Goudnanodeeltjes moduleren testosteronmetabolisme in humane levermikrosomen: effecten van grootte, oppervlaktechemie en proteïnecorona

Samenvatting

Complexen van goudnanodeeltjes (AuNP) met een proteïnecorona kunnen het cytochroom P450 (CYP)-gemedieerde testosteron (TST)-metabolisme veranderen door de fysicochemische eigenschappen van de deeltjes aan te passen. We onderzochten hoe de grootte van nanodeeltjes (NP), oppervlaktechemie en de humane plasma-proteïnecorona (PC) het TST-metabolisme beïnvloeden in gepoolde humane levermikrosomen (pHLM). Er werden 20-40 nm en 80 nm AuNP's bestudeerd die gefunctionaliseerd waren met vertakte polyethyleenimine (BPEI), lipoïnezuur (LA) of polyethyleenglycol (PEG), zowel 'naakt' als met een PC. In pHLM remden 40 nm naakte AuNP's de vorming van vijf gehydroxyleerde TST-metabolieten, terwijl 80 nm deeltjes een zwakkere effect hadden. De PC atenueerde deze remming grotendeels. Verrassend genoeg verhoogden naakte AuNP's de productie van androstendion. In single-donor HLM werd interindividuele variabiliteit waargenomen; de meeste AuNP's onderdrukten het TST-metabolisme bij niet-remmende concentraties, terwijl PC-PEG-AuNP's de androstendionproductie stimuleerden. Deze resultaten benadrukken AuNP's als potentiële endocriene disruptoren door modulatie van TST-metabolisme en bieden een kader voor het screenen van andere nanomaterialen.

Inleiding

AuNP's worden breed toegepast in geneesmiddelverstrekking, diagnostica en consumentenproducten vanwege hun unieke optische en fysieke eigenschappen. Bij blootstelling aan biologische vloeistoffen adsorberen AuNP's snel proteïnen, vormend een corona die de oppervlaktechemie, proteïneconformatie en downstream biologische reacties wijzigt, waaronder cytotoxiciteit, cellulaire opname en CYP-enzymactiviteit. In vitro studies tonen aan dat AuNP's toxisch kunnen zijn voor humane hepatocyten, de C3A-hepatoma-cellijnen en zaadcellen, maar de aanwezigheid van een PC kan deze effecten verzwakken of versterken afhankelijk van de oppervlaktechemie. Vorming van PC beïnvloedt ook de cellulaire opname in diverse celtypen, ongeacht de NP-grootte of -lading.

CYP-enzymen in de lever metaboliseren endogene en exogene stoffen. Verschillende agentia - waaronder geneesmiddelen, pesticiden en nanodeeltjes - kunnen de synthese en het metabolisme van steroïde hormonen verstoren, wat leidt tot veranderde fysiologische functies. Testosteron (TST) is een primaire androgen en een substraat voor CYP3A4, dat het hydroxylereert tot 6β-OH-TST. Verdere hydroxylaties door CYP3A4 leveren 2β-OH-TST, 15β-OH-TST, 16α-OH-TST en 16β-OH-TST op, terwijl CYP2D6 TST dealkyleert tot androstendion (AD). Eerder werk toont aan dat naakte en PC-bedekte AuNP's een breed spectrum van CYP-enzymen moduleren, waaronder CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 en 3A4. AgNP's onderdrukken ook CYP3A4-activiteit in HLM. BPEI- en LA-gefunctionaliseerde AuNP's verlagen CYP3A4-activiteit in C3A-cellen, maar PC atenueert dit effect. In vivo accumuleren kleine AuNP's in lever en milt en veranderen hepatische Cyp1a1- en Cyp2b-expressie. Gegeven deze bevindingen onderzoekt de huidige studie hoe PC de AuNP-grootte, -lading en -oppervlaktechemie beïnvloedt op CYP-gemedieerd TST-metabolisme in pHLM en single-donor HLM.

Methoden

Chemicaliën

Testosteron, zijn metabolieten en ¹³C₃-gelabeld TST werden verkregen van MilliporeSigma. Overige reagentia afkomstig van Steraloids of MilliporeSigma. LC-MS-kwaliteitssolventen van Fisher Scientific; ultrazuur water gegenereerd door een Merck Synergy® UV-R systeem.

Humane Levermikrosomen

Gepoolde HLM (pHLM) van 200 donoren (100 mannelijk, 100 vrouwelijk) en single-donor HLM verkregen van Corning Inc. Donor-specifieke CYP-activiteiten zijn gedetailleerd in Supplementary Table S1.

Synthese van Goudnanodeeltjes

Biopure™ 40- en 80-nm AuNP's gefunctionaliseerd met BPEI, LA of PEG aangekocht van nanoComposix. Kernsynthese omvatte reductie van HAuCl₄·3H₂O in K₂CO₃, gevolgd door veroudering en tangentiële stroomfiltratie (TFF). Oppervlaktefunctionalizatie: LA (0.2:1 w/w) of PEG (0.5:1 w/w) toegevoegd, gevolgd door TFF en steriele filtratie. BPEI-oppervlakken bereid via EDC/NHS-chemie koppeling LA-carboxyl aan BPEI-amines; ongebonden BPEI verwijderd door TFF en centrifugatie.

Proteïnecorona-preparatie

Gepoolde humane plasma (n=5) geïnculeerd met 40- of 80-nm AuNP's bij 55% plasma-volume in een 37°C schuddend apparaat (250 rpm, 1 uur). PC-AuNP's verzameld door centrifugatie (20.000×g, 20°C, 20 min), driemaal gewassen met PBS en heropgelost in PBS voor karakterisatie.

Fysicochemische Karakterisatie

DLS en TEM maatten deeltjesgrootte, polydispersiteit en zetapotentiaal. Metingen in DI-water, PBS en mikrosomale incubatiebuffer (pH 7.4) op 0 min en 45 min (37°C). TEM-roosters bekeken op Tecnai G2 Spirit BioTWIN (120 kV). UV-Vis-spectra opgenomen met Spectra Max i3 lezer.

In Vitro Testosteronmetabolisme

Lineair TST-metabolisme (10 µM) bevestigd over 1.3-9.3 mg mL⁻¹ mikrosomaal eiwit tot 60 min. pHLM geïnculeerd met TST en variërende concentraties naakte of PC AuNP's (0-571 µg mL⁻¹). Reacties gestart met of zonder NADPH (0.25 mM NADP, 2.5 mM glucose-6-fosfaat, 2 U mL⁻¹ dehydrogenase) en gestopt na 45 min bij 37°C met 4% fosforzuur. Supernatanten gecentrifugeerd, opgeslagen bij -20°C en verwerkt voor LC-MS/MS. Single-donor HLM vergelijkbaar behandeld bij 10 µg mL⁻¹ AuNP's.

Standaarden en Monsterbereiding

Primaire standaarden (1 mM) en ISTD (¹³C₃-TST) bereid in methanol. Werkstandaarden 0.01-200 µM. QC-monsters 0.01, 0.05 en 0.1 µM. Monsters gespiked met ISTD, geëxtraheerd via Oasis PRIME HLB-platen, gewassen, geëlueerd, gedilueerd en geanalyseerd met LC-MS/MS.

Vloeistofchromatografie-Massaspectrometrie

Scheiding met Waters UPLC HSS T3-kolom (2.1 × 50 mm, 1.8 µm) bij 600 µL min⁻¹ stroom. Gradiënt: 30% B naar 98% B over 8.4 min. ESI⁺ bron op 4000 V, 150°C; desorptie bij 450°C. MRM-overgangen in Supplementary Table S2. Kalibratiecurven 0.001-20 µM. LOD en LOQ respectievelijk 0.001 µM en 0.005 µM.

Statistische Analyse

Student's t-toets voor D_H en PDI verschillen. IC₅₀ en EC₅₀ berekend via Hill-vergelijking in GraphPad Prism®. Eénrichtings ANOVA gevolgd door Tukey's HSD (p < 0.05) voor AuNP-effecten. Pearson r correleerde CYP-activiteit met metabolietproductie.

Resultaten en Discussie

Fysicochemische Eigenschappen van AuNP's

TEM bevestigde monodispersiteit van alle naakte en PC AuNP's, behalve 40- en 80-nm PC-BPEI-AuNP's, die aggregatie in PBS vertoonden. D_H-waarden namen toe voor 40-nm naakte BPEI- en LA-AuNP's en PC-PEG-AuNP's over 45 min, terwijl 80-nm PC-LA-AuNP's afnamen. PDI nam toe voor 40-nm naakte en PC-PEG-AuNP's, en zetapotentiaal daalde over tijd voor naakte BPEI-AuNP's. Deze veranderingen spreken eerdere bevindingen waar PC NP-grootte, absorbantie en morfologie wijzigt.

TST-metabolisme in Gepoolde HLM

Zes TST-metabolieten (vijf gehydroxyleerde en AD) gedetecteerd in pHLM. Naakte 40- en 80-nm AuNP's remden 2β-OH-TST, 6β-OH-TST en 15β-OH-TST productie dosis-afhankelijk (IC₅₀: 416-1113 µg mL⁻¹). Ze remden geen 16α- of 16β-OH-TST, behalve 40-nm BPEI-AuNP onderdrukte 16β-OH-TST licht bij hoogste dosis. Opvallend verhoogden naakte AuNP's AD-productie bij hoge concentraties (4.3 pmol mg⁻¹ min⁻¹ voor 40-nm BPEI-AuNP). PC-bedekte AuNP's atenueerden deze remmingen grotendeels; PC verzwakte ook het stimulerende effect op AD voor 80-nm LA-AuNP. Over het algemeen verminderden naakte AuNP's hydroxylatie terwijl ze soms dealkylering verhoogden, een effect dat door PC geattenueerd werd.

Variabiliteit in Single-Donor HLM

Donor-specifieke CYP-activiteit correleerde sterk met metabolietvorming: 6β-OH-TST correleerde met CYP2C19 (r = 0.99, p = 0.01) en CYP3A4 (r = 0.99, p = 0.03); AD correleerde invers met CYP4A11 (r = -0.98, p = 0.04). AuNP's bij niet-remmende concentraties moduleerden metabolietproductie verschillend per donor, weerspiegeld CYP-polymorfismen en -fenotypen. Grootte, oppervlaktecoating en PC-vorming beïnvloedden allemaal significant metabolietniveaus (p < 0.0001). PC-PEG-AuNP's activeerden bijvoorbeeld AD-productie in donor HDC3 ongeacht grootte.

Conclusies

AuNP's, met name naakte 40- en 80-nm deeltjes, remmen TST-hydroxylatie en kunnen dealkylering stimuleren in gepoolde HLM. De aanwezigheid van een biologisch relevante PC atenueert deze effecten, vooral voor kationische BPEI-AuNP's. In single-donor HLM zijn AuNP-effecten afhankelijk van oppervlaktechemie en variëren met individuele CYP-activiteit, wat het potentieel van AuNP's als endocriene disruptoren benadrukt. Deze resultaten bieden een kader voor het beoordelen van de impact van andere nanomaterialen op steroïdehormoonmetabolisme en het identificeren van kwetsbare subpopulaties.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

Alle data gegenereerd of geanalyseerd tijdens deze studie zijn opgenomen in dit artikel en het supplementaire informatiebestand.

Afkortingen

11β-OH TST

11β-hydroxytestosteron

15β-OH TST

5β-hydroxytestosteron

16α-OH TST

16α-hydroxytestosteron

16β-OH TST

16β-hydroxytestosteron

2α-OH TST

2α-hydroxytestosteron

2β-OH TST

2β-hydroxytestosteron

6α-OH TST

6α-hydroxytestosteron

6β-OH TST

6β-hydroxytestosteron

AD

Androstendion

AgNP

Zilvernanodeeltjes

ANOVA

Eénrichtings variantieanalyse

AuNP

Goudnanodeeltjes

BPEI

Vertakte polyethyleenimine

CFS

Chlorpyrifos

CYP

Cytochroom P450

DEET

Diethyltoluamide

D_H

Hydrodynamische diameter

DI

Gedemineraliseerd water

DLS

Dynamische lichtverstrooiing

EC₅₀

Half-maximale activeringsconcentratie

EDC/NHS

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/N-hydroxysuccinimide

ESI⁺

Elektrospray positief

HLM

Humane levermikrosomen

HSD

Tukey's eerlijke significante verschil

IC₅₀

Half-maximale remmingsconcentratie

ISTD

Interne standaard

LA

Lipoïnezuur

LC-MS/MS

Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

LOD

Detectielimiet

LOQ

Quantitatielimiet

MRM

Meervoudige reactiemonitoring

NADP

Gereduceerd nicotinamide-adenine-dinucleotidefosfaat

NADPH

Gereduceerd NADP

naakt

Geen PC

NP

Nanodeeltje

PBS

Fosfaat-gebufferde zoutoplossing

PC

Humane plasma-proteïnecorona

PDI

Polydispersiteitsindex

PEG

Polyethyleenglycol

pHLM

Gepoolde humane levermikrosomen

QC

Kwaliteitscontrole

SWCNT

Enkelwandige koolstofnanobuizen

TEM

Transmissie-elektronenmicroscopie

TFF

Tangentiële stroomfiltratie

TiO₂

Titaandioxide

TST

Testosteron

UPLC TQD

Ultra performance vloeistofchromatografie systeem met driedubbele quadrupool detector