In situ geëlectrospun kurkumine nanovezel: Dubbele antibacteriële actie voor steriliseren van medicamenten-resistente bacteriën

Samenvatting

Bacteriële infecties, vooral veroorzaakt door multidrug-resistente bacteriën, vormen nog steeds een bedreiging voor het menselijk leven. Fotodynamische therapie (PDT) kan effectief bacteriën doden, en nanovezel-gebaseerde PDT kan effectief schade aan normale weefsels verminderen. Echter, huidige fotosensitisatoren die op de oppervlakken van vezels gecoat zijn, zouden naar de wond vrijkomen, wat bijwerkingen veroorzaakt. En nanovezels bereid via traditionele methoden vertonen slechte hechting op de wond, wat de PDT-effect ernstig vermindert vanwege het korte-bereik effect. Hierbij worden kern-schelp kurkumine composiet nanovezels bereid via in situ elektrospinnen methode via een zelfgemaakte draagbare elektrospinning apparatuur. De verkregen composiet nanovezels tonen superieure hechting op verschillende biologische oppervlakken dan die van traditionele bereidingsmethode. Bij 808-nm bestraling produceren deze composiet nanovezels effectief enkelvoudig zuurstof (¹O₂) zonder dat kurkumine afvalt. Na blootstelling van deze composiet nanovezels aan medicamenten-resistente bacteriën, vertonen ze dubbele antibacteriële gedragingen en doden ze de medicamenten-resistente bacteriën efficiënt. Deze dubbele antibacteriële nanovezelmembranen met uitstekende hechting kunnen de toepassing van wondinfectie als antibacterieel verband ten goede komen.

Achtergrond

Bacteriële infectie zonder tijdige behandeling zal septicemie veroorzaken, en sepsis bedroedt dus ernstig leven en gezondheid. Hoewel antibiotica bacteriën kunnen doden, zal langdurig gebruik van antibiotica leiden tot de ontwikkeling van medicamenten-resistente bacteriën, zoals methicilline-resistente staphylococcus aureus (MRSA). MRSA, als een soort multi-drug resistente bacteriën, is een van de veelvoorkomende bacteriën die wondinfecties veroorzaken. In deze situatie is het noodzakelijk om strategieën te vinden om bacteriën veilig te doden zonder resistentie te ontwikkelen. Het is al bewezen dat fotodynamische therapie (PDT) een effectieve sterilisatiemethode is. Echter, de meeste fotosensitisatoren voor PDT vereisen ultraviolett licht of kort-golflengte excitatie. Aangezien de penetratiediepte van licht in organismen afhangt van de golflengte, is de penetratiediepte van ultraviolett licht en zichtbaar licht ondiep, terwijl de penetratiediepte van nabij-infrarood (NIR) licht relatief diep is. Erger nog, ultraviolett licht en kort-golflengte licht zullen menselijke weefsels ernstig verbranden. Om veilige en antibacteriële behandelingen in diep weefsel te bereiken, is het ontwikkelen van fotosensitisatoren geëxciteerd door NIR-licht een vraag en trend. Opconversie nanodeeltjes (UCNPs) kunnen NIR-licht omzetten in kort-golflengte licht. Vanwege deze eigenschap kunnen fotosensitisatoren ontworpen worden om te combineren met opconversie om NIR-excitatie te bereiken. UCNPs worden gebruikt als golflengte conversiestation dat NIR-licht omzet in kort-golflengte licht om de fotosensitisatoren te exciteren en enkelvoudig zuurstof (¹O₂) te produceren. Echter, eerdere studies zijn meestal gericht op de bereiding van fotosensitisator-gecoate nanodeeltjesstructuur. Fotosensitisatoren naakt op de uiterste laag van nanodeeltjes vallen gemakkelijk af, en het heeft ook enkele bijwerkingen op biologische weefsels vanwege direct contact, zoals het remmen van weefselkollageengroei. Feitelijk kunnen fotosensitisatoren steriliseren door productie van enkelvoudig zuurstof, wat betekent dat er geen behoefte is aan fotosensitisatoren om direct contact te maken met bacteriën of biologische weefsels. Daarom kunnen we een spacer ontwerpen om fotosensitisatoren van biologische weefsels te scheiden om mogelijke bijwerkingen te vermijden.

Elektrospinnen is een snelle en efficiënte methode om nanovezels te bereiden, inclusief organische en anorganische nanovezels. Tijdens het bereidingsproces van nanovezel, zijn nanodeeltjes gemakkelijk te combineren met vezels om composiet nanovezels te vormen. Er zijn voornamelijk twee methoden om composiet nanovezels te vormen. Één is het doperen van deeltjes binnenin de nanovezels, en de ander is het laden van deeltjes op de oppervlakken van nanovezels. Rekening houdend met het doel van het scheiden van fotosensitisatoren van biologische weefsels, is het incorporeren van fotosensitisatoren in de nanovezels verkiesbaarder vergeleken met fotosensitisatoren geladen op de vezeloppervlakken, wat gemakkelijk afvalt. Echter, als nanovezels hydrofoob zijn die niet kunnen infiltreren, is enkelvoudig zuurstof moeilijk te produceren en te leveren aan de vezeloppervlakken om antibacteriële eigenschap te bereiken. Maar hydrofiele nanovezels lossen gemakkelijk op wanneer gecontamineerd met interstitiële vocht. Daarom is het noodzakelijk om NIR-fotosensitisatoren te combineren met nanovezels en te zorgen dat de fotodynamische nanovezels effectief bacteriën kunnen doden, met name medicamenten-resistente bacteriën.

In deze studie wordt kurkumine gebruikt als fotosensitisatoren vanwege de wijdverspreide herkomst uit organismextracten. Kern-schelp nanostructuur van UCNPs wordt gebruikt als golflengte overdrachtsstation, en het toont hoge conversie-efficiëntie om ¹O₂ te produceren. De UCNPs@Kurkumine composiet nanovezels worden bereid via in situ elektrospinnen methode via een zelfgemaakte elektrospinning apparatuur. De hechting van de composiet nanovezels verkregen door deze methode op verschillende biologische oppervlakken is beter dan de traditionele elektrospinning bereidingsmethode. Bij 808-nm bestraling kunnen deze composiet nanovezels effectief ¹O₂ produceren zonder kurkumine af te laten vallen. Na deze composiet nanovezels gecontamineerd zijn met medicamenten-resistente bacteriën van MRSA, zullen ze dubbele antibacteriële gedragingen vertonen die de medicamenten-resistente bacteriën effectief doden.

Methoden

Materialen

Thuliumchloride, ytterbiumchloride, neodymiumchloride en yttriumchloride zijn aangeschaft bij Sigma-Aldrich. Methanol, ethanol, cyclohexaan, kurkumine, dichloormethaan, aceton, polyvinylpyrrolidon (PVP), polycaprolacton (PCL) en polyethyleenimine (PEI) zijn gekocht bij Sinopharm Chemical Reagents. Alle materialen werden zonder verdere zuivering gebruikt.

Synthese van Kern-Schelp NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd@Kurkumine

Opconversie nanodeeltjes (UCNPs) van NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd werden gesynthetiseerd met co-neerslagmethoden. Vervolgens werden 200 mg van als-gemaakte UCNPs, 90 mg PEI en 180 mg kurkumine toegevoegd en opgelost in methylene dichloride. De reactanten werden uniform geroerd gedurende 20 uur bij kamertemperatuur, en de verkregen producten werden gezuiverd door centrifugatie en tweemaal gewassen met ethanol.

Bereiding van Kurkumine Composiet Nanovezels Via In Situ Elektrospinnen

Eén gram PCL, 0,16 g PVP en 0,1 g NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd@Kurkumine werden toegevoegd in 5 mL aceton. Na 12 uur roeren werd een homogene voorlopige oplossing verkregen voor elektrospinnen. 3 mL van de voorlopige oplossing in een 5-mL spuit werd gebruikt voor elektrospinnen met een zelfgemaakte handmatige elektrospinning apparatuur, die bestaat uit een 0,4-mm metaal naald in diameter, twee alcalische batterijen, en een hoge-spanningsomzetter die 3 V van de batterij kan omzetten in 10 kV voor elektrospinnen. De elektrospinning afstand tussen collector en elektrospinning naald was ongeveer 10 cm.

Detectie van ¹O₂ Vorming

Enkelvoudig zuurstof sensor groen (SOSG) werd gebruikt om de ¹O₂ vorming te detecteren. Een 9×9 mm vierkant van als-gemaakte nanocomposiet vezelmembraan met verschillende concentratie van UCNPs@Kurkumine werd toegevoegd in een kwarts cuvette, en daarna werd 3 mL methanol bevattende 25 μM SOSG toegevoegd. Vervolgens werd de cuvette geïrradiëerd onder de 808-nm laser met verschillende bestralingstijden. De fluorescentspectrofotometer met 504 nm excitatiegolflengte werd gebruikt om de fluorescentie-intensiteit van deze oplossing te meten, wat het enkelvoudig zuurstofniveau weerspiegelt.

Antibacteriële Assay

Medicamenten-resistente bacteriën van MRSA en Escherichia coli werden gebruikt om het antibacteriële vermogen te evalueren. Samengevat, bacteriestammen werden gekweekt in tryptische soja bouillon medium. De culturemedia bevattende bacteriestammen werden geïncubeerd bij 37 °C gedurende 15 uur. Na kweken was de concentratie van bacteriestam 1 × 10⁶ CFU/mL. In totaal werd 100 μL bacteriële oplossing in elke put van 96-put plaat geplaatst op een steriele ultra-schoon tafel. Daarna werd een stuk cirkelvormig vezelmembraan met 6 mm diameter aan elke put van de 96-put plaat toegevoegd. Na 20 min 808-nm laser bestraling, werd de bacteriële oplossing in de plaat 10 keer verdund met steriel water. 10 μL van de verdunning werd in een voedingsagar plaat geplaatst om een gelijkmatig bedekte agar plaat te verkrijgen. De behandelde agar plaat werd gekweekt in een constante temperatuur bacteriële incubator bij 37 °C gedurende 18 uur en daarna gefotografeerd. In de controle groep waren de stappen hetzelfde als bovenstaande, behalve dat 808-nm laser bestraling niet gebruikt werd. Elke groep werd herhaald met 5 platen.

Karakterisering

TEM en SEM beelden werden genomen van JEM-2010 en SU-1510 elektronenmicroscopen. Fluorescentiespectrum werd gemeten op Edinburgh FLS1000 fluorescentspectrofotometer. Het absorptiespectrum werd opgenomen op Shimadzu UV2550 spectrometer. Fourier-transformatie infraroodspectroscopie werd genomen op Nicolet iS50 spectrometer. De zetapotentieel werd gemeten met WJL-608 analyzer. De hydrofiliciteit met zittende druppel methode werd getest door PT-602A testapparatuur.

Resultaten en Discussie

Karakterisering van Nanodeeltjes en Composiet Nanovezels

Figuur 1a toont de TEM-afbeelding van NaYF₄:Yb/Tm@NaYF₄:Nd nanodeeltjes (UCNPs). Het toont een uniforme grootteverdeling van UCNPs met een gemiddelde diameter van ongeveer 45 nm. De zetapotentieel van deze nanodeeltjes werd verder getest als +19 mV (Aanvullend bestand 1: Fig. S1). Nadat de UCNPs gecoat waren met kurkumine, toont Fig. 1b een kern-schelp structuur en de kurkumine-schelp dikte is ongeveer 5 nm. Vervolgens werden deze kern-schelp kurkumine nanodeeltjes ingesloten in PCL/PVP vezels. Figuur 1c toont de SEM-afbeelding van deze composiet nanovezels bereid door een zelfontworpen handmatige elektrospinning apparatuur. De diameter van de continue en niet-gebroken nanovezels bereid door dit apparaat is ongeveer 400 nm, en de vezeluniformiteit is vergelijkbaar met die van traditionele elektrospinning apparatuur (Aanvullend bestand 1: Fig. S2). Het moet worden opgemerkt dat deze draagbare elektrospinning apparatuur bediend kan worden door twee droge batterijen van 1,5 V (Aanvullend bestand 1: Fig. S3), wat de beperking van het gebruik van stadsstroom verwijdert. Gecombineerd met zijn andere voordelen van licht gewicht (160 g gewicht) en kleine afmetingen, zal het buitengebruik ten goede komen. Figuur 1d toont de TEM-afbeelding van deze composiet nanovezels, wat aangeeft dat de nanodeeltjes een goede disperseerbaarheid in de nanovezels hebben.

De reden voor het coaten van NaYF₄:Nd-schelp op de NaYF₄:Yb/Tm-kern was dat het de fotoluminescentie kan verbeteren (Fig. 2a). Omdat de fluorescentiespectra van UCNPs goed overlappen met de UV-Vis absorptiespectra van kurkumine (Fig. 2b), betekent dit dat sterkere fotoluminescentie van UCNPs meer energie kan overdragen aan kurkumine, wat gunstig was voor de excitatie van fotosensitisatoren. Verder, rekening houdend met dat NIR-licht met een golflengte van 808 nm dieper in levend weefsel penetrateert dan NIR-licht met een golflengte van 980 nm, kan de introductie van deze NaYF₄:Nd-schelp de excitatiegolflengte moduleren van 980 naar 808 nm (Aanvullend bestand 1: Fig. S4), waardoor ongewilde verbrandingen op normaal weefsel verminderd worden. FTIR-metingen werden verder uitgevoerd. Zoals te zien is in Fig. 2c, trekken rektrillingen van C=O op 1628 cm⁻¹, C-O op 1282 cm⁻¹ en C-O-C op 1028 cm⁻¹ op in de nanocomposiet deeltjes (oranje lijn), die afkomstig zijn van kurkumine (groene lijn). Tegelijkertijd is er een rektrilling van C-N op 1125 cm⁻¹, die afkomstig is van PEI (blauwe lijn). Hun moleculaire structuurdiagrammen zijn geïllustreerd in de bijlage (Aanvullend bestand 1: Fig. S5). Bovendien is er een zwakke C=C bij ongeveer 1660 cm⁻¹, wat overeenkomt met de olijfolie op hetzelfde moment van synthese van UCNPs. Het kan de componenten van UCNPs@Kurkumine composiet nanovezels demonstreren.

Figuur 2d toont fluorescentiedempingscurves van UCNPs voor en na het coaten met kurkumine. Het toont dat de fluorescentielevensduur van UCNPs afnam van 700 tot 390 μs na het coaten met kurkumine-schelpen. Op basis van γ = 1 − τ₂/τ₁, waar τ₂ en τ₁ de levensduur van UCNPs voor en na de omhulling van kurkumine zijn, is γ de energie-overdrachtsefficiëntie. Dus werd γ berekend als 44,3%. Zulke hoge energie-overdrachtsefficiëntie werd verkregen, wat op het eerste aspect te wijten was aan de goede overlappingen tussen absorptiespectra van kurkumine en fotoluminescentiespectra van UCNPs (Fig. 2b), zodat niet-stralende energie-overdracht kan plaatsvinden tussen hen. Het tweede aspect was dat UCNPs een NaYF₄:Nd-schelp had die de fluorescentie-intensiteit versterkte, wat hun spectrale overlapping integraal oppervlakte verhoogde. Het derde aspect was dat de afstand tussen kurkumine en UCNPs de coating-dikte was (< 5 nm), en deze kleine afstand was gunstig voor de generatie van hoog-efficiënte fluorescentie-resonantie-energie-overdracht (FRET). De FRET-methode kan een zo hoge als 44,3% energie-overdrachtsefficiëntie verkrijgen, wat ook ten goede kan komen aan de volgende efficiënte productie van ¹O₂.

Produceren van ¹O₂ uit Composiet Nanovezels

Om het vermogen van nanocomposiet vezels om ¹O₂ te produceren te evalueren, werd de SOSG-methode gebruikt. Eerst namen we nanocomposiet vezels met een vaste dopingsconcentratie en observeerden de generatie van ¹O₂ onder verschillende bestralingstijden. Zoals getoond in Fig. 3a, voor een vaste concentratie zoals 0,20 wt%, is bestralingstijd een van de factoren die de generatie van ¹O₂ beïnvloeden. Hoe langer de bestralingstijd, hoe meer ¹O₂ geproduceerd werd. Echter, het toont ook aan dat hoewel de concentratie van ¹O₂ geleidelijk toeneemt met de toename van bestralingstijd, de stijgingssnelheid langzaam afneemt en bijna constant blijft na 20 min, wat geïllustreerd wordt door een dichte curve-interval. Dit fenomeen kan te wijten zijn aan de snelle lokale zuurstofverbruik door productie van ¹O₂ met continue NIR-lichtstraling, wat resulteert in een relatief laag zuurstofniveau in lokaal gebied, en dus de stijgingssnelheid van produceren van ¹O₂ vermindert.

Om de invloed van dopingsconcentratie op produceren van ¹O₂ te observeren, is Fig. 3b verder afgebeeld. Zoals getoond in Fig. 3b, voor een vaste bestralingstijd zoals 20 min, met toenemende dopingsconcentratie, werd meer ¹O₂ geproduceerd. Echter, de stijgingssnelheid van ¹O₂ vertraagde toen de concentratie groter was dan 0,20 wt%. Deze experimentele resultaten suggereren dat er geen behoefte is om oneindig de bestralingstijd en dopingsconcentratie te verhogen om meer ¹O₂ te produceren. De optimale keuze is 0,20 wt% met 20 min en dus in de volgende experimenten zullen we deze concentratie en bestralingstijd nemen.

Benatting en Hechting van In Situ Geëlectrospun Nanovezelmembraan

Rekening houdend met dat produceren van ¹O₂ een proces is dat vereist dat UCNPs@Kurkumine nanodeeltjes in vezels interacteren met zuurstof in lichaamsvocht, werd de contacthoek van dit vezelmembraan verder getest. Figuur 4a toont een druppel water op het oppervlak van dit composiet nanovezelmembraan en de benatting na 20 s. Vergeleken met zuivere PCL nanovezelmembraan (Fig. 4b), heeft het composiet nanovezelmembraan betere benatting. Interessant is dat na het weken van composiet nanovezelmembraan in fosfaatgebufferde oplossing (PBS), er geen UCNPs@Kurkumine gedetecteerd werd in PBS door absorptiespectrometer, wat betekent dat geen kurkumine van de vezels afviel. De reden kan zijn dat kurkumine op de UCNPs gecoat was, dus de grootte van UCNPs@Kurkumine (~ 50 nm) was te groot om de vezel te penetreren. Vergeleken met methoden van fotosensitisatoren gecoate op de deeltjes of vezels, kan het vergroten van de grootte van kurkumine eerst en daarna doperen in de benettende vezels effectief het afvallen van fotosensitisatoren vermijden en de generatie en diffusie van ¹O₂ verbeteren. Bovendien, rekening houdend met het korte-bereik effect van PDT en de slechte hechting van het vezelmembraan bereid door de traditionele elektrospinning methode aan het wondoppervlak (Fig. 4c; Aanvullend bestand 1: Fig. S6), zou het fotodynamische effect beïnvloed worden door het interval tussen het vezelmembraan en het oppervlak. Gelukkig konden deze kurkumine composiet nanovezels bereid worden via in situ elektrospinnen methode met goede morfologie (Fig. 1c) en toonden ook goede hechting op verschillende objectoppervlakken (Fig. 4d). Dit betekent dat de in situ elektrospinning depositiemethode om het fotodynamische vezelmembraan te bereiden meer verkiesbaar is dan de traditionele spinnen methode waarbij het vezelmembraan op de folie wordt verzameld en daarna op het wondoppervlak wordt gedrukt.

Dubbele Antibacteriële Effect van Kurkumine Composiet Nanovezels

De nanocomposiet vezels bereid door het apparaat zijn bewezen niet-giftig door MTT-assay (Aanvullend bestand 1: Fig. S7). Verder, om te bewijzen dat de vezels goede antibacteriële eigenschappen hebben, werd de telmethode gebruikt om de antibacteriële eigenschappen van composiet nanovezels te evalueren. Zoals getoond in Fig. 5, of 808-nm licht bestraald wordt op zuivere vezels, er is geen antibacteriële eigenschap (Fig. 5a, b). Deze resultaten tonen aan dat 808-nm licht zelf geen bactericide effect heeft. Wanneer de vezels gedopte zijn met UCNPs, nemen de bacteriën niet af, wat bevestigt dat UCNPs geen bactericide effect hebben (Fig. 5a′, b′). Interessant is dat wanneer de vezels gedopte zijn met kurkumine, het aantal bacteriën tot een bepaalde mate afneemt, wat bewijst dat kurkumine zelf een bepaalde antibacteriële activiteit vertoont (Fig. 5c, c′). Verder trad een duidelijke bactericide uitkomst op in vezels gedopte met UCNPs@Kurkumine onder NIR-lichtbestraaling (Fig. 5d′, e′). Gecombineerd met de resultaten van Fig. 3, geven deze bactericide resultaten aan dat de ¹O₂ geproduceerd uit UCNPs@Kurkumine onder 808-nm bestraling effectief bacteriën kan doden. Aan de andere kant was de antibacteriële activiteit van kurkumine hetzelfde in de aanwezigheid en afwezigheid van 808-nm bestraling, vanwege het feit dat de absorptie van kurkumine in het zichtbare lichtbereik was (Fig. 2b), dus 808-nm licht was niet effectief. Dit was ook de reden waarom kurkumine ontworpen was om het oppervlak van UCNPs te coaten. Bovendien toont Fig. 5d, e vezels gedopte met UCNPs@Kurkumine bij 0,15 wt% en 0,20 wt%, respectievelijk. Door vergelijking wordt gevonden dat de 0,20 wt% groep betere bactericide eigenschappen vertoonde bij 20 min lichtbestraaling, en het antibacteriële effect bereikte 95%. Dit is omdat de ¹O₂ geproduceerd door de fotosensitisator kurkumine in het fotodynamische effect medicamenten-resistente bacteriën kan doden. Dit resultaat is ook consistent met het ¹O₂ resultaat in Fig. 3. Deze data geven verder aan dat vezels gedopte met UCNPs@Kurkumine MRSA kunnen doden door zijn dubbele antibacteriële activiteit, nl. vezels gedopte met UCNPs@Kurkumine en PDT, en PDT heeft betere antibacteriële effect dan vezels gedopte met UCNPs@Kurkumine. Bovendien hebben we ook experimenten uitgevoerd met Escherichia coli, wat ook bevestigde dat in situ geëlectrospun kurkumine composiet nanovezels dubbele antibacteriële effecten hebben op medicamenten-resistente bacteriën (Aanvullend bestand 1: Fig. S8). En het anti-inflammatoire effect van de nanovezels werd verder geverifieerd door H&E-kleuring van MRSA (Aanvullend bestand 1: Fig. S9). Na verschillende behandeling van wondinfectie, werd een groot aantal neutrofielen verzameld in de groep zonder nanocomposiet vezel, die paars en blauwe celclusters waren door weefselschade en ontsteking. Echter, een kleine hoeveelheid granulatieweefsel en rode bloedcellen verscheen in de nanovezelgroep, wat indirect de antibacteriële eigenschappen van nanocomposiet vezels weerspiegelt. Het heeft een blokkerende effect op inflammatie van wondinfectie.

Conclusies

Samengevat, kern-schelp kurkumine composiet nanovezels zijn bereid via in situ elektrospinnen methode via een zelfgemaakte draagbare elektrospinning apparatuur. De verkregen composiet nanovezels tonen superieure hechting op verschillende biologische oppervlakken dan die van traditionele bereidingsmethode. De methode, allereerst de grootte van kurkumine vergroten gevolgd door het doperen ervan in de benetbare vezel, kan effectief het afvallen van fotosensitisatoren vermijden, dus de productie van ¹O₂ en zijn diffusie verbeteren, wat inspiratie kan bieden voor het ontwerpen van andere fotodynamische nanomaterialen. Na deze composiet nanovezels gecontamineerd zijn met medicamenten-resistente bacteriën, vertonen ze dubbele antibacteriële gedragingen en doden ze de medicamenten-resistente bacteriën efficiënt. Deze dubbele antibacteriële nanovezelmembranen hebben uitstekende hechting en kunnen gebruikt worden als antibacteriële verbanden in combinatie met bloedstilling, wat buitengebruik van bloedstilling mogelijk maakt.