Ontwikkeling en evaluatie van een systeem voor de semi-kwantitatieve bepaling van de fysieke eigenschappen van de huid na blootstelling aan zilveren nanodeeltjes

Resultaten en discussie

Strategieën voor het construeren van een methode om de hoeveelheid en fysieke eigenschappen van nAgs in elke huidlaag te bepalen

Om de hoeveelheid en fysieke eigenschappen van nAg in elke huidlaag te bepalen, is het noodzakelijk om de huidmonsters volledig op te lossen en monsters te bereiden die vatbaar zijn voor sp-ICP-MS-analyse. Het is ook essentieel om de epidermis en de dermis te scheiden, zonder verlies tijdens herstel of veranderingen in de fysieke eigenschappen van de nAg, omdat niet-transdermaal geabsorbeerde nAg soms kan worden geëlimineerd tijdens verwijdering van de SC door middel van tapestripping [21].

Met betrekking tot het oplossen van de huidmonsters hebben we eerder gemeld dat voorbehandeling met NaOH een techniek is die optimaal is voor zowel de kwantificering als de analyse van de fysische eigenschappen van nAg in dierlijke weefsels, zoals de lever, het hart, de longen, nieren en de milt [16]. Daarom werd een voorbehandeling met NaOH toegepast op de huidmonsters die in dit onderzoek werden gebruikt.

Hydrothermische behandeling, die leidt tot de verzachting van collageenvezels en een verbeterde vertering van enzymen, die scheiding op de epidermale-dermale overgang (EDJ) bevordert, wordt veel gebruikt om de huid te scheiden in de epidermale en dermale lagen [22]. Hoewel deze behandelingen de huidlagen efficiënt scheiden, kan nAg in de lagen worden geïoniseerd in een waterige oplossing, wat resulteert in een verandering in de fysieke eigenschappen ervan. Er is gemeld dat een korte puls van microgolfstraling het mogelijk maakt de huid te scheiden in epidermale en dermale lagen door warmteontwikkeling die de EDJ verstoort [23, 24]. Daarom hebben we korte tijd microgolfstraling zonder incubatie op de oplossing toegepast.

Gezamenlijk hebben we een strategie voorgesteld (geïllustreerd in figuur 1), die werd gevalideerd door de herstelpercentages en veranderingen in fysieke eigenschappen van nAg in elke huidlaag te analyseren.

Strategie om de hoeveelheid en fysieke eigenschappen van nAg100 in elke laag huidweefsel te bepalen. Om de hoeveelheid en fysieke eigenschappen van nAg100 in elke laag huidweefsel te bepalen, is het noodzakelijk om (1) huidweefsels volledig op te lossen en (2) de huid te scheiden in epidermale en dermale weefsels, zonder weefselverlies tijdens herstel of veranderingen in de fysieke eigenschappen van nAg100. In dit opzicht hebben we ons gericht op (1) NaOH-voorbehandeling en (2) microgolfbestraling

Optimalisatie van voorbehandelingsmethoden voor het detecteren van nAg100 in de epidermis en dermis

We verwezen naar onze eerdere studie om een ​​voorbehandelingsmethode voor het oplossen van huidmonsters te optimaliseren. Ishizaka et al. [15] meldde dat onder verschillende soorten solubiliserende reagentia, zoals NaOH en HNO_3, NaOH-voorbehandeling was optimaal. Daarom hebben we HNO₃ . getest en NaOH als respectievelijk zure en alkalische solubilisatiereagentia. De homogenaten van de epidermis en dermis die van de muizenhuidmonsters waren gescheiden, werden gemengd met nAg100 om een ​​uiteindelijke Ag-concentratie van 100 ng/ml te verkrijgen, gevolgd door behandeling met elk solubilisatiereagens bij 37 °C. Eerst evalueerden we de terugwinningssnelheid van Ag na behandeling met deze reagentia. ICP-MS-analyse gaf aan dat een herstelpercentage van bijna 100% werd bereikt met NaOH en HNO₃ alleen behandeling (Fig. 2a). Om vervolgens veranderingen in de fysische eigenschappen als gevolg van elke behandeling te evalueren, analyseerden we de terugwinningsconcentraties van elk deeltje en ion. sp-ICP-MS-analyse gaf aan dat nAg100 bijna volledig geïoniseerd was door HNO₃ . Dit suggereerde dat HNO_3, als het zure reagens, losten de deeltjes op en zetten ze om in ionen, zoals ook werd gerapporteerd in een eerdere studie [15]. Daarentegen bleef een meerderheid van de met NaOH behandelde nAg100 als deeltjes en niet als ionen (figuur 2b). Zo liet NaOH toe dat het grootste deel van het nAg100 in de vorm van een deeltjes bleef. Ten slotte werden de verdelingen van deeltjesdiameters geëvalueerd om de fysische eigenschappen in detail te analyseren. HNO₃ behandeling veranderde de gemiddelde deeltjesdiameter van 100 nm naar 40 nm, wat overeenkwam met de ionisatie van nAg100. Omgekeerd was de gemiddelde deeltjesdiameter na NaOH-behandeling ongeveer 100 nm, wat overeenkomt met de initiële deeltjesgrootte (figuur 2c). Dit suggereerde dat de voorbehandeling met NaOH optimaal was voor het detecteren van nAg100 in de huid van een muis.

NaOH-voorbehandeling is de optimale methode voor het detecteren van nAg100 in dermis en epidermis. Twee solubiliserende reagentia (HNO₃ en NaOH) werden gescreend als oplosmiddelen voor de voorbehandeling om weefsels te lyseren. De homogenaten van de epidermis (E) en dermis (D) werden gemengd met nAg100 om een ​​uiteindelijke Ag-concentratie van 100 ng/ml te verkrijgen en bij 37 °C met elk solubiliserend reagens behandeld. Na 3 uur werden alle monsters geanalyseerd via ICP-MS en sp-ICP-MS. De een herstelpercentage van Ag, b nAg (zwarte balken) en Ag ⁺ (gearceerde balken) herstelpercentage, en c gemiddelde deeltjesdiameters worden weergegeven. De stippellijn geeft de aanvankelijke deeltjesgrootte weer. De gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde ± S.D. (n =3)

Scheiding van huidmonsters in epidermis en dermis via microgolfbestraling en evaluatie van herstelpercentages en veranderingen in fysieke eigenschappen van nAgs

Om huidmonsters te scheiden in epidermale en dermale lagen, pasten we verschillende omstandigheden van microgolfstraling toe die relevant waren voor onze studie en waarvan eerder werd gemeld dat ze succesvol waren [24] en vergeleken we hun prestaties met betrekking tot de scheidbaarheid van de huid en veranderingen in de fysieke eigenschappen. Er werd waargenomen dat onder de omstandigheden van 200 W gedurende 10 s, 600 W gedurende 30 s, 600 W gedurende 60 s, 950 W gedurende 30 s en 950 W gedurende 60 s, de huid niet kon scheiden in epidermale en dermale lagen ( Afb. 3a). Bovendien werd de huid slechts gedeeltelijk gescheiden in epidermale en dermale lagen onder de omstandigheden van 200 W gedurende 60 s, 600 W gedurende 10 s en 950 W gedurende 10 s. Daarentegen werd de huid pas volledig gescheiden in epidermale en dermale lagen na bestraling bij 200 W gedurende 30 s. Deze resultaten geven aan dat bestraling bij 200 W gedurende 30 s optimaal is voor het scheiden van de huidlaag.

Screening en evaluatie van de voorwaarden voor het scheiden van de huid in epidermis en dermis door microgolfbestraling. een Huidweefsel werd bestraald met microgolven onder negen omstandigheden en gescheiden in epidermale en dermale weefsels. Linker- en rechterpanelen tonen respectievelijk huidmonsters voor en na bestraling. In het rechterdeelvenster tonen enkele, dubbele en driedubbele witte cirkels respectievelijk niet-scheidbare, gedeeltelijk scheidbare en volledig scheidbare omstandigheden. Schaalbalken:1 cm. Huidhomogenaten werden gemengd met nAg100 om een ​​uiteindelijke Ag-concentratie van 100 ng/ml te verkrijgen, en gedurende 30 s bestraald bij 200 W en geanalyseerd via sp-ICP-MS. b De nAg (zwarte balken) en Ag ⁺ (gearceerde balken) herstelpercentages en c gemiddelde deeltjesdiameters worden weergegeven. De stippellijn geeft de aanvankelijke deeltjesgrootte weer. De gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde ± S.D. (n =3)

Om te verifiëren of deze microgolfstraling bij 200 W gedurende 30 s de fysieke eigenschappen van nAg100 beïnvloedde, hebben we de fysieke eigenschappen van Ag in epidermale en dermale lagen bepaald. De homogenaten van de epidermis en dermis, elk gemengd met respectievelijk 100 ng/ml nAg100, werden gelyseerd met NaOH en gedurende 30 seconden bestraald bij 200 W. Sp-ICP-MS-analyse onthulde dat de meerderheid van de nAg100 behandeld met microgolfstraling als deeltjes bleef, en dat gold ook voor die van de niet-behandelde groep (figuur 3b). Om de fysische eigenschappen in detail te analyseren, werden ook deeltjesdiameterverdelingen geëvalueerd. Het gemiddelde deeltje had een diameter van bijna 100 nm, wat overeenkwam met de aanvankelijke deeltjesgrootte (figuur 3c). Deze bevindingen suggereren dat microgolfbestraling van huidmonsters bij 200 W gedurende 30 seconden een veelbelovende benadering is voor het efficiënt scheiden van de huid in epidermale en dermale lagen zonder de fysieke eigenschappen van nAg100 te veranderen.

Gezamenlijk geven deze resultaten aan dat we met succes een systeem hadden ontwikkeld om de fysieke eigenschappen van nAg100 in elke huidlaag semi-kwantitatief te bepalen. De methode houdt in het bijzonder het volgende in:(i) verwijdering van niet-transdermaal geabsorbeerd nAg100 door de SC te verwijderen met de tapestripmethode [21]; (ii) scheiding van de huid in epidermale en dermale lagen via microgolfbestraling; (iii) solubilisatie van de epidermis en dermis met NaOH-behandeling; en (iv) de semi-kwantitatieve bepaling van de fysische eigenschappen van Ag in elke huidlaag met behulp van sp-ICP-MS.

Praktische evaluatie door bepaling van de hoeveelheid en fysieke eigenschappen van nAg100 en Ag ⁺ in muishuidlagen In vivo

Om de praktische toepassing van deze benadering te evalueren, analyseerden we de hoeveelheid en fysische eigenschappen van Ag in de epidermis en dermis evenals in het perifere bloed, nadat de huid van de muis was blootgesteld aan nAg100 en Ag ⁺ in levende lijve. Vijf dagen na blootstelling scheidden we de huid in de epidermis en dermis onder geoptimaliseerde omstandigheden voor microgolfbestraling en oplosbaar gemaakt met behulp van NaOH, zoals beschreven in de vorige sectie. ICP-MS-analyse gaf aan dat Ag aanwezig was in alle weefsels (zoals de epidermis, dermis en het bloed) van alle groepen. In de dermis en het bloed, Ag in de Ag ⁺ -blootgestelde groep had de neiging om verhoogd te zijn, vergeleken met die in de aan nAg100 blootgestelde groep (figuur 4a). De gegevens suggereerden dat hoewel zowel de ionen- als de deeltjesvorm percutaan werden geabsorbeerd en verdeeld zoals eerder gemeld [8, 9], het voor de ionische vormen gemakkelijker was om in diepe weefsellagen te infiltreren dan voor de deeltjesvormen.

Semi-kwantitatieve analyse van fysische eigenschappen van nAg100 en Ag ⁺ in vivo op de huid van een muis aangebracht. Ten eerste werd de muishuid blootgesteld aan nAg100 en Ag ⁺ (20 μg Ag/cm ² ). Vijf dagen na blootstelling werden kwantificering en evaluatie van de fysieke eigenschappen van Ag in epidermis, dermis en bloed uitgevoerd via respectievelijk ICP-MS en sp-ICP-MS. een Ag-concentraties en b deeltjessnelheden gedetecteerd in de epidermis, dermis en bloed. c De gemiddelde diameter van deeltjes gedetecteerd in de epidermis en dermis. De stippellijn geeft de aanvankelijke deeltjesgrootte weer. Alle gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde ± S.E. (n =3). *p <0,05 (Studenten t testen)

Vervolgens evalueerden we de verhouding van nAg en Ag ⁺ in elk monster. In de Ag ⁺ -blootgestelde groep, werd bijna alle Ag gedetecteerd in ionische vorm in de epidermis, de dermis en het bloed, wat aangeeft dat Ag ⁺ werd percutaan geabsorbeerd en gedistribueerd zonder een verandering in fysieke eigenschappen. Omgekeerd was in de aan nAg100 blootgestelde groep ongeveer 70% van het Ag in de epidermis en dermis in deeltjesvorm aanwezig, terwijl het resterende Ag geïoniseerd was. Verder was Ag gedetecteerd in het perifere bloed bijna volledig geïoniseerd en werd de deeltjesvorm nauwelijks gedetecteerd (figuur 4b). Ten slotte evalueerden we de deeltjesgrootte in de epidermale en dermale lagen, waar voornamelijk deeltjesvormen werden gedetecteerd. sp-ICP-MS-analyse onthulde dat de deeltjesgrootten die in beide lagen werden gedetecteerd, ongeveer 70-80 nm waren, wat overeenkomt met de snelheid waarmee nAg100 wordt geïoniseerd (figuur 4c). Deze gegevens suggereren dat wanneer de huid wordt blootgesteld aan nAg100, het kan worden geabsorbeerd en verdeeld terwijl het wordt geïoniseerd.

Zoals eerder gemeld, beïnvloedden de oppervlakteliganden van nanodeeltjes hun opname in de huid [25, 26]. Gouden nanodeeltjes die waren gemodificeerd met een aminogroep werden bijvoorbeeld in grotere mate geabsorbeerd in de muis en de menselijke huid dan gouden nanodeeltjes die waren gemodificeerd met een carboxylgroep in ex vivo experimenten [25]. Bovendien gaf moleculaire dynamica-analyse aan dat het huidpenetrerend vermogen in die volgorde afnam van neutraal hydrofoob naar kationisch tot anionische gouden nanodeeltjes [26]. In dit opzicht werd in dit onderzoek geconcludeerd dat nAg100 minder snel zou doordringen in de SC in de epidermis, de initiële huidbarrière, omdat nAg100 was gemodificeerd met citraat en negatief geladen was. Daarom kan de reden dat de deeltjes in de dermis en het bloed worden waargenomen, zijn dat de deeltjes zowel door de poriën als door de epidermis zijn gedrongen.

Er is ook gemeld dat de doordringbaarheid van gouden nanodeeltjes werd verbeterd door modificatie met celpenetrerende peptiden, zoals Tat en R7 [25]. Daarom kunnen in de toekomst soortgelijke aanpassingen worden overwogen voor nAgs om ze dieper in de huid af te leveren. Verder kan het nodig zijn om de grootte van de nAgs te verkleinen, omdat het effect van de oppervlaktemodificatie groter is bij een groter specifiek oppervlak.