Ultra-gevoelige, label-vrije immunoassay met goud nanopartikelen-grafene oxide hybride plasmonische biosensoren

Achtergrond

Koolstof-gebaseerde nanomaterialen—grafene, koolstofnanobuisjes en grafene oxide (GO)— zijn basis geworden in biosensing vanwege hun uitzonderlijke elektrische, optische en oppervlaktechemie. GO's twee-dimensionale structuur en zuurstofrijke functionele groepen (epoxiden, hydroxylen, carboxylen) verlenen hoge proteïneaffiniteit en maken covalente koppeling mogelijk, wat het een aantrekkelijk substraat maakt voor electrochemische, fluorescentie, SPR en LSPR sensoren. Goud nanopartikels (AuNPs) brengen afstelbare plasmonische absorptie, biocompatibiliteit en gemakkelijke oppervlaktechemie, waardoor ze fungeren als signaalversterkers of optische tags. Wanneer AuNPs op GO gedecoreerd zijn, erf het hybride de snelle binding van GO en de intense LSPR van AuNPs, wat leidt tot verbeterde gevoeligheid in immunoassays, DNA detectie en enzymatische assays. Ondanks uitgebreide electrochemische en SERS studies, zijn er tot nu toe geen snelle, colorimetrische of label-vrije immunoassays gebaseerd op nakende-oog AuNP-GO hybriden gerapporteerd. Deze studie vult die leemte door een chemisorptie-gebaseerde, LSPR-verbeterde immunoassay te ontwikkelen die in aqueous buffer werkt en gangbare interferenten verdraagt.

Methodes/Experimenteel

Materialen

Grafiet (Graphene Supermarket), GO (gemodificeerde Hummers methode, 0,1–1 µm vloeijen, 1,1 nm dik), cystamine dihydrochloride (Cys, 96 %), HAuCl₄·3H₂O (99,99 %), natriumcitraat, BSA, anti-BSA (konijn IgG), NHS en EDC werden alle verkregen van Sigma-Aldrich of Alfa Aesar. Alle reagentia werden zonder verdere zuivering gebruikt.

Synthese van AuNPs

AuNPs werden gesynthetiseerd door citraatreductie: 15 mL van 1 mM HAuCl₄ werd teruggekoken bij 550 °C, 1100 toer/min; 1,8 mL van 38,8 mM natriumcitraat werd toegevoegd. Na 5 min werd het mengsel gekookt bij 400 °C, 900 toer/min gedurende 30 min en afgekoeld tot kamertemperatuur. Deze procedure levert ~15 nm bolvormige AuNPs op; gebruik van 0,8 mL citraat produceert ~60 nm deeltjes. De reactie: HAuCl₄ + C₆H₅O₇Na₃ → Au(s) + CO₂ + HCOOH.

Bereiding van GO-BSA Antigeen Doelwit

GO vloeijen (0,1 g L⁻¹) werden geactiveerd met EDC (400 µM) en NHS (100 µM) (1:1 volume verhouding). BSA (20 µL, 100 µg mL⁻¹) werd covalent gekoppeld via amide binding vorming en gezuiverd door herhaalde centrifugatie. Figuur 1 illustreert de GO-BSA conjugatie workflow.

GO-BSA interactie. De carboxylgroep van GO vloeijen kan geactiveerd worden met EDC/NHS reactie en bereiding van het GO gebaseerd op antigeen doelwit voor GO-BSA

Bereiding van AuNP-antiBSA Probe

AuNPs werden gefunctionaliseerd met Cys (10 mM, 2 uur, RT) om blootgestelde –NH₂ groepen te introduceren. Anti-BSA (20 µL, 100 µg mL⁻¹) werd vervolgens gekoppeld via amide bindingen zonder additionele activering, gevolgd door centrifugatie om ongebonden antilichaam te verwijderen. Seriële verdunningen van 100 µg mL⁻¹ tot 1 pg mL⁻¹ produceerden een reeks AuNP-antiBSA probes (Fig. 2a). AuNP-GO-antiBSA composieten werden samengesteld door EDC/NHS activering van GO carboxylen en covalente hechting van Cys-gemodificeerde AuNPs, daarna antilichaam koppeling (Fig. 2b).

AuNP-antiBSA en AuNP-GO-antiBSA interacties. Bereiding van de a AuNPs en b AuNP-GO gebaseerd op antilichaam probe

Karakteriseringstechnieken

Structurele en optische karakterisering werd uitgevoerd met FE-TEM, HR-TEM, SEM (JEOL JSM-7800F), UV-vis spectroscopie (U-2900, Hitachi), Raman microscopie (MRI, Protrustech), FTIR (Bruker Vertex 80v ATR) en XPS (National Synchrotron Radiation Research Center). AuNP grootte, verdeling en oppervlaktechemie werden bevestigd over alle monsters.

Resultaten en Discussie

Morfologie en Samenstelling

SEM en TEM onthulden uniforme 60-nm AuNPs gelijkmatig verdeeld op gerimpelde GO vloeijen (Fig. 3). XPS bevestigde de aanwezigheid van C-C (sp²), C-C (sp³), C-O, C=O en O-C=O functionele groepen op GO, terwijl Au 4f pieken AuNP integratie verifieerden.

Oppervlaktemorfologie analyse van het nanocomposiet. a SEM beelden van een GO vloei en b TEM beeld van AuNP-GO composiet. c TEM beeld van de ERGO AuNP-GO film

Spectroscopische Karakterisering van GO

Hoog-resolutie C 1s XPS, Raman en ATR-FTIR spectras bevestigen de karakteristieke zuurstofgefunctionaliseerde groepen van GO (sp² C, epoxiden, hydroxylen, carbonylen, carboxylen). Raman pieken bij 1355 cm⁻¹ (D), 1614 cm⁻¹ (G) en 2714 cm⁻¹ (2D) bevestigen de gelaagde structuur (Fig. 4).

Spectrale analyse van GO vloeijen. a XPS hoog-resolutie scan in C1s regio, b Raman, en c FTIR

Proteïne Interactie en LSPR Respons

UV-vis spectras van AuNPs (15 nm en 60 nm) tonen LSPR pieken bij 520 nm en 540 nm respectievelijk. GO alleen vertoont π-π* absorptie bij 230 nm en n-π* bij 300 nm. Na functionalisatie vertonen AuNP-Cys-antiBSA conjugaten dubbele pieken bij 540 nm (AuNP) en 755 nm (AuNP-Cys-antiBSA) met een concentratie-afhankelijke verschuiving (Fig. 5). Kalibratiecurven (y = 2,43 + 0,25 x, R² = 0,91 voor 540 nm; y = 2,56 + 0,31 x, R² = 0,96 voor 760 nm) bevestigen lineariteit over 1,45 nM tot 145 fM anti-BSA.

Analyse van UV-vis absorptiespectra voor AuNP met antiBSA interactie respons. a SP absorptiespectra van AuNPs, b GO-gebonden BSA, c AuNP-anti-BSA probe, en d Kalibratiecurven voor AuNP met antiBSA interactie respons bij verschillende verdunningen van antiBSA proteïne van 1,45 nM ~ 145 fM

AuNP-GO-antiBSA hybriden versterken het LSPR signaal verder. Bij toevoeging van GO-BSA doelen verschuift de 540-nm piek lineair met anti-BSA concentratie (1,45 nM–145 fM), wat een LOD van 145 fM oplevert (Fig. 6). Kalibratie voor de AuNP-GO probe (f(x) = 0,918 + 0,124 x, R² = 0,94) en voor GO alleen (f(x) = 0,791 + 0,057 x, R² = 0,954) tonen superieure gevoeligheid van het hybride systeem.

Analyse van UV-vis absorptiespectra voor immuunrespons. a AuNP-gebonden GO en GO-gebonden BSA, b AuNPs en GO-gebonden anti-BSA, c AuNP-GO-antiBSA probe, en d AuNP-GO-antiBSA probe en GO-BSA doelwit voor immuunrespons

Interferentie studies met 10 ng ml⁻¹ hCG toonden minimale kruisreactiviteit (R² = 0,89 voor AuNP-GO; 0,73 voor GO alleen), wat assay robuustheid bevestigt. De sensor behield prestaties na vier regeneratiecycli, wat hoge oppervlaktetabiliteit aangeeft.

Conclusies

We hebben een biocompatibel AuNP-GO hybride ontworpen dat LSPR benut om label-vrije detectie van anti-BSA bij 145 fM te bereiken. Het nanocomposiet vertoont hoge bioaffiniteit, snelle respons en weerstand tegen gangbare interferenten, wat het een overtuigend platform maakt voor point-of-care immunoassays. Toekomstig werk zal multiplex detectie verkennen, integratie in microfluidische apparaten en aanpassing aan klinisch relevante biomarkers.

Afkortingen

Ag:

Zilver

AntiBSA:

Bovine serum albumine antilichaam

Au:

Goud

AuNP:

Goud nanopartikelt

BSA:

Bovine serum albumine

Cys:

Cystamine

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

FEG-TEM:

Field-emission gun transmissie elektronenmicroscoop

FTIR:

Fourier-transformatie infrarood spectrometer

GO:

Grafene oxide vloei

HR-TEM:

Hoog-resolutie transmissie elektronenmicroscoop

LOD:

Detectielimiet

LSPR:

Gelokaliseerde oppervlakte plasmon resonantie

MOA:

8-Mercaptooctaanzuur

NHS:

N-Hydroxysuccinimide

Pd:

Palladium

POCT:

Point-of-care testing

Pt:

Platina

RGO:

Gereduceerde grafene oxide

SAMs:

Zelf-geassembleerde monolagen

SERS:

Oppervlakte-versterkte Raman verstrooiing

UV-vis:

Ultraviolet-zichtbaar

XPS:

Röntgenfoto-elektronspectroscopie

ZnO:

Zinkoxide