Multi-mode biologisch afbreekbare tumor-micro-omgevingsgevoelige nanodeeltjes voor gerichte beeldvorming van borstkanker

Abstract

Met gas gevulde ultrasone (VS) contrastmiddelen zakken gemakkelijk in het lichaam in en het gas kan gemakkelijk overstromen, wat de effectiviteit van Amerikaanse beeldvorming beperkt. Om dit probleem aan te pakken, is een injecteerbaar gasgenererend multi-mode systeem ontwikkeld dat het MR-negatieve contrastmiddel Fe₃ draagt. O₄ , de fluorescerende kleurstof Cy5.5 en de CO₂ donor vrijgeven (Na₂ CO₃ ). De nanodeeltjes kunnen continu kooldioxide (CO₂ ) gas in zuur tumorweefsel in het lichaam, waardoor de tumor een sterk echosignaal krijgt onder ultrasone beeldvorming. Bovendien verlenen de nanodeeltjes uitstekende effecten voor MR- en fluorescentiebeeldvorming van het tumorweefsel. De resultaten geven aan dat dit pH-responsieve NP-systeem goede effecten biedt bij MR/US/fluorescentiebeeldvorming. Deze studie biedt een nuttige referentie voor multi-mode tumorbeeldvorming.

Inleiding

In de klinische praktijk worden microbellen vooral toegepast als ultrageluidcontrastmiddel voor de realtime beeldvorming van verschillende organen en bloedvaten [1,2,3]. Traditionele ultrasone contrastmiddelen bestaan doorgaans uit materialen zoals lipiden of eiwitten die lucht of perfluorkoolstofgassen omsluiten. De gassoorten ingekapseld in de microsferen hebben een lage stabiliteit in het bloed en een korte halfwaardetijd vanwege de snelle diffusie van microbellendefecten [4,5,6]. Bovendien, omdat de deeltjesgrootte van de met gas gevulde microbellen gewoonlijk groot is (ongeveer 1 tot 8 m), is het moeilijk voor de microbellen om door weefselextravasatie in de gastheertumoromgeving te dringen. Daarom is de huidige toepassing van bellen ter grootte van een micrometer in intravasculaire beeldvorming beperkt [7]. Ideale ultrasone contrastmiddelen zouden over het algemeen een optimale grootte moeten hebben voor transport door de weefselvasculaire ruimte, een adequate duur van het akoestische effect, goede targeting en biocompatibiliteit, en gemakkelijke uitscheiding uit het lichaam [8, 9]. Het concept van "gasgenererende nanodeeltjes" werd voorgesteld in eerder onderzoek, en dergelijke nanodeeltjes hebben het potentieel voor gebruik in ultrasone contrastbeeldvorming [10,11,12]. Deze gasgenererende nanodeeltjes zijn superieur aan de huidige met gas gevulde microbellen in prestatie, en het continu gegenereerde gas maakt intense ultrasone beeldvorming mogelijk. Gasgenererende nanodeeltjes kunnen de permeatie en retentie verbeteren, en ze kunnen stabiel in het bloed circuleren en zich effectief ophopen in het tumorweefsel [13, 14].

Het blijft een uitdaging om kleine en occulte tumoren te detecteren met traditionele beeldvormingsmethoden, zoals magnetische resonantie beeldvorming (MRI), computertomografie (CT) en echografie, die worden beperkt door lange acquisitietijden, hoge stralingsdosis en slechte gevoeligheid [15] , 16]. Het is noodzakelijk om verschillende beeldvormingsmethoden te integreren en multimodale beeldvormingstechnologie te ontwikkelen om geïntegreerde synergie te bereiken voor de vroege detectie van kanker [17,18,19]. Superparamagnetisch ijzeroxide (Fe₃ O₄ ) nanodeeltjes kunnen worden gebruikt als negatieve MRI-contrastmiddelen in T2-gewogen beeldvorming [20, 21]. Fe₃ O₄ heeft aantrekkelijke algemene eigenschappen, waaronder kleine deeltjesgrootte, sterke doordringbaarheid, hoge magnetisatie, goed metabolisme en relatief lage toxiciteit [22, 23]. Fe₃ O₄ contrastmiddelen voor de MRI-diagnose van kanker in een vroeg stadium zijn uitgebreid bestudeerd vanwege hun hoge relaxatie en contrast [24,25,26]. Bovendien heeft realtime fluorescentiebeeldvorming een uitstekende resolutie en kan het een waardevolle methode zijn voor het definiëren van tumorstadiëring, het begeleiden van tumorresectie en het bewaken van de behandelingseffecten [27, 28].

Hierin zijn deze nanodeeltjes voornamelijk ingekapseld door poly (melk-co-glycol) zuur (PLGA), dat is goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) voor gebruik als bioveilig materiaal [29, 30]. De PLGA-deeltjes zijn gemodificeerd met RGD-peptide om binding aan avβ3-integrine op het oppervlak van borstkankercellen mogelijk te maken en met Cy5.5 als een fluorescerende kleurstof voor in vivo beeldvorming, en ze zijn ingekapseld met Fe₃ O₄ om op te treden als een T2-negatief contrastmiddel in MRI (Schema 1a). Vanwege de opgereguleerde glycolyse in tumorweefsel, die meer melkzuur en protonen in de extracellulaire omgeving zou kunnen produceren, is de pH van tumorweefsels (6,8-7,2) lager dan die van normale weefsels (pH 7.4) [31,32,33] . Daarom hebben we natriumcarbonaat (Na₂ CO₃ ) in de PLGA om CO₂ . te produceren bellen bij de lagere pH van tumorweefsels voor ultrasone beeldvorming. Om hun veelbelovende toepassing in tumorbeeldvorming te verifiëren, werden de uitgebreide eigenschappen van deze multi-mode nanodeeltjes voor in vitro beeldvorming systematisch gekarakteriseerd, inclusief hun cytotoxiciteit, targetingspecificiteit en biodistributie in tumorweefsel, door drie beeldvormende modi.

een Schematische diagrammen van de functie in Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP's via gerichte accumulatie in de tumor en het genereren van CO₂ bellen in zure tumorweefsels, gevolgd door triple-modale MR/US/FI-beeldvorming van borstkanker. b Schematische weergave van de voorbereiding van de Fe₃ O₄ / Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP's.

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's

Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's zijn ontworpen als RGD-gerichte multi-mode contrastmiddelen door een biocompatibel polymeer van PLGA in te kapselen met Fe₃ O₄ en Na₂ CO₃ en een op integrine gericht middel via een biologisch afbreekbare chemische binding (schema 1b).

Transmissie-elektronenmicroscopiebeelden toonden aan dat Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's waren heldere bollen met uniform gedispergeerde ijzeroxidedeeltjes zichtbaar in de schaal (figuur 1a). De gemiddelde hydrodynamische grootte van de NP's werd gemeten als 117, 6 nm door dynamische lichtverstrooiing en de gemiddelde polydispersiteitsindex was 0, 234 (figuur 1b). De oppervlaktelading van de NP's werd bevestigd door zeta-potentiaalmetingen als − 21,7 mV (figuur 1c). Fluorescentiespectrummeting onthulde dat Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD had de maximale emissiegolflengte bij 685 nm, wat aangeeft dat Cy5.5 met succes was ingekapseld in de PLGA-kern (Fig. 1d). De verzadigingsmagnetisatiewaarden voor Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD en gratis Fe₃ O₄ NP's waren respectievelijk gelijk aan 32,6 en 42, 5 emu / g (figuur 1e). Deze bevindingen wezen op de superparamagnetische eigenschap van de nanodeeltjes bij kamertemperatuur. Het FITR-spectrum van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD toonde aan dat N-H rektrillingen en –OH absorptiepieken rond 3432 cm⁻¹ verschenen . Daarnaast hebben we een verbetering gevonden (1628 cm⁻¹ ) van de C =O strektrilling. Vergeleken met die van de niet-gerichte NP's, is de karakteristieke piek (de carboxyl) bij 1735 cm⁻¹ van de beoogde NP's was aanzienlijk verminderd. De resultaten toonden de binding tussen de carboxylgroep op het microbolletjesoppervlak en de aminogroep op RGD-peptide. In vitro binding van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's wordt getoond in Fig. 1f.

TEM-afbeeldingen (a ) Maatverdelingen (b ) Zeta-potentieel (c ) van Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP's. d Fluorescentie-emissiespectrum van Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD en Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/cRGD NP's. e Magnetische hysteresiscurves van Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP's en Fe₃ O₄ NP's. v De FTIR van spectra van gerichte Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD en niet-gerichte PLGA NP's

In vitro binding van Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD NP's

vβ3-integrine wordt over het algemeen sterk tot expressie gebracht op endotheelcellen van borstkankertumoren en kan tumormetastase bevorderen [33,34,35,36]. Cellulaire immunofluorescentie voor de expressie van av-integrine in MDA-MB-231-cellen was veel hoger dan die in MCF-7-cellen; A549-cellen dienden als positieve controles (Fig. 2a). De cellulaire opname van NP's werd bestudeerd met CLSM (figuur 2b). De Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's vertoonden een veel hogere bindingssnelheid aan MD-MB-231-cellen dan niet-gerichte NP's. De fluorescentiebeelden lieten ook zien dat Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's bonden aan het celcytoplasma, en samengevoegde beelden toonden dezelfde locaties als de expressie van αv-integrine [37, 38].

een Confocale fluorescentiebeelden met de expressie van av-integrine op MB231-, A549- en Mcf-7-cellen. Blauw en groen vertegenwoordigen respectievelijk DAPI- en αv-fluorescentie. b Confocale fluorescentiebeelden van MB231-cellen geïncubeerd met gerichte Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP's en niet-gerichte NP's. Blauw, rood en groen vertegenwoordigen respectievelijk DAPI, Cy5.5 en αv-fluorescentie. c Relatieve levensvatbaarheid van MB231-cellen die zijn geïncubeerd met verschillende concentraties Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP's

Cytotoxiciteitstest

De in vitro cytotoxiciteit van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's werden geschat in MDA-MB-231-cellen met behulp van een CCK8-assay, terwijl A549- en MCF-7-cellen behandeld met NP's als controles werden gebruikt (Fig. 2c). In het bereik van Fe-concentraties van 5-80 μg / ml was de levensvatbaarheid van de cellen van A549- en MB231-cellen niet significant verminderd en beide waren hoger dan 70%. Daarentegen vertoonden MCF-7-cellen een significante afname van de levensvatbaarheid van de cellen tot ongeveer 50% bij Fe-concentraties hoger dan 40 g / ml. De CCK8-resultaten toonden aan dat Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's vertoonden significant lagere cytotoxiciteit in MDA-MB-231-cellen over een bepaald concentratiebereik.

In vitro contrastbeeldvorming

We gebruikten een fantoom van agargel om de prestaties van Na₂ . te bestuderen CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's in vitro bij verschillende pH-waarden (Fig. 3a). De ultrasone contrastbeelden van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's waren significant verbeterd bij een zwak zure pH (pH 6.8) vergeleken met pH 7.2, waarschijnlijk omdat pH 7.2 niet genoeg CO₂ produceert bellen voor echografie. Wanneer de NP's zich daarentegen in een zwak zure omgeving bevonden, konden er voldoende bellen worden gegenereerd voor ultrasone beeldvorming. Deze eigenschap is relevant voor tumoren, die in vivo een hoge weefselheterogeniteit en diverse pH-waarden (pH 6,8-7,2) vertonen [32, 39, 40]. De signaalintensiteit van het ultrasone beeld werd vervolgens geanalyseerd (figuur 3b). De signaalintensiteitsverhoudingen van de niet-gerichte NP (pH =7), niet-gerichte NP (PH =5), gerichte NP (PH =7) en gerichte NP (PH =5) groepen ten opzichte van de signaalintensiteit van de blanco groep waren respectievelijk 112%, 145%, 167% en 178 ± 4%, wat duidelijk aangeeft dat de beoogde NP-groep (PH =5) het sterkste Amerikaanse signaal had.

een Ultrasone beelden van de beoogde NP's en niet-gerichte NP's opgenomen bij verschillende pH-waarden (7,2 en 6,8), PBS als controle. b Signaalintensiteitssnelheid wordt berekend door monster / blanco, monster vertegenwoordigt de echo-intensiteit van de gerichte en niet-gerichte NP's en blanco vertegenwoordigt de echo-intensiteit van PBS. c T2-gewogen MR-beelden van Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP's met verschillende Fe-concentraties (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 en 1 mM). d De transversale relativiteiten (r2) waren 19,597 mM⁻¹ s⁻¹ voor Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP's

Voor het MRI-onderzoek in vitro, als de concentratie van Fe in de Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's namen toe, de T2-gewogen signaalintensiteit vertoonde een significante afname, wat de mogelijkheid aangeeft van deze NP's voor gebruik als T2 MR-contrastmiddelen (Fig. 3c). De transversale relaxatiesnelheid (r2) van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's werd berekend op 19,597 mM⁻¹ s⁻¹ . Hoewel de transversale relaxatiesnelheid (r2) van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's is lager dan die van veel andere superparamagnetische MRI-middelen, de samenstelling van Fe₃ O₄ kan de r2 verhogen, die 2,94 keer hoger was dan de r2 van SPIO-deeltjes die klinisch werd gebruikt.

Ultrasone contrastbeeldvorming van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's

Om het potentieel van de Na₂ . te demonstreren CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's voor echografie bij tumoren, we hebben een staartaderinjectie van Na₂ toegediend CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's voor borstkanker xenograft naakte muizen en volgde de ultrasone beelden als functie van de tijd (Fig. 4a). Vóór injectie werden beelden van de tumor, de lever en het onderhuidse gebied opgenomen. Onmiddellijk na injectie vertoonde het gebied van de tumorweefsels geen contrastversterking. Versterking van het tumorgebied werd waargenomen vanaf 30 min na injectie en duurde 90 min. De resultaten van in vivo echografie toonden aan dat Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/ RGD NP's genereerden genoeg bellen in zure tumorweefsels om echogene reflectie te produceren voor ultrasone beeldvorming. Als controle verkregen we ook beelden van de lever en onderhuidse weefsels op verschillende tijdstippen na injectie van de beoogde NP's. Gedurende de observatieperiode werd geen significante verbetering gevonden in het subcutane injectiegebied en de verbetering in de lever, die in de loop van de tijd afnam, was significant lager dan die in de tumoren (Fig. 4b). Dit resultaat geeft aan dat Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's die bij fysiologische pH in het lichaam circuleren, produceren geen substantiële hoeveelheid CO₂ bubbels voor verbetering van het ultrasone contrast.

een In vivo echografie van tumoren, levers en onderhuidse gebieden op verschillende tijdstippen na injectie van Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP's. b Echo-intensiteit als functie van de tijd wordt berekend door weefsel/blanco, weefsel vertegenwoordigt de echo-intensiteit van de tumor, lever of subcutaan gebied, blanco vertegenwoordigt de echo-intensiteit vóór injectie

MRI van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's

Voor in vivo MRI, om aan te tonen dat NP's kunnen worden gebruikt voor tumorspecifieke beeldvorming, Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's werden rechtstreeks in tumoren en spieren geïnjecteerd. De resultaten toonden aan dat het tumorgebied een significante afname in T2-MR-contrast vertoonde na injectie van de beoogde NP's, en de signaalintensiteit nam significant af van 8875 bij 0 min tot 5972 bij 120 min na injectie (Fig. 5a, b). Met dezelfde hoeveelheid geïnjecteerde nanodeeltjes vertoonde het onderhuidse spiergebied echter een veel lagere afname van het T2-signaal. Deze bevinding toont de effectiviteit van Na₂ . aan CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's met overgevoelige, op integrine gerichte T2-MR-contrastmiddelen voor gebruik bij tumorgerichte beeldvorming. In de groep met staartaderinjectie toonde T2-MR-beeldvorming ook een duidelijke afname van het contrast in de tumor 24 h na injectie, wat de hoge tumoraccumulatie van Na₂ aantoont CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's (Fig. 5c, d). Bovendien werden verminderde T2-signalen waargenomen in de lever en de nieren, wat aangeeft dat de ijzerionen in de NP's snel uit het lichaam konden worden verwijderd. Daarom onthulde MRI dat de PLGA-verpakte Fe₃ O₄ nanodeeltjes vertoonden efficiënte passieve tumortargeting via het verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR) -effect, met name RGD-gemedieerde targeting, maar konden worden afgebroken en snel in vivo worden uitgescheiden.

een In vivo T2-MR-beelden van normaal en onderhuids tumorweefsel voor en na injectie van Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP's. b Gemiddelde signaalintensiteit in spier en tumor voor injectie van Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP's. c T2-MR-beelden op axiale en coronale MDA-MB-231 tumordragende muizen voor en na intraveneuze injectie van Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP's. d Signaalintensiteitsverhouding wordt berekend door weefsel/spier, weefsel staat voor de signaalintensiteit van de tumor, lever en nier voor en na injectie van de beoogde NP's, spier staat voor de signaalintensiteit van de spier tegelijkertijd

Fluorescentiebeeldvorming en histologie

Tweehonderd microliter NP's werden intraveneus in muizen geïnjecteerd voor in vivo fluorescentiebeeldvorming. In de groep die werd geïnjecteerd met RGD-gerichte NP's, nam het fluorescentiesignaal van Cy5.5 geleidelijk toe in het tumorgebied en bereikte een piek op 4 h na injectie, wat aangeeft dat Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's kunnen zich effectief ophopen in de tumor. In de niet-gerichte groep werden NP's na injectie door het lichaam verdeeld en snel geklaard, en ze hoopten zich gedurende lange tijd niet op in de tumor (figuur 6a). De muizen werden vervolgens ontleed en de belangrijkste organen en tumoren werden verzameld voor in vitro fluorescentiebeeldvorming, die een hoge tumoropname van de beoogde NP's aan het licht bracht (Fig. 6b, c). De fluorescentie-intensiteit van Cy5.5 in de tumoren van muizen die waren geïnjecteerd met gerichte NP's, was 1,5 keer die van muizen die waren geïnjecteerd met niet-gerichte NP's.

een In vivo fluorescentie fluorescentie beeldvorming van dieren op 0, 0,5, 1, 2 en 3 h na injectie na injectie van gerichte en niet-gerichte NP's. b Ex vivo fluorescentiebeelden van tumoren en belangrijke organen (lever, milt, long, hart en nier) verzameld bij dieren. c Gemiddelde fluorescentie-intensiteit van verschillende organen en tumoren

Bovendien is tumorspecifieke targeting van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's werden geverifieerd door middel van weefselfluorescentiebeeldvorming van bevroren tumorcoupes (Fig. 7a). Immunofluorescentiekleuring van tumorcoupes met antilichamen tegen av- en β3-integrine onthulde significante expressie van avβ3-integrine in tumorweefsels. De fluorescentie van αv en β3-integrine werd samengevoegd met de Cy5.5-fluorescentie van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's om een afbeelding met immunokleuring te verkrijgen die colokalisatie onthult. De immunofluorescentieresultaten in de tumorweefsels gaven aan dat Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's binden specifiek aan avβ3-integrine in kwaadaardige MB231 borstkanker. Bovendien, H&E-kleuring van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's vergeleken met de niet-gerichte groep toonden aan dat alle orgaanweefselsecties een normale pathologische morfologie hadden en geen histopathologische schadereactie (Fig. 7b). Alle resultaten van de bovenstaande cytotoxiciteit en histologische analyse gaven aan dat Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's veroorzaakten in vivo geen significante toxiciteit voor belangrijke orgaanweefsels, en hun goede biocompatibiliteit kan redelijkerwijs worden toegeschreven aan PLGA.

een Fluorescerende beeldvorming van MDA-MB-231 bevroren tumorsecties van muizen die zijn geïnjecteerd met gerichte en niet-gerichte NP's. Groen, rood, paars en blauw vertegenwoordigen respectievelijk αv, β3, Cy5.5 en DAPI-fluorescentie. b H&E-gekleurde tumorplakken verzameld van muizen na injectie van gerichte en niet-gerichte NP's

Conclusies

Concluderend demonstreren de bovenstaande resultaten een creatieve en succesvolle benadering voor MRI van borstkanker door middel van magnetische targeting en een gasgenererend systeem dat wordt geactiveerd in de micro-omgeving van de tumor. Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's vertonen uitstekende beeldprestaties en goede biocompatibiliteit in MR/echografie/fluorescentie-beeldvormingsmodi. Ons werk toont het sterke potentieel voor tumordiagnose met verbeterde multimodale beeldvorming.

Materialen en methoden

Materialen

Poly (melk-co-glycolzuur) (PLGA) (lactide:glycolide =75:25, Mw =20.000), Cyanine5.5-kleurstof en polyvinylalcohol (PVA) werden gekocht bij Sigma-Aldrich Company (Shanghai, China). Het RGD-peptide werd op maat gesynthetiseerd door GenicBio BioTech Co. Ltd. (Shanghai, China). Fe₃ O₄ nanodeeltjes en natriumcarbonaat (Na₂ CO₃ ) werden gekocht van Xian Ruixi Biological Technology Co. Ltd. (Henan, China). Dichloormethaan (CH₂ Cl₂ ) en dimethylsulfoxide (DMSO) werden verkregen van Solarbio Company (Beijing, China). Alle chemicaliën waren van analytische kwaliteit.

Synthese van Fe3O4/Na2CO3@PLGA/Cy5.5/cRGD nanodeeltjes

Eerst werden 12,5 mg PLGA en 0,25 mL chloroform met elkaar gemengd. Vervolgens 5 μL Cy5.5, 15 μL oliezuur-gemodificeerde magnetische nanodeeltjes gedispergeerd in chloroform (OA@Fe₃ O₄ , 10 mg/ml), 5 μL natriumcarbonaat (Na₂ CO₃ ), en 1,5 mL 1% PVA-oplossing werd achtereenvolgens toegevoegd en gedurende 2 min geëmulgeerd met een ultrasone processor. Vervolgens werd 12,5 ml 0,3% PVA-oplossing toegevoegd en gedurende 3-4 uur bij kamertemperatuur geroerd, en 12,5 ml 0,4% PVA-oplossing werd gedurende de nacht toegevoegd om te roeren (500 rpm/min) om achtergebleven organisch oplosmiddel te verwijderen. De bovenstaande oplossing werd onderworpen aan verschillende ultrafiltratiewassingen met ddH₂ O en vervolgens verdund met PB-buffer (pH =7,4) tot een eindvolume van 1,25 mL. Vervolgens werden 0,25 mg EDC en 1,25 mg NHS toegevoegd aan de bovenstaande gemengde oplossing. Het mengsel werd 30 min bij 25°C geroerd en vervolgens driemaal gewassen met ultrafiltratie en opnieuw gesuspendeerd in PB-bufferoplossing (pH =7,4). Vervolgens werd 1,25 mg cRGD aan de oplossing toegevoegd en een nacht bij 4 °C geroerd. Om EDC, NHS en eventueel achtergebleven cRGD te verwijderen, werd de transparante oplossing gefiltreerd door een ultrafiltratiebuis. Eindelijk, Fe₃ O₄ /Na₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP's werden opnieuw gesuspendeerd in 1,25 mL gedeïoniseerd water en bewaard bij 4 °C.

Nanodeeltjeskarakterisering

De dynamische diameters en het zeta-potentieel van nanodeeltjes werden gemeten door een Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, VK). De morfologie van de nanodeeltjes werd verkregen met behulp van een FEI Tecnai F20 transmissie-elektronenmicroscoop. De Cy5.5-lading werd geregistreerd door een Hitachi F-7000 fluorescentiespectrometer. FTIR werd uitgevoerd met behulp van een fouriertransformatie-infraroodspectrometer (Alpha II, Bruker, Zwitserland). Een vibrerende monstermagnetometer (VSM, Lake Shore 7410) werd toegepast om de hysteresecurve van de nanodeeltjes en vrij Fe₃ te bepalen O₄ .

Cellen en dieren

Menselijke borstkanker MDA-MB-231-cellen werden vriendelijk verstrekt door de Stem Cell Bank, Chinese Academie van Wetenschappen. Cellen werden op 37°C gehouden in 95% lucht en 5% CO₂ . Vrouwelijke BALB/c-muizen (4 week) werden gekocht bij Shanghai Slaccas Laboratory Animal Co. Ltd. en onderhouden volgens protocollen die zijn goedgekeurd door het Guangxi Medical University Laboratory Animal Center. Dierproeven werden gevolgd met de Guide for Care and Use of Laboratory Animals, uitgegeven door de Animals Ethics Committee van Laboratory Animal Center, Guangxi Medical University. MDA-MB-231-borstkankercellen werden getransplanteerd in de rechterflank van BALB/c-muizen (2 x 106 in cellen van 200 l per muis) en men liet ze 10-14 dagen groeien (gemiddelde diameter 5 mm) vóór beeldvorming.

Cellulaire expressie van αv integrine

Cellulaire immunofluorescentie werd uitgevoerd om de hoge expressie van av-integrine in MDA-MB-231-cellen te bevestigen. A549- en MCF-7-cellen werden als controles gebruikt. Cellen werden gezaaid op 35 mm kweekschalen met glazen bodem (MatTek, VS) bij 2 × 10⁴ cellen ml⁻¹ voor 24u. Na incubatie werden cellen gedurende 20 min bij kamertemperatuur gefixeerd met 4% paraformaldehyde. Vervolgens werden ze gedurende de nacht bij 4 ° C geïncubeerd met monoklonaal konijnen-anti-integrine av-antilichaam (ab179475, Abcam) en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur anti-konijn IgG-antilichaam. Ten slotte werden de cellen gekleurd met DAPI. Beelden werden verkregen door confocale laser scanning microscopie (TCS SP8, Leica, Duitsland).

Om de doelgerichtheid van de nanodeeltjes te beoordelen, werd een cellulaire opnamestudie uitgevoerd met behulp van confocale laser scanning microscopie (CLSM). Cellen werden gezaaid op 35 mm kweekschalen met glazen bodem (MatTek, VS) bij 2 × 10⁴ cellen ml⁻¹ voor 24u. Vervolgens werden de cellen geïncubeerd met RGD-gerichte NP's (30 μg mL⁻¹ , 0, 5 mL) bij pH 7,4 gedurende 2 uur, en niet-gerichte NP's werden als controles gebruikt. Na incubatie werden de cellen gedurende 20 min gefixeerd met 4% paraformaldehyde en vervolgens geïncubeerd met av-antilichaam. Door middel van colokalisatie hebben we de gerichte binding van de nanodeeltjes aan het integrine op de cellen geverifieerd.

CCK8-test

De biocompatibiliteit van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD nanodeeltjes werd geëvalueerd door een cytotoxiciteitsstudie. MDA-MB-231-, A549- en MCF-7-cellen werden uitgezaaid op platen met 96 putjes bij 5 × 10³ cellen ml⁻¹ voor 24u. Daarna 0,1 µmL Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP-suspensie bij Fe-concentraties van 5, 10, 20, 40 en 80 g/ml werd aan elk putje toegevoegd en gedurende 24 u geïncubeerd. Ten slotte werd 10 L CCK8-oplossing toegevoegd en werd de suspensie nog eens 1 uur geïncubeerd. De resultaten werden bepaald door een microplaatlezer (Thermo Scientific, VS) bij 450 nm.

Contrast-verbeterde echografie

Echografie van nanodeeltjes werd uitgevoerd met behulp van een Vevo 2100 (Fujifilm Visual Sonics Inc., Canada) echografiesysteem. De RGD-gerichte en niet-gerichte NP's werden toegevoegd aan het agarosemodel en PBS werd als controle gebruikt. Beelden werden opgenomen in B-modus en CEUS-modus met verschillende pH-buffers van 7,2 en 6,8. Het interessegebied werd getekend en de gemiddelde grijswaarde werd gemeten in afbeeldingen in B-modus.

Voor in vivo ultrasone beeldvorming werden muizen verdoofd met 2% isofluraan (Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd., China) en werd de lichaamstemperatuur op 37 ° C gehouden met een verwarmd kussen. Een totaal van 200 μL RGD-gerichte NP's werd via de staartader geïnjecteerd. Controledieren kregen een subcutane injectie met dezelfde hoeveelheid NP's. Ultrasone beelden werden opgenomen met behulp van een 7-MHz transducer om continu ultrasone beelden van de tumoren, levers en onderhuidse gebieden te verkrijgen. De akoestische focuszone werd in het midden van de tumor met de grootste dwarsdoorsnede geplaatst en er werd een gezichtsveld verkregen dat de tumor en het aangrenzende weefsel bevat.

Magnetische resonantie beeldvorming

MRI-onderzoeken van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's werden uitgevoerd met behulp van een 3.0 T MR (GE Healthcare, VS) en een dierenspiraal (RF TECH LIMITED, China). NP's met verschillende Fe-concentraties van 0,031, 0,063, 0,125, 0,25, 0,5 en 1 mM werden gescand in Eppendorf-buizen van 1 m en PBS werd als controle gebruikt. T2 MRI werd uitgevoerd voor elke buis met behulp van een T2-gewogen FSE-sequentie (plakdikte van 3 mm, TR/TE 2000/74,4 ms, 8 × 8 cm FOV en 320 × 256 matrix). De relaxiviteiten (r2) werden berekend door een lineaire aanpassing van de inverse relaxatietijd als functie van de Fe-concentratie.

Voor in vivo MRI werden muizen willekeurig verdeeld in twee groepen (n =3) voor MR-scanning die ofwel (1) lokale injectie van Na₂ . ontving CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's in subcutane spier- en tumorweefsels of (2) staartaderinjectie van Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's. Basislijnbeelden van de muizen werden genomen vóór injectie van de nanodeeltjes. Voor groep één werd dezelfde hoeveelheid NP's geïnjecteerd in het onderhuidse en tumorweefsel en werd elke 30 min MRI-scanning uitgevoerd om de signaalovergang van de weefsels vast te leggen. Voor groep twee werd tumorbeeldvorming uitgevoerd in de axiale en coronale posities, en de MR-parameters waren dezelfde als die gebruikt voor in vitro beeldvorming. De signaalintensiteit (SI) in het interessegebied (ROI) werd gemeten en vergeleken met weefselsignalen op verschillende tijdstippen voor en na injectie.

Tumorfluorescentiebeeldvorming

Voor fluorescentiebeeldvorming in vivo werd een in vivo fluorescentiebeeldvormingssysteem (FX PRO, Bruker, Zwitserland) gebruikt voor het scannen en de muizen werden willekeurig verdeeld in twee groepen (n =3):(1) RGD-gerichte NP's en (2) niet-gerichte NP's. Beelden werden elke 30 min gemaakt gedurende een periode van 4 h na de injectie. Vervolgens werden belangrijke organen en tumoren geoogst en afgebeeld, en werd de verdeling van fluorescentie in de organen van het lichaam waargenomen. Quantitative analysis of fluorescence intensity was performed using molecular imaging software (Bruker, Switzerland). These important organs then underwent H&E staining to evaluate the tissue toxicity. Frozen tumour sections were also subjected to fluorescence immunostaining with antibodies against αv integrin and β3 integrin.