Nec-1 vermindert neurotoxiciteit veroorzaakt door titaniumdioxide-nanomaterialen op Sh-Sy5y-cellen via RIP1

Discussie

In deze studie ontdekten we dat blootstelling aan TNP's cytotoxiciteit op SH-SY5Y-cellen induceerde op een dosisafhankelijke manier en dat necroptose betrokken was bij de neurotoxiciteit van TNP's. Om de rol van necroptose te onderzoeken, hebben we cellen blootgesteld aan TNP's met of zonder Nec-1 (een krachtige necroptose-remmer) [17, 18], en de levensvatbaarheid van de cellen, LDH-lekkage en de niveaus van inflammatoire cytokines gemeten. Onze gegevens suggereren dat gelijktijdige behandeling met Nec-1 ontstekingsschade veroorzaakt door TNP's kan verminderen. Omdat studies hebben aangetoond dat Nec-1 zijn effecten uitoefent door RIP1-activiteit te onderdrukken, hebben we cellen getransfecteerd met si-RIP1 om te bepalen of RIP1 betrokken was bij de beschermende effecten van Nec-1. Mutante en wildtype cellen werden behandeld met TNP's en de ontstekingsbeschadiging werd beoordeeld. Dit gaf aan dat de levensvatbaarheid van de cellen in de si-RIP1-groep hoger was dan die in de si-NC-groep, en dat de niveaus van LDH-lekkage en inflammatoire cytokines lager waren in de si-RIP1-groep dan die in de si-NC-groep na blootstelling aan TNP's . Concluderend heeft de huidige studie voor het eerst onthuld dat necroptose betrokken is bij de door TNP's geïnduceerde ontstekingsbeschadiging op cellen.

We hebben de neurotoxiciteit van TNP's herbevestigd in ons in vitro onderzoek. Nadat SH-SY5Y-cellen waren blootgesteld aan verschillende concentraties TNP's gedurende verschillende incubatietijden, werd de levensvatbaarheid van de cellen beoordeeld met behulp van de CCK8-assay. Zoals getoond in Fig. la, verminderde blootstelling aan TNP's de levensvatbaarheid van de cellen op een dosisafhankelijke manier; na 48 uur en 72 uur blootstelling was de levensvatbaarheid van de cellen in de 80 en 160 TNPs-groepen drastisch verminderd in vergelijking met de controlegroep (p <0,001). Om de cytotoxiciteit verder te bevestigen, hebben we ook de LDH-lekkage gemeten. De gegevens in Fig. 1b lieten zien dat de LDH-productie dosisafhankelijk toenam na 72 uur blootstelling, en de LDH-spiegels in de 40, 80 en 160 groepen waren opmerkelijk hoger dan die in de controlegroep (p <0,0001). Omdat eerdere studies hebben aangetoond dat neuro-inflammatie kan worden bevorderd door blootstelling aan TNP's [19], werden ook de niveaus van TNF-α, IL-1β, IL-6 en IL-8 gemeten. Figuur 2 illustreert dat de niveaus van die vier inflammatoire cytokines significant opgereguleerd waren in vergelijking met de controlegroep en dramatisch hoger waren in de groepen die werden behandeld met 20 tot 160 g/ml (p <0,0001). Al met al gaven onze resultaten aan dat TNP's op een dosisafhankelijke manier neurotoxiciteit zouden kunnen induceren, wat consistent is met eerdere onderzoeken. TNP's kunnen worden geabsorbeerd door neuronale cellen en remmen de proliferatie [20,21,22]. Bovendien kan blootstelling aan TNP's de levensvatbaarheid van cellen verminderen en LDH-lekkage op een dosisafhankelijke manier bevorderen [23,24,25,26,27].

We behandelden cellen samen met Nec-1 om te verduidelijken of necroptose betrokken was bij de neurotoxiciteit veroorzaakt door TNP's. Nadat cellen waren behandeld met aangegeven concentraties van TNP's met of zonder Nec-1, werden de levensvatbaarheid van de cellen, LDH-lekkage en ontsteking beoordeeld. Figuur 3a laat zien dat de vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen na blootstelling aan TNP's significant werd geremd door gelijktijdige behandeling met 10 μM Nec-1. Ondertussen onthulde Fig. 3b dat behandeling met 10 μM Nec-1 de LDH-niveaus niet verhoogde, en de LDH-niveaus in cellen behandeld met TNP's + Nec-1-groep waren dramatisch lager dan die in de groep met alleen TNP's. Vervolgens hebben we de effecten gemeten van gelijktijdige behandeling met Nec-1 op ontsteking veroorzaakt door TNP's. Figuur 4 illustreert dat de niveaus van TNF-a, IL-1β, IL-6 en IL-8 opmerkelijk lager waren in de cellen die waren behandeld met TNP's + Nec-1. Deze resultaten bevestigden opnieuw dat Nec-1 cellen zou kunnen beschermen tegen dood en ontstekingsprocessen [28, 29].

Ten slotte, aangezien RIP1 het doelwit is van Nec-1, hebben we beoordeeld of RIP1 de neurotoxiciteit van TNP's zou kunnen reguleren. We construeerden mutante cellen door RIP1-expressie tot zwijgen te brengen (Fig. 5). Gegevens uit Fig. 6 en Fig. 7 onthulden dat na blootstelling aan TNP's de levensvatbaarheid van de cellen hoger was en dat de LDH-, TNF-α-, IL-1β-, IL-6- en IL-8-niveaus lager waren in de si-RIP1-groep dan die in de si-NC, wat suggereert dat TNP's cytotoxiciteit bevorderen via RIP1. Evenzo hebben verschillende onderzoeken aangetoond dat RIP1 zowel celdood als ontstekingsprocessen kan reguleren [30, 31].

Hoewel we voor het eerst rapporteren dat Nec-1 de neurotoxiciteit van TNP's kan verminderen door de necroptose-signaleringsroute te onderdrukken, heeft onze studie een paar beperkingen. Ten eerste verschilt de cytotoxiciteit van materialen met nano-afmetingen van hun bulkmaterialen en kan grotendeels worden beïnvloed door oppervlakte-eigenschappen [32], wat het tegenovergestelde resultaat van verhoogde levensvatbaarheid van de cellen, gevonden door Sebastián et al., kan verklaren. [33]. Daarom is het essentieel om nanotoxiciteit op onderwerpen uit meerdere aspecten, zoals celproliferatie, membraanintegriteit, oxidatieve stress, ontsteking, mitochondriale functie, celcyclus, cytoskelet en epigenetica, uitgebreid te evalueren. Ten tweede kan RIP1 RIP3 rekruteren om een ​​functioneel necrosoom te vormen, een vitale activator van MLKL, om necroptose te initiëren [34]. We veronderstellen dat RIP3 / MLKL betrokken zou kunnen zijn bij de neurotoxiciteit van TNP's, wat in toekomstig werk zou moeten worden onderzocht. Bovendien moeten de associaties van RIP3/MLKL met de neurotoxiciteit van TNP's ook worden geëvalueerd. Ten derde werd gemeld dat reactieve zuurstofspecies (ROS), als de belangrijkste mechanismen die ten grondslag liggen aan neurotoxiciteit van TNP's [35, 36], het stroomopwaartse signaal van RIP1 zijn [37]. Daarom moet verder worden besproken of ROS de stroomopwaartse van RIP1 zijn in de neurotoxiciteit van TNP's. Ten vierde moeten cellen gedurende een lange periode (meer dan 72 uur) worden blootgesteld aan niet-toxische concentraties (TNP's <5 g/mL) om chronische cytotoxiciteit te beoordelen. Ten vijfde moeten we de rol van necroptose in de neurotoxiciteit van TNP's in meer neuronale cellijnen en primaire menselijke en dierlijke neuronale cellen evalueren.