ROS-Responsieve Piperlongumine-afgevende GI-stent: Nieuwe Nanovezel Strategie om Cholangiocarcinoom te Onderdrukken

Samenvatting

Achtergrond

We hebben een medicijn-afgevende gastro-intestinale (GI) stent ontworpen die piperlongumine (PL) afgeeft via reactieve zuurstofsoorten (ROS)-gevoelige nanovezel-matten. De PL-geladen matten zijn ontworpen om een gelokaliseerde, ROS-getriggerde antikankerwerking te bieden tegen cholangiocarcinoom (CCA) cellen.

Methoden

We synthetiseerden een diselenide-gekoppelde blokcopolymeer (LEse) door selenocystamine te conjugeren aan methoxypoly(ethyleenglycol) (MePEG) en vervolgens aan poly(lactide) (PLA). Door electrospinnen van mengsels van poly(ε-caprolacton) (PCL) en LEse in diverse verhoudingen, produceerden we PL-bevattende nanovezel-matten. Deze matten werden gecoat op een siliconen-membraan-gedekte bilière stent. In vitro medicijnafgifte, ROS-responsiviteit en antikankeractiviteit werden geëvalueerd, gevolgd door een in vivo HuCC-T1 xeno-graft studie.

Resultaten

Nanovezels met hogere LEse-inhoud vertoonden ROS-getriggerde versnelling van PL-afgifte, terwijl PCL-enkel matten minimale responsiviteit toonden. PL vrijgemaakt uit de matten behield krachtige cytotoxiciteit tegen diverse CCA-cellijnen, induceerde ROS-generatie en promoveerde apoptose. In HuCC-T1-tumor-dragende muizen remde de PL-afgevende stent de tumorgroei significant en verhoogde caspase-3/9 expressie vergeleken met controles.

Conclusie

LEse-gevoelige nanovezel-matten converteren een conventionele GI-stent met succes in een ROS-responsief, lokaal werkend antikankerplatform. Deze strategie biedt een veelbelovende, gerichte benadering voor het behandelen van onresecteerbaar cholangiocarcinoom.

Achtergrond

Cholangiocarcinoom (CCA) ontstaat uit het galweg-epitheek en is onder de meest agressieve maligniteiten, met stijgende incidentie wereldwijd. Omdat de meeste patiënten presentereren in geavanceerde stadia, is chirurgische resectie zelden haalbaar, en conventionele therapieën – radiotherapie, systemische chemotherapie en metaal stentplaatsing – bieden beperkt voordeel. Stentplaatsing is essentieel om biliaire obstructie te verlichten, doch metalen stents ontberen curatieve eigenschappen en zijn gevoelig voor tumor-overgroei, wat onderzoek naar medicijn-afgevende stents (DES) aanjaagt. Vroege DES-proeven met paclitaxel, sorafenib en vorinostat toonden bescheidene verbeteringen in stent-openheid en tumorremming, doch een curatief effect blijft uit.

Stimuli-responsieve nanomaterialen, met name ROS-gevoelige systemen, zijn uitgegroeid als krachtige medicijn-afgiftplatforms voor kankertherapie. Diselenide-koppelingen in polymeren degraderen in de oxidatieve tumor-micro-omgeving, wat snelle medicijnafgifte triggert. Piperlongumine (PL), een natuurlijk alkaloïde uit Piper longum, verhoogt selectief ROS in kankercellen, wat DNA-schade en apoptose induceert terwijl normale weefslen gespaard blijven. Echter, PL's snelle systemische clearance en nier-toxiciteit noodzaken gelokaliseerde afgifte.

We fabriceren daarom een redox-responsieve, PL-geladen nanovezel-coating voor een GI-stent, benutmakend van de tumor-ROS-milieu om op-verzoek medicijnafgifte en krachtige antikankeractiviteit te bereiken.

Materialen en Methodes

Materialen

PL (LKT Labs, MN, USA), PLA (MW ≈ 5 kDa, Wako), MePEG-NHS (MW ≈ 5 kDa, Sunbio), selenocystamine (Sigma-Aldrich), PCL (MW ≈ 80 kDa, Sigma-Aldrich) en andere reagentia waren analytische graad. De siliconen-membraan-gedekte bilière stent (1 cm × 10 cm) werd afkomstig van M.I. Tech (Pyeongtaek, Korea).

Synthese van LEse Blokcopolymeer

MePEG-NHS werd gereageerd met overmaat selenocystamine in DMSO, gevolgd door dialyse (MWCO 1 kDa) en liofilisatie. Het resulterende MePEG-selenocystamine werd vervolgens gekoppeld aan PLA via EDAC/NHS-chemie, wat het LEse-blokcopolymeer opleverde (opbrengst > 94%). ¹H-NMR bevestigde karakteristieke pieken bij 1,7 ppm en 2,9 ppm (selenocystamine) en 3,5-3,7 ppm (MePEG). GPC-analyse gaf Mn ≈ 8,2 kDa en Mw ≈ 9,5 kDa.

Bereiding van PL-geladen Nanovezel-matten en Stent-coating

PL werd opgelost in aceton (10 mg mL⁻¹). LEse (100-400 mg) en PCL (600-900 mg) werden toegevoegd, 2 uur gerold en ge-electrospun op de stent (15 kV, 100 µL min⁻¹, 500 rpm). De gecoate stent werd 24 uur vacuüm-gedroogd en opgeslagen bij 4 °C.

Medicijn Lading en Afgifte Studies

Medicijninhoud gekwantificeerd door UV-Vis bij 325 nm na oplossen van 5 mg matten in DMSO. Afgifte gemonitord in PBS (0,01 M, pH 7,4) bij 37 °C met en zonder 10 mM H₂O₂. Monsters verzameld op vooraf bepaalde intervallen en geanalyseerd door UV-Vis.

Celkweek en Antikanker Assays

Humane CCA-lijnen (SNU-478, SNU-245, SNU-1196, HuCC-T1) werden gekweekt in RPMI-1640 met 10% FBS. Cellen behandeld met PL, vrijgemaakte PL (dag 5 of 15), of voertuig gedurende 48 uur, viabiliteit beoordeeld via MTT. IC₅₀-waarden berekend.

ROS Meting

DCFH-DA fluorescentie (485 nm/535 nm) kwantificeerde intracellulaire ROS na 6-12 uur blootstelling aan PL of vrijgemaakte PL.

Western Blotting

Cellen gelyseerd 24 uur post-behandeling, eiwitextracten (50 µg) gescheiden door SDS-PAGE, overgebracht naar PVDF, en geprobed voor BAX, caspase-3/7/9, en gespleten PARP. Banden gevisualiseerd door chemiluminescentie en gekwantificeerd met ImageJ.

In Vivo Tumor Xeno-graft Model

BALB/c naakte muizen ontvingen subcutane HuCC-T1-cellen (1 × 10⁶ cellen). Toen tumoren 4-5 mm bereikten, werden PL-geladen of lege nanovezel-schijven (10 mg PL kg⁻¹) geïmplanteerd onder de tumor. Tumorvolumes gemeten elke 5 dagen, berekend als V = (a × b²)/2. Alle procedures goedgekeurd door PNUIACUC (Goedkeuring Nr. PNU-2017-1608).

Immunohistochemie

Tumorcoupes gekleurd voor caspase-3 en caspase-9 met standaard protocollen. Kleurintensiteit kwalitatief gescoord.

Statistische Analyse

Data geanalyseerd met Student's t-toets; p < 0,05 beschouwd als significant.

Resultaten

Polymeer Karakterisatie

Het LEse-blokcopolymeer werd met succes gesynthetiseerd, bewijs geleverd door ¹H-NMR en GPC. Mengverhoudingen van PCL tot LEse werden gevarieerd om vezelmorfologie en medicijnafgifte te optimaliseren.

Nanovezel Morfologie en Medicijnlading

FE-SEM-beelden onthulden dat zuiver PCL fijn, uniforme vezels produceerde, terwijl LESE-toevoeging korrels en irregulariteiten induceerde bij hogere lading (≥ 50% LEse). Optimale matten (60% LEse) behielden acceptabele vezelmorfologie en incorporeerden PL bij theoretische ladingen (~10% w/w).

ROS-Responsieve Medicijnafgifte

PL-afgifte was uitgezaaid over 25 dagen, met een burst-fase tot 4 dagen. Mat-samenstellingen met hogere LEse versnelden afgifte, met name in aanwezigheid van H₂O₂, wat ROS-gevoeligheid bevestigt. PCL-enkel matten vertoonden verwaarloosbare responsiviteit.

In Vitro Antikanker Activiteit

Vrijgemaakte PL van dag 5 en dag 15 behield cytotoxiciteit vergelijkbaar met vers opgeloste PL over alle CCA-lijnen, met IC₅₀-waarden slechts lichtjes hoger. ROS-assays toonden aan dat zowel PL als vrijgemaakte PL significante intracellulaire ROS induceerden. Western blotting demonstreerde upreregulatie van BAX, caspase-3/7/9 en gespleten PARP, wat apoptose-inductie aangeeft.

In Vivo Effectiviteit

In het HuCC-T1 xeno-graft model verminderden PL-geladen stents tumorvolume tot een derde van controles en verhoogden caspase-3/9 expressie, terwijl lege stents of voertuig geen effect hadden.

Discussie

De verhoogde ROS-niveaus in de tumor-micro-omgeving triggeren zowel PL-geïnduceerde apoptose als versnellen afgifte van de diselenide-gekoppelde nanovezels, wat een synergistische, gelokaliseerde therapeutische effect creëert. Deze dubbele actie mitigeert systemische blootstelling en adresseert de uitdagingen van conventionele DES, die tumor-gerichte afgifte missen.

Conclusie

We hebben aangetoond dat een ROS-responsieve PL-geladen nanovezel-coating op een GI-stent effectief antikankertherapie aflevert aan cholangiocarcinoom-tumor in vitro en in vivo. Dit platform biedt een veelbelovende strategie voor lokale, gecontroleerde behandeling van onresecteerbare CCA.