Gerichte antitumorale afgifte van methotrexaat via chondroitinesulfate-gebaseerde nanogels

Samenvatting

Zelfsamengestelde nanogels (NG's) werden gefabriceerd door methotrexaat (MTX) covalent te conjugeren aan het glycosaminoglycaan chondroitinesulfate (CS). De MTX-CS NG's tonen een dramatisch verbeterde wateroplosbaarheid en verbeterde biodistributie, dankzij de affiniteit van CS voor de CD44-receptor die overgeëxprimeerd is op veel tumorcellen. In vivo experimenten bevestigen dat MTX-CS NG's hogere intratumorale medicamentconcentraties leveren terwijl de systemische toxiciteit aanzienlijk wordt verminderd in vergelijking met vrij MTX. Deze resultaten vestigen CS-gebaseerde conjugaten als een krachtig platform voor gerichte afgifte van slecht oplosbare antikankermiddelen.

Achtergrond

Methotrexaat (MTX), een folaat-analogoon voor het eerst geïntroduceerd in de jaren 1950, blijft een hoeksteen van chemotherapie voor diverse maligniteiten. De klinische bruikbaarheid is echter beperkt door slechte wateroplosbaarheid, snelle clearance, en dosis-afhankelijke bijwerkingen, met name mucositis en myelosuppressie. Recente bewijzen duiden erop dat gerichte afgifte deze barrières kan overwinnen door tumoropname te verbeteren terwijl normale weefselen gespaard blijven.

Nanotechnologie biedt een veelzijdige toolkit voor het verbeteren van farmacokinetiek van geneesmiddelen. Zelfassemblage van medicament-polymer conjugaten in nanogels biedt een beschermende hydrofiele schil, verlengde circulatie-tijd, en gecontroleerde afgifte. Chondroitinesulfate (CS), een natureel voorkomend glycosaminoglycaan, bindt de CD44-receptor met hoge affiniteit, een pathway die frequent wordt uitgebuit door metastaserende kankers. CS-gebaseerde nanopartikelen hebben al belofte getoond in tumor-targeting. Op deze vooruitgang bouwend, hebben we een CS-MTX nanogel ontworpen gericht op het maximaliseren van therapeutisch voordeel terwijl toxiciteit wordt geminimaliseerd.

Methoden

Materialen en monsters

Chondroitinesulfate (MW 100-200 kDa) werd verkregen van Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. Overige reagentia, inclusief 4-methylmorfoline, tetrahydrofuraan (THF), en 2-chloro-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine, werden verkregen van Sun Chemical Technology. Fetale kalvessera (FBS) werd gekocht van HyClone. Lewis ratten (Sprague-Dawley, 200 ± 10 g) werden gebruikt voor in vivo studies.

Synthese van DMT-MM

DMT-MM werd bereid door 2-chloro-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine (0,769 g) te laten reageren met 4-methylmorfoline (18,79 mL) in THF (200 mL) onder roeren gedurende 30 min. Het resulterende witte neerslag werd gefiltreerd, driemaal gewassen met THF, en 24 uur vacuümgedroogd.

Synthese van MTX-CS

CS (1,0 g) werd opgelost in 20 mL ultrapuur water en geactiveerd met DMT-MM (0,769 g). Na 30 min bij kamertemperatuur werd MTX (0,5 g) toegevoegd en het mengsel 24 uur geroerd. Het conjugaat werd gedialyseerd (MWCO 3,5 kDa) tegen water gedurende 48 uur, met frequente uitwisselingen, en vervolgens lyofiliseerd tot een geel poeder. FTIR (400-4000 cm⁻¹) en ¹H-NMR (400 MHz) bevestigden succesvolle conjugatie.

Cytotoxiciteit van MTX-CS nanogels

A549T, HeLa, en HUVEC cellen werden gezaaid op 5 × 10³ cellen/put in 96-putplaten en 24 uur geïncubeerd (37 °C, 5% CO₂). Cellen werden vervolgens behandeld met MTX-CS NG's bij concentraties variërend van 0 tot 400 µM (gebaseerd op MTX-inhoud) gedurende een aanvullende 48 uur. Cellenlevensvatbaarheid werd gekwantificeerd via MTT-assay: 20 µL CCK-8 buffer werd toegevoegd, platen rustten 4 uur, en absorbantie werd gemeten bij 490 nm (referentie 570 nm) op een MULTISKAN GO lezer.

Dier en experimenteel ontwerp

Mannelijke Sprague-Dawley ratten werden willekeurig verdeeld in drie groepen (n = 6): (i) zoutoplossing controle, (ii) vrij MTX (1,25 µmol kg⁻¹ dag⁻¹), en (iii) MTX-CS NG's (equivalent aan 1,25 µmol kg⁻¹ dag⁻¹ MTX, 25 mg kg⁻¹ dag⁻¹ NG's). Behandelingen werden intraperitoneaal toegediend over 14 dagen (7 injecties). Lichaamsgewicht en overleving werden gemonitord; dieren werden geofferd na behandeling voor orgaansamenvatting.

Histologische studie

Miltzuiten werden geëxcideerd, gespoeld met PBS, vastgelegd in 4% paraformaldehyde (pH 7,4) gedurende 24 uur, in paraffine ingebettet, gesneden, en gekleurd met hematoxyline & eosin. Preparaten werden onder een lichtmicroscoop bekeken op bewijs van weefselschade.

Resultaten en discussie

Karakterisering van MTX-CS nanogels

FTIR-spectra (Fig. 1) tonen karakteristieke pieken van MTX (3355, 2951, 1646, 1600, 1540, 1493, 1403, 1207 cm⁻¹) die persisteren in het conjugaat, wat succesvolle hechting bevestigt. ¹H-NMR (Fig. 2) onthult signalen corresponderend met MTX's benzoïl (δ ≈ 6,9 ppm, 7,8 ppm) en pteridinyl (δ ≈ 8,7 ppm) moiety's, terwijl CS signalen (δ 3,2-5,4 ppm) ongewijzigd blijven, wat conjugatie verder valideert. De conjugatie-efficiëntie, bepaald door UV-vis bij 309 nm, was 13,65% MTX per massa van nanogel.

Dynamische lichtverstrooiing (DLS) onthulde een hydrodynamische diameter van ~200 nm (Fig. 3b), terwijl atoomkrachtmicroscopie (AFM) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) bolvormige morfologie met diameters van 200-240 nm bevestigden (Fig. 3c-e). De nanoschaal grootte is optimaal voor verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR) effect en CD44-gemedieerde endocytose.

In vitro cytotoxiciteit

MTX-CS NG's verlaagden de levensvatbaarheid van A549T en HeLa cellen aanzienlijk in vergelijking met vrij MTX en MTX gemengd met CS (Fig. 5). Voor HeLa daalde de cellenlevensvatbaarheid van 73,8% (vrij MTX) naar 60,2% (MTX-CS NG's) bij 10 µM, terwijl voor A549T de daling was van 80,2% naar 46,0% bij 50 µM. In tegenstelling, vertoonde het vrije medicament minimale activiteit bij vergelijkbare concentraties, en het MTX+CS mengsel bevorderde zelfs celligroei. Deze bevindingen benadrukken de rol van CD44-gemedieerde opname in het verbeteren van intracellulaire MTX-afgifte. HUVEC-assays toonden een 9,9% toename in levensvatbaarheid bij 10 µM MTX-CS NG's versus 63,6% voor vrij MTX, wat aangeeft op verminderde off-target toxiciteit.

In vivo toxiciteit en efficaciteit

Lichaamsgewicht-monitoring over 14 dagen onthulde dat ratten die vrij MTX ontvingen significant gewicht verloren, terwijl de MTX-CS NG groep bijna-basislijn gewicht behield (Fig. 6). Histologische onderzoek van milten toonde ernstige congestie en hemosiderine depositie in de MTX groep, maar slechts milde veranderingen in de MTX-CS NG groep, wat verminderde systemische toxiciteit bevestigt (Fig. 7).

Conclusies

We hebben met succes een 200-nm MTX-CS nanogel ontworpen die hoge oplosbaarheid, CD44-gemedieerde targeting, en verminderde systemische toxiciteit combineert. In vitro en in vivo data tonen superieure antitumorale kracht relatief tot vrij MTX, met aanzienlijk lagere bijwerkingen. Deze bevindingen valideren CS-gebaseerde medicamentconjugaten als een veelzijdige strategie voor het afgeven van slecht oplosbare antikankermiddelen met verbeterde therapeutische index.

Afkortingen

¹H NMR:

¹H Kernspinresonantie

AFM:

Atoomkrachtmicroscoop

CDMT:

2-Chloro-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine

CS:

Chondroitinesulfate

DLS:

Dynamische lichtverstrooiing

DMT-MM:

4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorfoliniumchloride

FTIR:

Fourier-transformatie infrarood

MTT:

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-difenyl-2-H-tetrazoliumbromide

MTX:

Methotrexaat

MTX-CS NG's:

Methotrexaat-chondroitinesulfate nanogels

NG's:

Nanogels

NMM:

4-Methylmorfoline

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscoop

THF:

Tetrahydrofuraan

UV-vis:

Ultraviolet-zichtbare spectroscopie