Nec-1 verlicht neurotoxiciteit geïnduceerd door titaniumdioxide-nanodeeltjes in SH-SY5Y-cellen via RIP1-modulatie

Samenvatting

Titaniumdioxide-nanomaterialen worden vanwege hun uitstekende fysicochemische eigenschappen in talloze toepassingen ingezet, wat een potentiële bedreiging voor de menselijke gezondheid vormt. Recente in-vivo studies tonen aan dat titaniumdioxide-nanodeeltjes (TDN) na blootstelling via verschillende routes in de hersenen van dieren kunnen worden getransporteerd. Geabsorbeerde TDN kunnen zich in de hersenen ophopen en neurale cellen storeren, wat leidt tot hersendysfunctie. In-vitro studies bevestigen de neurotoxiciteit van TDN, maar de onderliggende mechanismen blijven onduidelijk. Of necroptose een rol speelt in deze neurotoxiciteit, was onbekend. In deze in-vitro studie vonden we dat TDN op dosisafhankelijke wijze inflammatoire schade in SH-SY5Y-cellen induceren, wat werd verlicht door voorbehandeling met necrostatine-1 (Nec-1). Omdat receptor-interacterende proteïne kinase 1 (RIP1) het doelwit is van Nec-1, dempten we RIP1-expressie met siRNA. Na blootstelling van mutante en wild-type cellen aan TDN werd de inflammatoire schade geassesseerd. Het dempen van RIP1-expressie remde de door TDN geïnduceerde inflammatoire schade. Samenhangend verlicht Nec-1 de neurotoxiciteit van TDN via RIP1. Verdere studies zijn nodig om de correlatie tussen TDN-neurotoxiciteit en RIP1 uitgebreid te evalueren.

Inleiding

Vanwege hun uitstekende fysicochemische eigenschappen worden titaniumdioxide-nanomaterialen gesynthetiseerd en breed toegepast in cosmetica, industriële sectoren en medische toepassingen. Dit wijdverspreide gebruik kan echter een grote bedreiging vormen voor de menselijke gezondheid. Na blootstelling treden de meeste TDN via inhalatie en ingestie het lichaam binnen. Het respiratoire, gastro-intestinale en cardiovasculaire systeem kunnen allemaal worden gestoord door geabsorbeerde TDN. Ook de hersenen, als cruciaal onderdeel van het centrale zenuwstelsel, kunnen worden beïnvloed, aangezien TDN in de bloedsomloop de bloed-hersenbarrière kunnen doordringen en geïnhaleerde nanodeeltjes via de reukzenuw in de hersenen kunnen worden getransporteerd. Eenmaal in de hersenen kunnen TDN zich ophopen en hersenschade veroorzaken, wat leidt tot dysfunctionele. Hersenschade is meestal irreversibel en ernstig, weshalb elke potentiële oorzaak onderzocht moet worden.

Hoewel geen epidemiologische studie de associatie tussen TDN-blootstelling en hersenaandoeningen heeft onderzocht, bevestigen talrijke in-vivo en in-vitro studies de neurotoxiciteit van TDN. De focus lag voornamelijk op het onthullen van de onderliggende mechanismen. In een eerdere review vonden we dat geprogrammeerde celdood (PCD) processen, zoals apoptose en autofagie, betrokken zijn bij TDN-neurotoxiciteit.

Necroptose, ook gereguleerde necrose genoemd, is een ander type PCD. In tegenstelling tot apoptose (caspase-afhankelijk) is necroptose afhankelijk van receptor-interacterende proteïne kinase 1/3 (RIP1/RIP3). Geactiveerde RIP1 rekruteert RIP3 om een necrosome te vormen, wat mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL) activeert om necroptose te initieren. Necroptose kan celdood en neuro-inflammatie reguleren, beide betrokken bij TDN-neurotoxiciteit. We hypotheseerden daarom dat necroptose geïmpliceerd is in de door TDN veroorzaakte neurotoxiciteit.

Om deze hypothese te testen, voerden we een in-vitro studie uit om de rol van necroptose in TDN-neurotoxiciteit te verkennen. Celviabiliteit, LDH-lekkage en inflammatoire cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8) werden gemeten na TDN-blootstelling. Eerst werden SH-SY5Y-cellen gekweekt met verschillende TDN-concentraties. Vervolgens werden cellen blootgesteld aan TDN met of zonder Nec-1, een krachtige necroptose-inhibitor. Ten slotte werd RIP1-genexpressie, die door Nec-1 wordt onderdrukt, gedempt met siRNA, waarna mutante en wild-type cellen met TDN werden behandeld. Deze studie werpt licht op de moleculaire mechanismen achter TDN-neurotoxiciteit.

Resultaten

TDN remmen celviabiliteit

Om de cytotoxiciteit van TDN op SH-SY5Y-cellen te verifiëren, werd celviabiliteit gemeten met een CCK8-assay. Cellen werden gekweekt met TDN-concentraties van 5 tot 160 μg/mL gedurende 24, 48 en 72 uur. Na 24 uur bleef celviabiliteit onveranderd bij 5, 10, 20 en 40 μg/mL. Na 48 en 72 uur was alleen de 5 μg/mL groep onveranderd. Celviabiliteit daalde dramatisch bij 80 μg/mL na 48 en 72 uur. TDN verlagen dus celviabiliteit op dosis- en tijdsafhankelijke wijze, wat aangeeft dat langdurige blootstelling toxischer is.

TDN schaden membraanintegriteit

Vervolgens analyseerden we de toxische effecten van TDN op membraanintegriteit na 72 uur via LDH-lekkage. LDH-niveaus stegen significant bij doses boven 5 μg/mL, met een duidelijke toename bij 40, 80 en 160 μg/mL. Deze resultaten tonen aan dat TDN LDH-niveaus op dosisafhankelijke wijze verhogen, consistent met de CCK8-assay.

TDN-blootstelling bevordert inflammatie

De inflammatoire respons na TDN-blootstelling werd geanalyseerd met ELISA. Na 72 uur blootstelling aan verschillende TDN-concentraties werden TNF-α, IL-1β, IL-6 en IL-8 gemeten. IL-8-secretie was verhoogd in alle TDN-behandelde cellen; alle vier cytokines waren significant verhoogd bij doses >5 μg/mL en dramatisch verhoogd bij >10 μg/mL. TDN versterken inflammatie dus op dosisafhankelijke wijze.

Op basis hiervan werd een TDN-concentratie van 80 μg/mL en een blootstellingstijd van 72 uur gekozen voor de vervolgexperimenten over de rol van necroptose.

Nec-1 co-behandeling remt neurotoxiciteit van TDN

Om de rol van necroptose in inflammatoire schade te analyseren, werden cellen geco-behandeld met Nec-1 en TDN. Nec-1 verlichtte de TDN-geïnduceerde daling in celviabiliteit significant (10, 15, 20 μM). Omdat 15 en 20 μM niet effectiever waren dan 10 μM, werd 10 μM Nec-1 gebruikt voor verdere experimenten. LDH-niveaus in de TDN + Nec-1 groep waren significant lager dan in de TDN-enkel groep, terwijl Nec-1 alleen geen LDH-lekkage veroorzaakte. Conclusie: 10 μM Nec-1 remt effectief TDN-cytotoxiciteit zonder eigen toxiciteit.

Voor de anti-inflammatoire capaciteit van Nec-1 werden cellen gekweekt met TDN of TDN + Nec-1. De productie van TNF-α, IL-1β, IL-6 en IL-8 was significant lager in de TDN + Nec-1 groep. Nec-1 kan dus inflammatoire responsen geïnduceerd door TDN-blootstelling verlichten.

Demping van RIP1 verlicht inflammatoire schade geïnduceerd door TDN

Om te bepalen of Nec-1 inflammatoire schade via RIP1 verlicht, dempten we RIP1-expressie effectief met siRNA. Vervolgens werd inflammatoire schade na TDN-blootstelling gemeten in mutante en wild-type cellen. Celviabiliteit in de TDN + si-RIP1 groep was significant hoger dan in de TDN + si-NC groep. LDH-productie en cytokine-niveaus (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8) waren dramaticaal lager in de si-RIP1 groep. Deze resultaten tonen aan dat TDN inflammatoire schade bevorderen via RIP1.

Discussie

Deze studie toont aan dat TDN-blootstelling cytotoxiciteit in SH-SY5Y-cellen op dosisafhankelijke wijze induceert en dat necroptose betrokken is bij TDN-neurotoxiciteit. Co-behandeling met Nec-1 verlicht inflammatoire schade. Aangezien Nec-1 RIP1-activiteit onderdrukt, dempten we RIP1 met siRNA om te bevestigen of RIP1 betrokken is bij het beschermende effect. Mutante en wild-type cellen werden met TDN behandeld; celviabiliteit was hoger en LDH/cytokines lager in de si-RIP1 groep. Deze studie onthult voor het eerst dat necroptose betrokken is bij TDN-geïnduceerde inflammatoire schade.

We bevestigden de neurotoxiciteit van TDN. Na blootstelling aan verschillende concentraties en tijden, daalde celviabiliteit dosisafhankelijk; na 48 en 72 uur was de daling bij 80 en 160 μg/mL significant. LDH-lekkage steeg ook dosisafhankelijk. Omdat eerdere studies aantoonden dat TDN neuro-inflammatie bevorderen, maatten we TNF-α, IL-1β, IL-6 en IL-8. Alle vier cytokines waren significant verhoogd, met dramatische stijgingen bij 20–160 μg/mL. TDN induceren dus neurotoxiciteit op dosisafhankelijke wijze, consistent met eerdere studies.

Co-behandeling met Nec-1 verduidelijkte de rol van necroptose. Celviabiliteitsverlies werd significant geïnhibeerd door 10 μM Nec-1. LDH-niveaus in de TDN + Nec-1 groep waren significant lager, en Nec-1 alleen verhoogde LDH niet. De cytokine-niveaus waren ook significant lager in de co-behandelde groep. Dit bevestigt dat Nec-1 cellen beschermt tegen celdood en inflammatie.

Ten slotte evalueerden we of RIP1 de neurotoxiciteit van TDN regelt. Na demping van RIP1 (si-RIP1) was celviabiliteit hoger en LDH/cytokines lager na TDN-blootstelling vergeleken met si-NC. Dit suggereert dat TDN cytotoxiciteit bevorderen via RIP1. Eerdere studies tonen aan dat RIP1 zowel celdood als inflammatoire processen reguleert.

Hoewel we voor het eerst rapporteren dat Nec-1 TDN-neurotoxiciteit verlicht via het necroptose-signaalpad, heeft onze studie beperkingen. Eerst verschilt cytotoxiciteit van nanomaterialen van bulk-materialen en wordt beïnvloed door oppervlakte-eigenschappen, wat tegenstrijdige resultaten kan verklaren. Een uitgebreide evaluatie van nanotoxiciteit is essentieel. Tweedens kan RIP1 RIP3 rekruteren om een functioneel necrosome te vormen, wat MLKL activeert. RIP3/MLKL-betrokkenheid bij TDN-neurotoxiciteit moet verder worden onderzocht. Derdens zijn reactieve zuurstofsoorten (ROS), een hoofdmechanisme achter TDN-neurotoxiciteit, rapporteerd als upstream signaal van RIP1. Of ROS upstream van RIP1 liggen in TDN-neurotoxiciteit, moet worden besproken. Vierdens moeten cellen blootgesteld worden aan niet-toxische TDN-concentraties (<5 μg/mL) voor langere periodes (>72 uur) om chronische cytotoxiciteit te beoordelen. Vijfdens moet de rol van necroptose in meer neuronale cellijnen en primaire humane/dierlijke neuronale cellen worden geëvalueerd.

Conclusies

Onze studie onthult necroptose als een ander geprogrammeerd celdoodmechanisme betrokken bij TDN-neurotoxiciteit. TDN induceren inflammatoire schade in SH-SY5Y-cellen op dosisafhankelijke wijze, en Nec-1 co-behandeling verlicht deze schadelijke effecten. RIP1, het doelwit van Nec-1, werd met siRNA gedempt, wat inflammatoire schade effectief verlichtte. Conclusie: Nec-1 remt de inflammatoire schade van SH-SY5Y-cellen geïnduceerd door TDN-blootstelling door het RIP1-pad te targeten. De upstream en downstream signaleringspaden van RIP1 betrokken bij TDN-neurotoxiciteit moeten verder worden beoordeeld.

Materialen en Methodes

TDN-preparatie en Celkweek

TDN werden gekarakteriseerd en bereid volgens een eerder gepubliceerde procedure. TDN werden opgelost in RPMI 1640 tot concentraties van 5, 10, 20, 40, 80 en 160 μg/mL. De oplossing werd gesteriliseerd en gesonicatieerd (300 W, 10 min) bij kamertemperatuur om aggregatie te voorkomen. Cellen in kweekmedium zonder TDN dienden als controle. SH-SY5Y-cellen (Shanghai Institute of Life Sciences) werden gekweekt in RPMI 1640 met 10% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine bij 37 °C, 5% CO₂.

Celviabiliteit en LDH-lekkage Assay

Celviabiliteit werd gemeten met CCK8-kit. 1×10⁴ SH-SY5Y-cellen per put in een 96-putplaat, 24 uur geïncubeerd, vervolgens blootgesteld aan TDN (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μg/mL) voor 24 uur. Na incubatie met CCK-8 (2 uur) werd OD gemeten bij 450 nm. Celviabiliteit (%) = (OD_behandeld − OD_leeg) / (OD_controle − OD_leeg) × 100%.

Membraanintegriteit werd gemeten met een commerciële kit (Nanjing Jiancheng). Na 72 uur blootstelling aan TDN werd LDH-secretie geanalyseerd volgens het protocol.

Inflammatoire Respons

ELISA werd gebruikt om TNF-α, IL-1β, IL-6 en IL-8 te meten. SH-SY5Y-cellen werden 72 uur blootgesteld aan TDN, waarna het supernatans werd verzameld voor analyse volgens de handleiding (Elabscience).

siRNA Transfectie

Volgens het protocol werden 100 nM si-RIP1 of negatieve controle siRNA (si-NC) getransfecteerd met Lipofectamine 2000. De dempingsefficiëntie werd geschat met real-time PCR.

Real-time PCR

RNA werd geïsoleerd met de RNAqueous kit (Ambion). Relatieve RIP1-expressie werd gemeten met real-time PCR, genormaliseerd op β-actine.

Statistische Analyse

SPSS 11.0 werd gebruikt voor data-analyse. Eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) vergelijk de groepsgemiddeldes. p < 0.05 werd als significant beschouwd.