Antioxidant potentieel van extracten van Artemisia capillaris, Portulaca oleracea en Prunella vulgaris voor biofabricage van gouden nanodeeltjes en cytotoxiciteitsbeoordeling

Resultaten en discussie

Antioxidant-activiteiten van de extracten

Waterige extracten van de bovengrondse delen van elke plant werden verkregen door sonicatie. De extractieopbrengsten van A. capillaris , P. oleracea , en P. vulgaris waren respectievelijk 14,1%, 39,12% en 28,6%. De hoogste extractieopbrengst werd getoond in P. oleracea , gevolgd door P. vulgaris en tot slot door A. capillaris . Om de antioxiderende werking van de extracten te beoordelen, hebben we de activiteit van vrije radicalen, het verminderend vermogen en het totale fenolgehalte gemeten. De activiteiten voor het opruimen van vrije radicalen van de extracten werden bepaald met DPPH- en ABTS-assays. DPPH wordt veel gebruikt om de antioxidantactiviteit van fenolische verbindingen te beoordelen, omdat de DPPH-radicaal een stabiele vrije radicaal is die zijn absorptie-intensiteit verliest wanneer deze wordt verminderd door antioxidanten. De ABTS-assay meet het vermogen van een antioxidant om de radicalen op te vangen die worden gegenereerd door de reactie van een sterk oxidatiemiddel met ABTS. De vermindering van de absorptie van het ABTS-radicaal door antioxidanten met waterstofdonerende eigenschappen wordt beoordeeld. De waterige extracten vertoonden wegvangende activiteiten op een dosisafhankelijke manier. Bij de geteste concentraties (15,63 g/ml, 31,25 μg/mL, 62,5 g/mL, 125 μg/ml en 250 μg/mL) werd het extract van P. vulgaris (IC₅₀ 50,35 ± 1,22 μg/mL tegen DPPH-radicaal; IC₅₀ 38,6 ± 0,44 μg/ml tegen ABTS-radicaal) vertoonden de meest krachtige activiteiten tegen de DPPH- en ABTS-radicalen, gevolgd door het extract van A. capillaris (IC₅₀ 156,72 ± 0,97 g/mL tegen DPPH-radicaal; IC₅₀ 147,28 ± 2,95 μg/mL tegen ABTS-radicaal) en vervolgens het extract van P. oleracea (IC₅₀ 247,33 ± 1,57 μg/ml tegen DPPH-radicaal; IC₅₀ 305,54 ± 4,86 g/mL tegen ABTS-radicaal). Met name P. vulgaris vertoonde een krachtigere DPPH-activiteit voor het opruimen van vrije radicalen dan BHT (IC₅₀ 71,37 ± 0,84 μg/ml), die als standaard werd gebruikt (tabel 1 en afb. 1a, b). Het uittreksel van P. vulgaris toonden de hoogste DPPH- en ABTS-activiteiten op het gebied van radicalen wegvangen van de drie extracten. Dit resultaat impliceerde dat er mogelijk meer antioxidanten zouden zijn in P. vulgaris dan in A. capillaris en P. oleracea.

DPPH en ABTS radicalen wegvangende activiteiten en verminderend vermogen van de waterige extracten van A. capillaris , P. oleracea , en P. vulgaris . een DPPH radicale opruimingsactiviteiten. b ABTS radicale opruimingsactiviteiten. c Verminderende kracht van de extracten. De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde  ± SEM. De sterretjes geven de significantie aan van het verschil ten opzichte van de standaard (BHT of vitamine C):*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001. De resultaten zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten

We onderzochten ook de antioxiderende werking van de extracten via een reducerende vermogenstest. In aanwezigheid van antioxidanten, kaliumferricyanide (Fe ³⁺ ) wordt omgezet in kaliumferrocyanide (Fe ²⁺ ), die reageert met ijzerchloride om een ​​ijzer-ijzer-complex te vormen. Het ijzer-ijzer-complex heeft een maximale absorptie bij 700 nm, wat kan worden gebruikt om het reducerende vermogen van een antioxidant te evalueren. In het huidige rapport wordt het reducerende vermogen uitgedrukt als de concentratie (μg/ml) van elk extract dat een absorptie van 0,7 bij 700 nm gaf. Zoals weergegeven in Afb. 1c, P. vulgaris (162,98 μg/ml) oefende een opmerkelijk hoger reducerend vermogen uit dan A. capillaris (235,38 μg/ml) en P. oleracea (396,16 g/ml). Zoals eerder vermeld, gaven de resultaten van het verminderen van het vermogen ook aan dat er mogelijk meer antioxidanten in P. vulgaris dan in A. capillaris en P. oleracea.

Het totale fenolgehalte van elk extract werd ook onderzocht. Het is algemeen bekend dat fenolische verbindingen potentiële antioxidanten zijn en het vermogen bezitten om radicalen op te vangen dankzij hun hydroxylgroepen. De antioxidantactiviteit van een plantenextract kan dus goed correleren met het fenolgehalte ervan. Er werd een standaard kalibratiecurve geconstrueerd met behulp van galluszuur, en deze curve vertoonde een lineair verband (y = 6.0617x + 0.1293, r ² = 0.9983). Met behulp van de standaardcurve werd het totale fenolgehalte berekend en uitgedrukt als milligram galluszuurequivalent (GAE) per gram extract. Het totale fenolgehalte van de extracten was 90,53 ± -6,81 mg GAE/g voor P. vulgaris , 39,88 ± 4,55 mg GAE/g voor A. capillaris , en 18,32 ± 2,76 mg GAE/g voor P. oleracea . De hoeveelheid totaal fenolgehalte was het hoogst in P. vulgaris tussen de drie uittreksels.

Er was een positieve correlatie tussen het totale fenolgehalte en het vermogen van de extracten om radicalen op te vangen of hun reducerend vermogen. De waterige extracten van A. capillaris , P. oleracea , en P. vulgaris vertoonden significante antioxiderende activiteiten. Met name het uittreksel van P. vulgaris vertoonde de grootste activiteit van radicalen tegen zowel DPPH- als ABTS-radicalen, het sterkste reducerende vermogen en het hoogste totale fenolgehalte, wat impliceert dat het extract van P. vulgaris zou de sterkste activiteit uitoefenen als een reductiemiddel voor de biofabricage van AuNP's. Deze interessante resultaten van biofabricage van AuNP's met behulp van de drie extracten zullen in de volgende sectie worden besproken.

Biofabricage van AC-AuNP's, PO-AuNP's en PV-AuNP's

We hebben voorgesteld dat de antioxidantactiviteit van het extract het biofabricageproces van AuNP's sterk beïnvloedt. Omdat de antioxidantactiviteit een belangrijke drijvende kracht is in de reductie van Au-zouten tot AuNP's, is P. vulgaris , dat de hoogste antioxidantactiviteit heeft, kan het meest efficiënte reductiemiddel zijn. Het biofabricageproces werd gevolgd door UV-zichtbare spectrofotometrie, aangezien AuNP's een onderscheidende SPR hebben in het zichtbare-nabij-infraroodgolflengtebereik. De biofabricage van AuNP's werd uitgevoerd door Au-zouten te mengen met elke extractoplossing. Elk extract bevatte diverse fytochemicaliën die zeer efficiënt zijn voor de reductie van Au-zouten tot AuNP's.

De duidelijke SPR-band van AuNP's resulteerde in veranderingen in de kleur van de aanvankelijk lichtgele oplossing in donkerblauw voor de PO-AuNP's, fluorescerend bruin voor de AC-AuNP's en wijnrood voor de PV-AuNP's (Fig. 2) . UV-zichtbare spectra werden opgenomen na incubatie bij 37 ° C in een droge oven gedurende 5 uur om de verschillende SPR-band van elke set AuNP's te observeren (Fig. 3). De maximale absorptie werd waargenomen bij 530 nm voor de PV-AuNP's en bij 555 nm voor de AC-AuNP's. In het geval van de PO-AuNP's werd een brede SPR-band waargenomen van 500 tot 700 nm. De drie extracten genereerden AuNP's met een karakteristieke SPR-band in UV-zichtbare spectra. Elke kleurverandering samen met de duidelijke SPR-band ondersteunde duidelijk de succesvolle biofabricage van AuNP's met elk extract. We stelden voor dat de drie factoren die verband houden met de antioxidantactiviteiten (de activiteit van vrije radicalen, het totale fenolgehalte en het verminderende vermogen) van invloed zijn op de biofabricage van AuNP. Het uittreksel van P. vulgaris scoorde het hoogst voor alle drie de factoren, gevolgd door A. capillaris en tot slot door P. oleracea . Interessant genoeg bleken de PO-AuNP's te aggregeren na opslag bij omgevingstemperatuur (25°C) gedurende 30 minuten. Dit resultaat suggereerde dat de PO-AuNP's het meest onstabiel waren, aangezien de antioxidantactiviteit, de hoeveelheid totale fenolische verbindingen en het verminderende vermogen van P. oleracea waren de laagste van deze drie extracten. Daarentegen vertoonden de PV-AuNP's de hoogste absorptie en een transparante wijnrode oplossing. De absorptie van de AC-AuNP's lag tussen die van de PO-AuNP's en de PV-AuNP's. Daarom werd op basis van deze waarnemingen vastgesteld dat een hogere activiteit van vrije radicalen, het totale fenolgehalte en het verminderende vermogen van de P. vulgaris extract resulteerde in de synthese van stabielere AuNP's in vergelijking met de AuNP's geproduceerd door de extracten van A. capillaris en P. oleracea . Gezamenlijk vertoonden de maximale SPR-banden bathochrome en hypochrome verschuivingen met afnemende antioxidantactiviteit van het extract. Bovendien had de vorm van de SPR-band de neiging om te verbreden met de afname van de antioxidantactiviteit. Dienovereenkomstig werden de PV-AuNP's verder gekarakteriseerd door HR-TEM, HR-XRD, hydrodynamische grootte en zeta-potentiaalmetingen. Om de reactieopbrengst te bepalen, werd ICP-OES-analyse uitgevoerd. De antioxidantactiviteit en cytotoxiciteit in de aanwezigheid/afwezigheid van FBS werden verder geëvalueerd tegen kankercellen.

Digitale foto's van PO-AuNP's, AC-AuNP's en PV-AuNP's

UV-zichtbare spectra van PO-AuNP's (zwarte lijn), AC-AuNP's (rode lijn) en PV-AuNP's (blauwe lijn)

HR-TEM-afbeeldingen van de PV-AuNP's

Microscopische technieken zijn de meest effectieve hulpmiddelen om nanodeeltjes te visualiseren. Samen met HR-TEM worden scanning-elektronenmicroscopie en atoomkrachtmicroscopie vaak gebruikt om de grootte, morfologie, topografie en tweedimensionale/driedimensionale structuren te bepalen. De grootte en morfologie van de PV-AuNP's werden onderzocht met HR-TEM. Zoals te zien is in figuur 4, werden verschillende vormen waargenomen, waaronder bollen, driehoeken, staven, ruiten en zeshoeken (figuur 4a~e). De waarneming van roosterstructuren in een staaf (Fig. 4f, g) en een driehoek (Fig. 4h) toonde duidelijk aan dat de PV-AuNP's kristallijn van aard waren. Dit resultaat werd sterk ondersteund door de daaropvolgende HR-XRD-analyseresultaten. De grootte van elke deeltjesvorm werd gemeten aan de hand van de HR-TEM-afbeeldingen en de resulterende histogrammen van de grootte worden geïllustreerd in Fig. 5. Alle histogrammen vertoonden een Gauss-verdeling. Discrete nanodeeltjes in de afbeeldingen werden willekeurig geselecteerd om een ​​gemiddelde grootte van elke vorm te verkrijgen. De diameter van de bollen werd bepaald op 23,8 ±   1,3 nm uit 250 nanodeeltjes (figuur 5a). Interessant is dat gelijkzijdige driehoeken werden geproduceerd; dus hebben we de hoogten van 64 nanodeeltjes gemeten (25,7 ± 2,2 nm, figuur 5b). Zevenentwintig staafvormige nanodeeltjes werden willekeurig gekozen om de gemiddelde lengte te bepalen (28,4 ± 0,4 nm, figuur 5c). De gemiddelde aspectverhouding, gedefinieerd als de lengte gedeeld door de breedte, van de staven werd bepaald op 2,4. Voor de ruitvorm werden 38 ruiten willekeurig geselecteerd in de afbeeldingen. Zoals weergegeven in figuur 5d, e, werden de gemiddelde lengtes van de lange en korte diagonale lijnen gemeten als respectievelijk 22,0 ±  0,6 nm en 15,4 ±  0,3 nm. Divers gevormde PV-AuNP's hadden een afmeting van minder dan 30 nm, en de afmetingen werden vergeleken met de hydrodynamische afmetingen in het volgende gedeelte.

HR-TEM Afbeeldingen van PV-AuNP's. De schaalbalk staat voor a 50 nm, b 50 nm, c 50 nm, d 50 nm, e 10 nm, f 2 nm, g 2 nm, en u 2 nm

Groottehistogrammen van PV-AuNP's. een De diameter van bollen. b De hoogte van gelijkzijdige driehoeken. c De lengte van de staven. d De lengte (lange diagonale lijn) van ruit. e De lengte (korte diagonale lijn) van ruit

Hydrodynamische grootte en zeta-potentieel van de PV-AuNP's

De hydrodynamische grootte en het zeta-potentieel zijn belangrijke kenmerken in nanodeeltjesonderzoek voor verdere toepassingen. Over het algemeen is de grootte gemeten op basis van HR-TEM-afbeeldingen kleiner dan die van de hydrodynamische grootte, omdat de hydrodynamische grootte de biomoleculen weerspiegelt die aan het oppervlak van de nanodeeltjes zijn gebonden. Zoals weergegeven in figuur 6a, werd vastgesteld dat de hydrodynamische grootte 45  ±  2 nm was met een polydispersiteitsindex van 0,258, wat groter was dan de grootte van de bollen gemeten op basis van de HR-TEM-afbeeldingen (23,8 ±-1,3 nm van 250 nanodeeltjes) . Dit resultaat suggereerde duidelijk dat de fytochemicaliën in het extract aan het oppervlak van de PV-AuNP's bonden en ze stabiliseerden. Bovendien hadden de PV-AuNP's een negatief zeta-potentiaal van -13,99 mV (figuur 6b). Deze resultaten toonden aan dat fytochemicaliën met negatieve ladingen hoogstwaarschijnlijk hebben bijgedragen aan het negatieve zeta-potentieel. Deze negatieve zeta-potentiaal geeft afstotende krachten in een colloïdale oplossing van PV-AuNP's die de stabiliteit ervan schenken. Daarom zal een van onze toekomstige werken de fytochemische screening op het extract van P. vulgaris om de exacte verbindingen op te helderen die bijdragen aan de negatieve zeta-potentiaal.

Hydrodynamic size and zeta potential of PV-AuNPs. een Hydrodynamic size. b Zeta potential

HR-XRD Analysis of the PV-AuNPs

X-ray diffraction analysis is generally employed to obtain crystallographic information about metallic nanoparticles. The characteristic diffraction patterns in terms of the Bragg reflections obtained from HR-XRD showed that the PV-AuNPs possessed a crystalline structure. The diffraction peaks (2θ values) observed at 38.1°, 44.5°, 64.8°, and 77.4° corresponded to the (111), (200), (220), and (311) planes, respectively, of a face-centered cubic structure in the PV-AuNPs (Fig. 7). The Scherrer equation (D  = 0.89·λ/W·cosθ ) was used to determine the approximate size of the PV-AuNPs. We selected the most intense (111) peak for application in the equation. The definition of each term in the equation is as follows:D is the size of the PV-AuNPs determined from the (111) peak, θ is the Bragg diffraction angle of the (111) peak, λ is the X-ray wavelength that was utilized, and W is the full width at half maximum (FWHM) of the (111) peak, in radians. From the Scherrer equation, the approximate size of the PV-AuNPs was determined to be 16.7 nm. The size determined from the Scherrer equation was smaller than the sizes measured from both HR-TEM images and the hydrodynamic size. The hydrodynamic size was the largest, possibly due to the fact that phytochemicals in the extract bound to the surface of the PV-AuNPs.

HR-XRD analysis of PV-AuNPs

Reaction Yield of the PV-AuNPs

ICP-OES was used to estimate the reaction yield. First, the total concentration of Au was obtained by analyzing the PV-AuNP solution. Second, the PV-AuNPs were centrifuged and the supernatant was collected. The supernatant was analyzed to ascertain the concentration of unreacted Au in the reduction reaction. Then, the reaction yield was estimated as follows:reaction yield (%) = 100 − [Au concentration in the supernatant/Au concentration in the colloidal solution] × 100.

Based on ICP-OES analysis, the concentrations of Au in the colloidal PV-AuNP solution and the supernatant were determined to be 96.337 ppm and 0.679 ppm, respectively. Therefore, the reaction yield of the PV-AuNPs was determined to be 99.3%. From the ICP-OES results, we concluded that the reaction condition was optimal which produced a high reaction yield of PV-AuNPs.

Antioxidant Activity of the PV-AuNPs

The DPPH radical scavenging activity was examined to evaluate the antioxidant activity of the PV-AuNPs. As shown in Fig. 8, the DPPH radical scavenging activity of the PV-AuNPs was nearly constant at a concentration of less than 20.9 μg/mL (based on the Au concentration). However, as the concentration increased (41.9~334.8 μg/mL based on the Au concentration), the DPPH radical scavenging activity also increased, suggesting that the activity was dose-dependent. De IC₅₀ of the PV-AuNPs was observed to be 165.0 μg/mL, which was equivalent to the IC₅₀ of vitamin C (49.4 μM).

DPPH radical scavenging activity of PV-AuNPs. The concentration was expressed as Au concentration

Green-synthesized AuNPs or AgNPs have been known to possess antioxidant activity in terms of DPPH radical scavenging activity [20, 21]. Ginseng-berry-mediated AuNPs demonstrated antioxidant activity [20]. The absorption of phytochemicals in the ginseng berry extract on the surface of nanoparticles having a large surface area can be credited to the antioxidant activity of AuNPs [20]. Green-synthesized AuNPs using Angelica pubescens roots showed antioxidant activity with a dose-dependent manner [21]. Secondary metabolites in A. pubescens such as flavonoids, sesquiterpenes, and phenolic compounds are potential contributors for the free radical scavenging activity [21]. However, AgNPs demonstrated higher antioxidant activity than AuNPs in the two articles mentioned above.

Cytotoxicity of the PV-AuNPs

The cytotoxicity of the PV-AuNPs against three cancer cells from different tissue types (colon, pancreas, and breast) was evaluated to examine the tissue-specific cytotoxicity of the nanoparticles in the presence/absence of FBS (Fig. 9). When serum was present during the cell culture, various kinds of protein coronas formed. The protein corona was dependent on the characteristics of the nanoparticles, such as the size, shape, surface charge, and surface roughness [22]. The protein corona can either increase or decrease the cellular uptake and cytotoxicity of the nanoparticles [23]. However, there are controversial reports regarding whether the protein corona causes the cytotoxicity to increase or decrease. Thus, the cytotoxicity of the PV-AuNPs was evaluated in the presence and absence of FBS. In the absence of FBS, HT-29 showed the greatest cytotoxicity at the tested concentrations (29.9~478.3 μg/mL) among three cells (Fig. 9a), followed by MDA-MB-231 (Fig. 9b) and lastly by PANC-1 (Fig. 9c). However, in the presence of FBS, these cells demonstrated a different phenomenon. PANC-1 showed the highest cytotoxicity, followed by HT-29 cells. In the absence of FBS and with 478.3 μg/mL Au, both the PANC-1 and MDA-MB-231 cells did not show any significant cytotoxicity, while strong cytotoxicity was observed for the HT-29 cells (65.6% cytotoxicity). However, in the presence of FBS, cytotoxicity was observed for PANC-1 (37.5% cytotoxicity) at 478.3 μg/mL Au. In general, the PV-AuNPs surrounded by a protein corona strongly influenced the cytotoxicity against cancer cells, although the results were tissue-specific. The protein corona produced by FBS increased the cytotoxicity against PANC-1 when compared with the cytotoxicity in the absence of FBS; however, the cytotoxicity decreased in the presence of the protein corona for HT-29 when compared with the cytotoxicity without the protein corona.

In vitro cytotoxicity on cancer cells. een HT-29. b MDA-MB-231. c PANC-1

It has been reported that a variety of proteins bind to both positively and negatively charged AuNPs, while few proteins bind to AuNPs with a neutral charge [17, 24]. The negatively charged AuNPs showed a higher affinity and a slower release of fibrinogen protein than the positively charged AuNPs, suggesting the existence of specific binding sites for fibrinogen on the negatively charged AuNPs [17]. The PV-AuNPs possessed a negative zeta potential; thus, the binding of fibrinogen may affect the cytotoxicity against cancer cells. The investigation of the protein corona of nanoparticles is beneficial in nanomedicine research for future biomedical and clinical applications.