Ontmaskering van E. coli Genotype-Specifieke Macromoleculen met AFM Nanomechanische Mapping

Samenvatting

De categorisatie van microbiele stammen is conventioneel gebaseerd op moleculaire methoden, en zelden worden de morfologische kenmerken in bacteriële stammen bestudeerd. In dit onderzoek onthulden we de macromoleculaire structuren van het bacteriële oppervlak via AFM mechanische mapping, wiens resolutie niet alleen werd bepaald door de nanoschaal tipgrootte maar ook de mechanische eigenschappen van het monster. Deze techniek maakte nanoschaal studie van membraanstructuren van microbiele stammen mogelijk met eenvoudige monsterbereiding en flexibele werkomgevingen, wat de meerdere beperkingen in elektronenmicroscopie en label-gebaseerde biochemische analytische methoden overkwam. De karakteristieke macromoleculen gelegen op het cellulaire oppervlak werden beschouwd als oppervlaktelaag eiwritten en bleken specifiek te zijn voor de Escherichia coli genotypes, waarvan de gemiddelde moleculaire groottes gekarakteriseerd werden met diameters variërend van 38 tot 66 nm, en de moleculaire vormen waren nier-vormig of rond. Concluderend, de oppervlakte macromoleculaire structuren hebben unieke kenmerken die linken aan de E. coli genotype, wat suggereert dat de genomische effecten op cellulaire morfologieën snel geïdentificeerd kunnen worden met AFM mechanische mapping.

Achtergrond

Vanwege de inferieure resolutie van optische microscopie en de beperkte werkomgeving van elektronenmicroscopie, overwegen onderzoekers in het microbiele veld zelden het uiterlijk van bacteriële cellen, maar adoptieren ze moleculaire of chemische analytische methoden voor de identificatie van genomische fragmenten, expressie van eiwritten, etc. Het is niet verrassend dat die methoden een aantal nadelen hebben, waaronder arbeidsintensief en tijdrovend, en dus zijn meer rechttoe, efficiënte en flexibele benaderingen nodig. Uitgevonden in 1982 door Binnig et al., is de atoommachtmicroscoop (AFM) ontworpen om een nanoschaal punt te gebruiken gemonitord door een laserbundel voor de observatie van een monsters oppervlak met nanoscopische of zelfs atoomaire resolutie. Het beeldvormen van de morfologie via een fysieke punt overkomt de resolutielimiet en omgevingsbeperkingen van zowel optische als elektronenmicroscopie en heeft een aantal voordelen, zoals eenvoudige monsterbereiding en flexibele werkomgevingen in omgevingslucht of vloeistofcondities. Nog steeds, met betrekking tot microbiele studies, omvatten de huidige toepassingen van AFM voornamelijk kwalitatief beeldvormen van de statische of dynamische morfologieën van bacteriële cellen of de expressie van flagella en pili, terwijl weinig studies zich richten op de oppervlakte ultrastructuur van microbiele cellen en de kwantitatieve analyse van cellulaire eigenschappen.

In dit onderzoek werd AFM geselecteerd voor de oppervlaktstudie van Escherichia coli (E. coli) cellen, en de vormen en dimensies van de individuele bacterie werden waargenomen door de AFM topografie en fasebeelden. Bovendien werd gelijktijdige mechanische mapping gevonden om additionele biomechanische informatie over de oppervlaktecomponenten onthullen, waar kleine verschillen in de adhesieve kenmerken tussen de macromoleculen en de omringende matrix gedetecteerd konden worden tijdens elke fysieke contact tussen de tip en het monster. Door dergelijke geavanceerde technieken toe te passen op de microbiele velden, hebben we drie E. coli genotypes onderzocht die één laboratoriumstam en twee humane pathogene stammen bevatten voor de identificatie van oppervlakte macromoleculen. De resultaten toonden aan dat de techniek een beeldresolutie kon bieden die de schaal van de AFM tip overschreed door het waarnemen van de mechanische verdeling van het monster. Concluderend, stellen we voor dat een dergelijke ontwikkeling in oppervlaktewetenschap niet alleen onderzoekers werkzaam in microbiele velden zou voorzien van details van het cellulaire uiterlijk, maar ook zou bijdragen aan onze kennis van de oppervlaktekenmerken van andere bio- of nanomateriaal systemen.

Methoden

Mikrobiele Monsters

De drie E. coli stammen getest in dit onderzoek waren klinisch geïsoleerd en verstrekt door Prof. Ching-Hao Teng's laboratorium aan het Instituut voor Moleculaire Geneeskunde, Nationale Cheng Kung Universiteit. MG1655 is de darms en de wild-type laboratoriumstam van E. coli K-12, en de twee andere stammen zijn humane pathogenen—CFT073, de hoofdzaak van urineweginfecties, en RS218, geassocieerd met neonatale meningitis bij zuigelingen.

Gefunctionaliseerd Substraat

Twee stappen van oppervlaktemodificaties werden toegepast voor de covalente binding tussen het vaste oppervlak en microbiele cellen. Eerst werd 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES, Sigma-Aldrich Co. LLC, USA) oplossing gebruikt om een initiële NH₂-gefunctionaliseerde laag op het oppervlak te vormen, waar de stabiele APTES coating bijdroeg aan de stabiele Si-O bindingen—Si geleverd door APTES en O van het geoxideerde oppervlak. Bezittend twee COOH functies, combineert glutaraldehyde met de NH₂ functie van APTES met één COOH en werkt met de NH₂ op bacterieel oppervlak met de andere COOH.

De schone substraten werden gedoopt in APTES oplossing, met een mengsel van 5% APTES in ethanol, gedurende een uur en gespoeld met ethanol en ddH₂O. De objectglazen werden gedroogd met stikstofstroom en vervolgens geplaatst in glutaraldehyde oplossing, 2% in PBS, voor een nacht, en gewassen met PBS.

Monsterbereiding

Enkele kolonieën van de E. coli stammen werden geselecteerd uit de lysogeny bouillon (LB) agar platen en geïncubeerd in LB bouillon. Na kweektijden van 12 uur, werd de bacteriële oplossing vervolgens 1:100 verdund in vers voor-geëquilibreerde LB bouillon. Na nog eens 12 uur voor microbiele kweek, werd de bacteriële oplossing onderworpen aan centrifugeren bij 1500×g (4000 rpm) gedurende 3 min en heropgelost in LB bouillon, met dit proces tweemaal herhaald. Tweehonderd microliter van de bacteriële oplossing werd op het gefunctionaliseerde substraat gedropt en 30 min in rust gelaten. Het monster werd vervolgens twee keer in gedestilleerd water gedoopt om de niet-gehechte cellen te verwijderen en onmiddellijk afgebeeld onder AFM in omgevingslucht.

AFM Karakterisering

Een AFM instrument (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) en een siliciumnitride punt met een gekalibreerde veerconstante van 0,7 N/m en tipradius van 10 nm werden geselecteerd voor de oppervlakte-onderzoek van microbiele monsters. De AFM scansnelheid en lijnpixels waren 0,5 Hz en 256 lijnen, respectievelijk, voor de scangrootte van 10 µm voor de eerste detectie van topografie, en de parameters werden vervolgens ingesteld als 0,3 Hz en 512 lijnen voor de scangrootte van 2 µm voor de gedetailleerde observatie. De PeakForce kwantitatieve nanomechanische (QNM) modus werd gebruikt voor de nanomechanische mapping, waar de adhesieve eigenschappen van het oppervlak berekend werden uit de maximale aantrekkende kracht onder de intrekkings kracht-afstand curves.

Onze eerdere studie op Streptococcus mutans toonde de mechanische evolutie op bacterieel oppervlak gedurende 2 uur, gemonitord door continue AFM mechanische mapping, en de microbiele monsters werden geverifieerd om levend te blijven binnen dergelijke duur. Om de levensvatbaarheid van de E. coli monsters gebruikt in dit werk te garanderen, werden vooraf studies op de bacteriële monsters uitgevoerd, en de continue verandering in oppervlakte adhesie gedurende 4 uur impliceerde dat de cellen tenminste 4 uur na monsterbereiding levend bleven (getoond in Additioneel bestand 1). Gevolgd werden de microbiele monsters getest in dit werk gemeten door AFM binnen 2 uur na monsterbereiding. Alle E. coli genotypes werden afzonderlijk en op verschillende tijden gekweekt, en de AFM metingen werden onmiddellijk na monsterbereiding uitgevoerd. Met andere woorden, de bacteriële monsters stonden niet in de rij wachtend op de onderzoek, zodat de effecten van wachttijd op de verschillen tussen E. coli stammen geminimaliseerd werden. De kwantitatieve gegevens voor elke E. coli stam werden verzameld uit de metingen genomen binnen 2 uur in deze studie.

Statistische Analyse

Prism (GraphPad Software, USA) werd gebruikt voor de statistische analyse in dit werk. Cellulaire lengtes en macromoleculaire groottes werden gepresenteerd als gemiddelde waarden samen met de standaardfout van het gemiddelde (SEM). De meerdere vergelijkingen tussen E. coli genotypes werden verwerkt met behulp van gewone eenrichtings variantieanalyse (ANOVA). Het vertrouwensniveau van 95% (p < 0,05) werd geselecteerd, en de asterisken geven de graad van significante verschillen die gevonden werden. Steekproefnummer n van elke stam was > 40.

Resultaten en Discussie

Oppervlakte Ultrastructuur door Meervoudige Mapping

Bij scannen met AFM op een observatieschaal van 10 µm op een bacterieel monster, konden verschillende enkele E. coli MG1655 cellen gezien worden, en de cellulaire vorm in drie dimensies kon waargenomen worden uit het topografische beeld (Fig. 1a); de duidelijke contouren van de cellen getoond in twee dimensies werden verkregen door het deflectie fout beeld (Fig. 1b), en verschillende buisjes naast de bacteriële cellen konden gevonden worden. De golf-achtige filamenten (Fig. 1c) waren consistent met het uiterlijk van microbiele flagella gerapporteerd in een ander werk, wat dergelijke bevinding bevestigde als flagella, en de kortere en haarachtige pili konden ook gezien worden. Bij het verkleinen van het waarnemingsgebied van de punt voor de gedetailleerde studie van enkele microbiele cellen, toonde de topografie een lichte verschil in de verticale richting tussen cellulaire oppervlakken, zoals getoond in Fig. 1d, en het deflectie fout beeld leek meer morfologische informatie te bieden terwijl de verzamelde omgevingsruis te veel was om de ultrastructuur van het cellulaire oppervlak te onderzoeken (Fig. 1e). Toen de gelijktijdige biomechanische eigenschappen van het monster gemeten werden tijdens het contact tussen tip en geteste object, werd gevonden dat het bacteriële oppervlak eigenlijk samengesteld was uit een enorme hoeveelheid macromoleculen met specifieke vorm en grootte, zoals onthuld door de adhesiekracht mapping (Fig. 1f); dus werd de morfologische resolutie in topografische en deflectie fout beelden verder verbeterd met biomechanische informatie.

In Fig. 2a kon de expressie van flagella door E. coli MG1655 duidelijk gezien worden, waar de grootte van filamenten vergelijkbaar was met die in Fig. 1b, met de adhesie-eigenschappen relatief lager dan het substraat. Daarnaast werd het bacteriële oppervlak gevonden om samengesteld te zijn uit cirkelvormige componenten die gekarakteriseerd werden als minder adhesief vergeleken met de omringende matrix. Deze observatie is vergelijkbaar met onze eerdere bevindingen op de weefsellaag van muizenhuid, en de terugkerende en vergelijkbare korrels werden beschouwd als macromoleculen, wiens structuur meer dicht en consistent is dan die gezien in de intermoleculaire regio, zodat de verschillen in adhesieprestaties gemakkelijk gevoeld konden worden. De uiterste laag van de cellulaire envelop in Gram-negatieve bacterien is een laag van zelf-assemblerende eiwritten, geïllustreerd in Fig. 2b, wat bekend is als een oppervlaktelaag (S-laag) eiwit. S-laag structuren werden traditioneel gemeten door elektronenmicroscopie terwijl de vereisten van vacuümomgevingen en geleidende coating de native en real-time informatie over de eiwritten verloren. Hoewel sommige onderzoeken de S-laag eiwritten extraheerden en hersamenstelden op mica substraat voor AFM scannen, ontbraken de resultaten de in situ en real-time prestaties van de S-laag structuur. Gebaseerd op de cellulaire architectuur en sommige eerdere beelden van microbieel oppervlak door elektronenmicroscopie, beschouwden we de waargenomen macromoleculen als S-laag eiwritten.

Vergelijking van de AFM en transmissie elektronenmicroscopie (TEM) metingen, heeft de eerste verschillende voordelen ten opzichte van de laatste, zoals eenvoudigere monsterbereiding, minder beperkte experimentele vereisten, en meer biologisch-vriendelijke beeldvormingstoepassingen. De selectie van TEM in het biologische veld wordt doorgaans geselecteerd vanwege zijn vermogen om de intercellulaire organellen te zien en de ultra-resolutie (typisch nanometer of sub-nanometer) beeldvorming die verkregen kan worden. De AFM adhesie mapping in het huidige werk verbeterde de kenmerkresolutie en presenteerde de rangschikkingen van oppervlakte macromoleculen op een manier die niet afhing van de tipgrootte, maar in plaats daarvan op de intrinsieke structuur van het monster zelf. Bovendien maakt deze benadering nanoschaal resolutie van microbieel oppervlak mogelijk door een bereik van tientallen micrometer vierkante oppervlakte.

Genomisch-Manipulerende Verschillen in Morfologische Kenmerken

Na het observeren van de oppervlakte ultrastructuur van E. coli MG1655 cellen, is een kwestie van belang hoe de macromoleculen gerangschikt zijn in andere stammen. De humane pathogenen E. coli CFT073 en RS218 werden dus onderzocht door AFM met dezelfde experimentele parameters, en er waren geen significante verschillen in cellulaire vormen en dimensies tussen deze drie genotypes op de kenmerkgrootte van 10 µm, gezien in Fig. 3a–c. Adhesiekracht mapping werd gebruikt om de S-laag eiwritten te identificeren, en ongelijke structuren met verschillende vormen en groottes werden gedetecteerd onder de verschillende E. coli stammen, zoals getoond in Fig. 3d–f. Voor de gemakkelijke vergelijking, werden de gedetailleerde adhesie mapping beelden van de E. coli stammen getoond in Fig. 3g–i. De oppervlakte macromoleculen werden gekarakteriseerd als een ronde vorm in MG1655 en RS218 cellen, hoewel verschillende moleculaire diameters, welke 38 ± 1,1 nm (n = 80) voor MG1655 en 58 ± 2,7 nm (n = 46) voor RS218. Aan de andere kant, bezaten de CFT073 cellen een unieke vorm van S-laag eiwritten, welke nier-vormig was met de lengteverschil tussen twee eindpunten van 66 ± 3,2 nm (n = 44). Na het analyseren van de groottes van de S-laag eiwritten van deze drie genotypes voor meerdere vergelijkingen, toonden de resultaten significante verschillen tussen deze stammen aan (Fig. 4).

Microbiele S-lagen worden gerapporteerd om belangrijke rollen te spelen in veel functies, welke bevatten het beschermen van cellen van zware omgevingen, aanvallen van fagocytose, en roofbacterium. Daarnaast dienen S-lagen ook als adhesine die effectieve kolonisatie mogelijk maken. De S-laag structuren zijn goed bestudeerd door TEM en gecategoriseerd in diverse roostertypes met de ruimte tussen centrum-tot-centrum in het bereik van 4–35 nm. De variatie tussen onze AFM resultaten en TEM rapporten uit de literatuur werd gedacht als de verschillende beeldvormingsmethodologieën, waar TEM de 2D morfologie van S-laag structuur geeft en AFM de 3D topografie vastlegt die de meervoudige invloeden omvat bijgedragen door cellulaire straal en ruwheid en de geometrie van AFM punt.

Verschillende typen S-laag structuren werden oorspronkelijk thought mogelijk om hun verschillende taxonomische kenmerken te gebruiken om te onderscheiden tussen bacteriële soorten, hoewel het toen gevonden werd dat zelfs voor een enkele soort, de microbiele vlekken verschillende roosters van eiwritten kunnen bezitten. Terwijl sommige studies het belang van de S-laag in filamentvorming onderzochten, de typen eiwritten op celmembranen en de genomische diversiteiten in grootte onder E. coli genotypes, zijn de verschillen in S-laag eiwritten zelden opgemerkt. De resultaten van de huidige studie onthulden de verschillen in morfologische kenmerken onder E. coli MG1655, CFT073, en RS218 en suggereren dat de uiterlijken van de oppervlakte macromoleculen waarschijnlijk specifiek zijn voor individuele E. coli genotype.

Conclusies

In dit werk werd genoom-specifieke nanostrukturele informatie over het bacteriële oppervlak gedetecteerd door AFM mechanische mapping, wat de adhesieve verschillen tussen de macromoleculen en de omringende matrix onderscheidde. De oppervlakte macromoleculen van de microbiele cellen werden beschouwd als de oppervlaktelaag eiwritten, volgens de moleculaire architectuur van Gram-negatieve microben. De rangschikkingen en groottes van die macromoleculen bleken specifiek te zijn voor de geteste E. coli genotypes met duidelijke vormen en groottes, met deze verschillen getoond als significant door statistische analyse. Concluderend, beschouwen we de bacteriële S-laag structuur als genoom-afhankelijk en kan het een potentiële methode zijn voor de snelle diagnose van microbie-geassocieerde ziekten of microbiele stammen. Om de praktische toepassing van S-laag kenmerk te implementeren, is het onderzoek op meer bacteriële genotypes vereist voor de aanvullende catalogus. We zijn momenteel een database aan het opbouwen die bacteriële morfologische kenmerken en de fysiologische/pathologische prestaties verbindt en geloven dat het een veelbelovende vooruitgang zal zijn voor de praktische toepassing van AFM onderzoek.

Afkortingen

AFM:

Atoommachtmicroscoop

ANOVA:

Eénrichtings variantieanalyse

APTES:

3-Aminopropyltriethoxysilane

LB:

Lysogeny bouillon

QNM:

Kwantitatieve nanomechanische

S-laag:

Oppervlaktelaag

TEM:

Transmissie elektronenmicroscopie