden 14 dagen gekweekt in osteogeen medium met 0 g/ml, 2 μg/ml, 4 μg/ml BP's. Expressie van genen die betrokken zijn bij osteogenese van EMSC's werd gekwantificeerd door kwantitatieve reverse transcriptase polymerase kettingreactie (RT-qPCR). **p < 0.01, *p < 0.05.

BP's verbetert de osteogenese van EMSC's door TG2-expressie te verhogen

Aangezien een significante impact van TG2 op door integrine gemedieerde differentiatie en ECM-afzetting werd aangetoond voor een breed scala aan cellen, hebben we onderzocht of BP's osteogene differentiatie van EMSC's zouden bevorderen via opregulatie van TG2-expressie. Zoals getoond in Fig. 7, ontdekten we duidelijke opregulatie van de intracellulaire en extracellulaire TG2 in de met BP behandelde groepen. Laminine (LN) en fibronectine (FN) in de 2 en 4 μg/ml BP-behandelde cellen hadden hogere niveaus dan die in de controlegroep (Fig. 7A). EMSC's die waren blootgesteld aan BP's vertoonden een ongeveer tweevoudige toename van TG2-niveaus in vergelijking met de controlegroep, maar er werd geen significant verschil waargenomen tussen de met BP behandelde groepen (Fig. 7B). Als macromoleculair eiwit kon het anti-TG2-antilichaam de celmembranen niet passeren. Het extracellulaire TG2 werd dus geblokkeerd door het antilichaam en slaagde er niet in om verschillende groeifactoren en ECM-eiwitten te verknopen. De resultaten van Alizarin Red S (Fig. 8A, C) toonden aan dat anti-TG2 de BP-gemedieerde toename van calcium- en ECM-afzetting duidelijk onderdrukte. Ondertussen, zoals getoond in Fig. 8D, remde anti-TG2 de toename van ALP-activiteit van BP-behandelde cellen significant. Bovendien maakte anti-TG2 effectief een einde aan de effecten van BP's op de expressie van botmatrixeiwitten, waaronder OCN, OPN en COL I (Fig. 9).

Transglutaminase 2 (TG2) was involved in the osteogenic differentiation of EMSCs. EMSCs were incubated with BPs (2 and 4 μg/ml) for 14 days, and fibronectin (FN), LN, and TG2 levels were assessed by immunoblotting. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05.

Osteogenic differentiation of EMSCs with TG2 neutralizing antibody. A ALP staining. B ARS staining performed to examine extracellular mineralization. C Quantitative ALP analysis. D Quantitative Alizarin red staining analysis. **p  < 0.01

Anti-TG2 inhibited BP-induced EMSC osteogenic differentiation. A Representative western blots of osteoponin, osteocalcin, and collagen 1 (OPN, OCN, LN, FN, and COL I, respectively) in differentiated EMSCs following treatment with 2 μg/ml BPs and 2 μg/ml anti-TG2 or 2 μg/ml BPs alone. B Quantification of OPN, OCN, and COL I protein expression. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05

Discussion

To the best of our knowledge, modification of phosphorus was first exhaustively studied as early as 1914; unfortunately, these studies did not receive much attention for an entire century [27]. Phosphorus is one of the essential elements making up about 1% of the total body weight as a bone component in the human body [28], while most of the other materials cannot warrant such a natural biocompatibility. In 2014, BP was introduced as a new member of the 2D layered materials.

In this study, the BP nanoparticles were prepared on a large scale from bulk BP crystals by using an improved mechanical grinding and continuous ultrasound method. Compared with other methods, this ultrasound and mechanical grinding synthesis is facile and efficient and enables production of BPs on a large scale. For characterization of BPs, SEM was carried out to examine the morphology of BPs. SEM images illustrated that BPs were successfully synthesized, and the typical sizes of BPs are about 100 to 150 nm. The size of particles was further investigated using DLS in the relatively narrow range around 133 nm. The result of SEM corresponded well with the measurement of particle size measurements based on DLS. Interestingly, previous studies demonstrated that BP with larger lateral size has higher cytotoxicity than small BP, while ultra-small BPs were even considered nontoxic up to the high concentration of 1000 μg/ml [29, 30]. Thus, for biomedical applications, the BP nanomaterials still need further study. In addition, Raman scattering revealed the presence of three prominent peaks at 361.5, 437.1, and 465.2 cm ⁻¹ that were associated with the out-of-plane phonon mode (A ¹ _g ) and two in-plane modes (B ² _g and A ² _g ) of BPs. These results were consistent with previous reports [31] in which showed that the BPs had been prepared successfully from bulk BP. XRD shows the phase purity of the prepared BPs. Broadening of the diffraction pattern indicates the nanometer size of individual crystallites.

To evaluate the stability and degradation rate of BPs, Wang and co-workers performed an experiment in which normalized absorption spectra of the BP nanosheets were dispersed in water and exposed to air. After 6 days, they found that the absorbance of the BP nanosheets at 450 nm decreased by 43% compared to the initial value, indicating that BP is easily degraded in the physiological environment [32]. Also, it is well-known that BP is sensitive to water and oxygen, but this shortcoming is considered a merit for biomedical applications. Because of these special characteristics compared with other biomaterials, BPs could potentially avoid material accumulation in human body and then reduce cytotoxicity caused by such material noumenon.

Since MSCs play key roles in bone formation, there is no doubt that transplanting MSCs in animal models of bone defects enhance bone regeneration and promotes functional recovery via BMSC acquisition [33]. Unfortunately, BMSC acquisition procedures are painful for the donor and frequently cause surgical site infection, and the number of harvested BMSCs is low [34]. Previous studies from our laboratory and other reports have shown that EMSCs could be isolated from several adult tissues, such as dental pulp and the nasal mucosa, without causing invasive injury. Moreover, EMSCs were easily induced into osteoblasts, rendering those cells as promising seed cells for bone tissue engineering. Therefore, EMSCs were used in this study. We attempted to obtain the maximum safety BP concentration for EMSCs. As shown in the results, we achieved the maximum safe concentration of BPs (less than 64 μg/ml). The concentrations of 2 and 4 μg/ml of BPs were chosen for further study to avoid any possible potential toxic. The Ki-67 assay was also used to quantify and evaluate EMSC proliferation in these samples after treating these cells with BPs (2 and 4 μg/ml) for 24 h. We did not observe any statistically significant suppression of EMSCs growth in the case of BPs. Meanwhile, our results indicate that during treatment with safe concentrations of BPs, promotion of EMSCs proliferation also occurred.

Some reports have shown that the concurrent binding of BP and calcium ions may benefit osteogenic differentiation, thereby leading to enhanced bone regeneration [35, 36]. To investigate these effects, in vitro EMSCs exposed to BPs were used in osteogenic differentiation experiments. Interestingly, the results of the ALP test and Alizarin Red S staining show that exposure to BPs could promote rather than compromise osteogenetic differentiation of EMSCs compared to the control group. Similar findings have been reported in which phosphorus-rich materials can stimulate mineralization and bone regeneration. Co-expression of osteogenesis-related genes, including ALP, OPN, OCN, COL1, and RUNX2, in differentiated EMSCs was detected at days 7 and 14 by RT-qPCR. Indeed, the expression levels of these osteogenic genes significantly increased in differentiated EMSCs treated with BPs, also providing confirmation of the osteogenic potential of the BPs. Similar results were reported in which BP could induce both the proliferation and osteogenic differentiation of human pre-osteoblast cells. Together these results indicate that the BPs were able to induce osteogenic differentiation of EMSCs.

It can be asked, “How do BPs promote osteogenetic differentiation of EMSCs?” It is well accepted that phosphorus can capture Ca ²⁺ in vivo to form calcium phosphate deposits that accelerate bone regeneration, while BP can be the resource of phosphorus ions [36]. Tong et al. believes that BP generate mild heat (40–42 °C), which causes up-regulation of heat shock protein (HSPs) expression and stimulates bone regeneration [37, 38]. Moreover, in this study, the upregulated activation of TG2 levels was also observed in BPs treatment groups. To the best of our knowledge, TG2 has important enzymatic and non-enzymatic functions at these locations in which it crosslinks various ECM proteins and modulates the interactions of cells with the ECM and soluble growth factors by non-covalent interactions with and regulation of integrins [39,40,41]. Obviously, the BPs can react strongly with oxygen and water and finally degrade to non-toxic phosphate in aqueous solutions, which is a crucial component of ATP. Nakano Y et al. reported that ATP can act as a significant phosphate (Pi) source for mineralization in MC3T3-E1 osteoblast cultures, indicating that ATP-hydrolyzing enzymes could induce mineral deposition [42]. They also found that TG2 could not only act as a phosphatase but could be involved in ATP hydrolysis in the osteoblast cultures thus further contributing to the elevation in Pi levels required for mineral deposition, which may be beneficial to EMSC energy metabolism. This process may be part of the contribution that BPs makes toward enhancement of EMSC osteogenic differentiation. On the other hand, thanks to TG2 bio-functions, a wide variety of ECM adhesion proteins, including LN, COL I, and FN, could maintain a stable state. Indeed, in the present study, we observed that ECM (FN, COL I, and LN) were significant higher in BP-treated EMSC groups. BPs provide a favorable ECM microenvironment for promoting greater osteogenic EMSC differentiation and proliferation.

Until now, no secretory signal sequences and hydrophobic or transmembrane domains have been clearly identified in TG2 because the protein is not localized in the endoplasmic reticulum (ER)/Golgi compartments [39, 43], and only few studies reported about these factors that control TG2’s secretion. Therefore, it remains unclear as to the exact mechanism of BP regulation of expression patterns of TG2 in the progress of EMSC osteogenic differentiation.

Conclusion

In the present study, BPs were successfully fabricated using mechanical grinding and continuous ultrasound method. At bio-safe concentrations, BPs activated TG2, and promoted the expression of ECM, which further promoted osteogenic differentiation of EMSCs. From these results, we can conclude that BPs would be suitable for incorporation into tissue-engineered scaffolds that utilize EMSCs to repair bone defects. Although our research highlights the great potential of BPs in nano-biomedicine, large-scale preclinical and clinical studies concerning its safety are needed before any clinical applications are established.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

The datasets generated during and/or analyzed during the study are available from the corresponding author on reasonable request.

Afkortingen

BPs:

Black phosphorus nanoparticles

EMSCs:

Ectodermal mesenchymal stem cells

TG2:

Transglutaminase 2

2D:

Two-dimensional

ECM:

Extracellular matrix

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

NMP:

N -Methyl-2pyrrolidone

PBS:

Phosphate-buffered saline

DMEM/F12:

Dulbecco's modified Eagle's medium/nutrient mixture F12

FBS:

Fetal bovine serum

SD:

Sprague Dawley

SEM:

Scanning electron microscopy

XPS:

Röntgenfoto-elektronenspectroscopie

CCK-8:

Cell counting kit

OD:

Optical density

RT-qPCR:

Reverse transcriptase polymerase chain reaction

GAPDH:

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

BSA:

Bovine serum albumin

TBS:

Tris-buffered saline

DAPI:

4′6-Diamidino-2-phenylindole

DLS:

Dynamic light scattering