Wateroplosbare fullerenol met geoptimaliseerde hydroxylegroepen versterkt tweefoton-fotodynamische inactivatie van infectieuze micro-organismen

Samenvatting

We hebben met succes wateroplosbare fullerenol [C₆₀(OH)₄₆] bereid die een hoge enkeltzuurstofkwantumopbrengst vertoonde en efficiënt reactieve zuurstofsoorten (ROS) genereerde. Bovendien had de wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆ met een hogere samenstelling van blootgestelde hydroxylegroepen superieure tweefotonstabiliteit en -eigenschappen vergeleken met die met een lagere samenstelling van dergelijke groepen. Daarom kan de bereide fullerenol een effectieve tweefoton-fotosensitizer zijn. De wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆ had gunstige tweefotoneigenschappen. Tijdens tweefoton-fotodynamische therapie had de wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆ substantiële antimicrobiële activiteit tegen Escherichia coli op een ultralag energieniveau van 211,2 nJ pixel⁻¹ met 800 scans en een foto-geëxciteerde golflengte van 760 nm.

Inleiding

Verschillende fotosensitizer (PS) moleculen zijn de afgelopen decennia gesynthetiseerd. Echter, klinische toepassingen van bestaande PS's omvatten verschillende problemen. De meeste PS-moleculen zijn hydrofoob en kunnen gemakkelijk aggregeren in aqueous media, wat hun kwantumopbrengst (QY) verlaagt. Daarnaast kunnen geaggregeerde PS's niet simpel intraveneus worden geïnjecteerd. Selectieve accumulatie van PS-moleculen in ziekteweefsel is ook vereist om schade aan gezonde cellen te voorkomen. Vanwege deze problemen blijft de ontwikkeling van een effectieve PS-drager een grote uitdaging voor fotodynamische therapie (PDT). Daarom neemt de interesse in het gebruik van nanopartikelen als PS-dragers toe.

Voortgang in nanobiotechnologie heeft de interesse gestimuleerd in biomedische toepassingen van een nieuwe klasse nanostructuren die uitsluitend bestaan uit koolstofatomen, namelijk fullereen C₆₀, die sferoïdale moleculen zijn (0,72 nm in diameter) die niet-toxisch zijn en unieke fysicochemische eigenschappen hebben. De kleine grootte van lipofiele C₆₀ moleculen is verantwoordelijk voor hun sterische compatibiliteit met biologische moleculen en bevordert hun integratie in hydrofobe regio's van membranen. Vanwege het uitgebreide π-geconjugeerde systeem van zijn moleculaire orbitalen, absorbeert fullereen C₆₀ ultraviolett-zichtbaar (UV-vis) licht en kan reactieve zuurstofsoorten (ROS) genereren met een bijna 100% enkeltzuurstof QY (Φ_Δ). Bovendien laten de fysicochemische eigenschappen van fullereen C₆₀ toe om ROS te genereren en als PS voor PDT te dienen. Fullerenen kunnen ook pro-oxidante effecten induceren, en dit kan worden gedicteerd door de gebruikte fullereen, het onderzochte celtype en de experimentele opzet. C₆₀ heeft een extreme lage oplosbaarheid in polaire oplossingen, wat de toepassingen in de geneeskunde aanzienlijk beperkt. Echter, vanwege de aanwezigheid van dubbele bindingen, kan C₆₀ gemakkelijk worden gemodificeerd met chemische groepen om de wateroplosbaarheid te vergroten. Daarom hebben wateroplosbare C₆₀ derivaten meer kansen voor medische toepassingen, waaronder neuroprotectie, medicijn- en gen aflevering, fotosensitisering en biosensing.

Multifoton laser microscopie (ook bekend als tweefoton laser microscopie) omvat het gebruik van gelokaliseerde "niet-lineaire" excitatie om fluorescentie op te wekken binnen slechts een dun raster-gescand vlak. Tweefoton laser microscopie is gebruikt in diverse imaging studies. Het wordt doorgaans gekoppeld met nabij-infrarood (NIR) laser excitatie om te profiteren van de inherente maximale weefseltransmissie voor bio-imaging; dit is omdat NIR de voordelen heeft van geringe verstrooiing, lage energie-absorptie, optimale bestralingspenetratie en verminderde fotobleaching van specimen. De koppeling van tweefoton laser microscopie met NIR laser excitatie is de bevorzugte techniek geworden voor fluorescentiemicroscopie in dik weefsel en diepere biologische specimen en is uitgebreid toegepast in andere foto-excitatietherapieën. Bovendien, vanwege de ultralage energie en korte foto-excitatie, wordt tweefoton laser microscopie beschouwd als een alternatieve benadering voor het uitvoeren van PDT. Hoewel sommige PS's toxisch zijn, worden die met een hoge Φ_Δ geprioriteerd voor het uitvoeren van PDT. Een hoge Φ_Δ waarde is bijzonder wenselijk wanneer tweefoton-technieken worden gebruikt om moleculaire activiteiten in fotoprestaties te evalueren en efficiënt niet-lineaire microscopische studies uit te voeren; zo'n waarde is wenselijk omdat de verhouding van de geabsorbeerde energie tot de invoerenergieflux naar een specimen hoog is, wat mogelijke fotodamage aan het specimen minimaliseert. Echter, de literatuur bevat geen studies die het gebruik van materialen met tweefotoneigenschappen voor PDT hebben overwogen. Om dit onderzoeksgat te vullen, past de huidige studie wateroplosbare gehydroxyleerde fullerenol met sterke elektrondonatievermogen en een groot π-geconjugeerde systeem toe om de ladingsoverdrachts-efficiëntie te verhogen, waardoor de tweefotoneigenschappen worden verbeterd. Specifiek werd wateroplosbare gehydroxyleerde C₆₀(OH)₄₆ afgeleid en toegepast als tweefoton PS voor effectieve microbeverwijdering met ultralage-energie femtoseconde laser bestraling en slechts 800 scans onder tweefoton-excitatie (TPE; excitatiegolflengte, 760 nm). Voor de ultralage-energie femtoseconde laser bestraling was de energie 211,2 nJ pixel⁻¹ en het vermogen 2,112 mW (met betrekking tot de berekening van de laserkracht na het objectief, zie de sectie "Materialen en Methoden" en Fig. 1a, waar de x–y brandpuntresolutie en z-as resolutie van het lasersysteem ongeveer 0,37538 en 0,90159 μm zijn, respectievelijk); bovendien, voor het scanningsproces, was de totale effectieve bloottijd ongeveer 3,2621 s, scansnelheid was 4,0776 ms scan⁻¹, en scanoppervlak was 200 × 200 μm² (zie de sectie "Materialen en Methoden" voor details over de berekening). De wateroplosbare gehydroxyleerde C₆₀(OH)₄₆ bereikte een bijna 100% eliminatie van Escherichia coli (E. coli, een Gram-negatieve bacteriestam). Verder vertoonde de wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆ met een hogere samenstelling van hydroxylegroepen superieure tweefoton-fotoprestaties ten opzichte van die met een lagere samenstelling van hydroxylegroepen onder TPE; daarom kan de afgeleide wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆ worden beschouwd als het potentieel heeft voor gelijktijdige PDT om maligne microben te elimineren.

Materialen en Methodes

Bereiding en Karakterisatie van Wateroplosbare Fullerenolen, C₆₀(OH)₂₁ en C₆₀(OH)₄₆

Rauwe fullereen werd commercieel verkregen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS), en de C₆₀(OH)₁₂ precursor werd geproduceerd zoals eerder beschreven. Ten eerste werd 30% waterstofperoxide oplossing (100 mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) toegevoegd aan het startmateriaal, 0,5-1,0 g van C₆₀(OH)₁₂, en het mengsel werd vigoreus gerold bij 60 °C onder lucht. Na afkoeling werd een mengsel van oplosmiddelen bestaande uit 2-propanol, diethylether en hexaan (100-200 mL voor elk; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) toegevoegd aan de oplossing, welke vervolgens gecentrifugeerd en gedecanteerd werd. Het overgebleven vast werd tweemaal gewassen met 200 mL diethylether door de centrifugatie en decantatie procedures. Uiteindelijk werden de eindproducten van wateroplosbare C₆₀(OH)₂₁ en C₆₀(OH)₄₆ verkregen door het residu onder vacuüm bij kamertemperatuur over nacht te drogen, respectievelijk. Het gewicht van het eindproduct werd gekalibreerd door thermische gravimetrische analyse. De morfologie van het eindproduct werd waargenomen met behulp van hoge-resolutie transmissie-elektronenmicroscopie (HR-TEM, JEOL 3010, Akishima, Tokio, Japan) met een resolutie van ongeveer 1,11 ± 0,03 nm en 1,13 ± 0,04 nm voor C₆₀(OH)₂₁ en C₆₀(OH)₄₆, respectievelijk. Dynamische lichtverstrooiing (DLS, Malvern Nano-ZS90, Worcestershire, West Midlands, VK) werd ook gebruikt om de grootte van materialen te bepalen. De blootgestelde functionele groepen van de bereide materialen werden allereerst onderzocht door middel van Fourier-transformatie infrarood (FTIR) spectroscopie (RX1, PerkinElmer, Waltham, MA, VS). UV-vis spectroscopie van de materialen werd uitgevoerd met een spectrometer (U-4100, Hitachi, Chiyoda-ku, Tokio, Japan). De oppervlaktechemie van de fullerenol werd onderzocht door middel van röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS, PHI 5000 spectrometer (VersaProbe, Chanhassen, MN, VS)). Het molecuulgewicht van fullerenol werd bepaald met behulp van een veld-desorptie (FD) massaspectrometer (AccuTOF, GCx-plus, JEOL, Akishima, Tokio, Japan), en het aantal hydroxylegroepen werd bevestigd als respectievelijk 21 en 46 op basis van de resultaten.

Bacteriële Culturen

E. coli, verkregen uit ons eigen laboratorium, werden gekweekt in voedingsagar van LB (per liter: tryptoon 10 g, gistextract 5 g, natriumchloride 8 g, agar 15 g, en pH afgesteld op 7,5) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) en geïncubeerd bij 37 °C.

Biocompatibiliteitstoets met Kolonievormende Eenheden (CFU) Telmethode

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) werd toegevoegd met materiaal (0-9 μg mL⁻¹), en geïncubeerd gedurende 3 uur bij 37 °C. Na incubatie werd het mengsel gecentrifugeerd en de bacteriépellets gedilueerd (OD₆₀₀ ~ 0,05). Een verdunningsfactor van 10⁻⁵ tot 10⁻⁸ werd vervolgens uitgevoerd in de geïncubeerde bacteriën en geplaat op agarplaten. De platen bleven in een incubator (bij 37 °C) over nacht. Het aantal overlevende bacteriën werd bepaald en uitgedrukt als een percentage (%) dat correspondeerde met de eenheid van CFU mL⁻¹ na incubatie. Data zijn gemiddeldes ± SD (n = 6).

ψ_Δ Meting

Volgens de eerdere studie kan ψ_Δ verkregen worden. ψ_Δ metingen werden uitgevoerd in D₂O bij 355 nm, met behulp van meso-tetra(4-sulfonatofenyl)porfine dihydrochloride (TSPP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) als referentie (ψ_Δ = 0,64).

Fluorescentie QY Meting

De relatieve fotoluminescentie (PL) QY van contraststof is meestal de verhouding van de geëmitteerde fotonen tot de geabsorbeerde fotonen en wordt als volgt gegeven:
$$ \mathrm{QY}={\mathrm{QY}}_{\mathrm{ref}}\ \left({\eta}^2/{\eta_{\mathrm{ref}}}^2\right)\left(I/A\right)\left({A}_{\mathrm{ref}}/{I}_{\mathrm{ref}}\right) $$ (1)
waarbij QY_ref = 0,28 de QY is van Cy5.5 opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) als referentie, η de brekingsindex is van ddH₂O = 1,33 (η_ref van DMSO = 1,48), I de geïntegreerde fluorescentie-intensiteit en A de absorbantie bij de excitatiegolflengte. Een-foton excitatie (OPE) of TPE leveren dezelfde QY op.

Femtoseconde Laser Optisch Systeem voor Metingen van Tweefoton-Absorptie (TPA) en Tweefoton-Luminescentie (TPL)

Een zelfgebouwd femtoseconde titanium-saffier (ti-sa) laser optisch systeem (een herhalingssnelheid van 80 MHz; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, VS) werd gebruikt volgens eerdere studies.

TPA Meting

Met een galvanometerscannersnelheid van 2 m ms⁻¹, werd het excitatiespectrum gemeten als 720-820 nm met een excitatievermogen van 2,8 mW [dit is het vermogen voor het objectief; het vermogen na het objectief (of op monster) is 0,9856 mW of 98,56 nJ pixel⁻¹]. Daarom werden de relatieve TPA-spectra als functie van excitatiegolflengte voor de fullerenolen gemeten.

Meting van TPL Spectra

Het materiaal werd blootgesteld aan TPE van de femtoseconde laser bij een excitatiegolflengte van 760 nm, een scanningsoppervlak van 200 × 200 μm², een frequentie van 10 kHz, een bloottijd van 1,638 s/(scan, pixel) = 100 μs, 128 × 128 pixels scan⁻¹, en een pixeloppervlak van 1562,5 × 1562,5 nm². Het brandpuntsoppervlak werd berekend als πd²/4, waar d = 0,61 λ/numerieke apertuur (NA) de volle breedte op half maximum van de bundeltaille is. Bijvoorbeeld, bij de x–y as brandpunt met 760 nm excitatie en een × 40 olie-immersie objectief met een NA van 1,3, is d = 0,61 × 800 nm/1,3 = 375,38 nm = 0,37538 μm, en de z-as resolutie werd gemeten als 0,90159 μm. Voor 760 nm excitatie wordt de bloottijd per scan voor een individueel nanomateriaal uitgedrukt als (brandpuntsoppervlak/pixeloppervlak) × 100 = 4,0776 ms, en de totale bloottijd t = 4,0776 ms × aantal scans. Een × 40 olie-immersie objectief (NA 1,3) werd gebruikt om de signalen te verzamelen, en het detektiebereik van de spectrumfotometer was 300-695 nm.

Daarnaast waren de berekeningen van de laserkracht (mW of nJ pixel⁻¹) die op het monster werden gebruikt als volgt. Voor het × 40 olie-immersie objectief (NA 1,3) is de transmissiesnelheid bij 760 nm in golflengte ongeveer 88% in dit optisch systeem, en de laserkracht ging van de uitgang naar het objectief met slechts 40% van de oorspronkelijke uitgangsvermogen door vermogensverlies. Als resultaat is de berekende energie na het objectief (op monster) P_output (mW)*40%*88% = 0,352 × P_output (mW). Bijvoorbeeld, P_output = 2,8 mW, de berekende energie na het objectief (op het monster) is 3,0 mW*40%*88% = 0,9856 mW. Met 10 kHz scansnelheid (elke puls blijft 0,1 ms pixel⁻¹), was de berekende energie op het monster (J pixel⁻¹) ongeveer P_output (mW)*40%*88%*0,1 ms = 0,0352*P_output (J pixel⁻¹). Bijvoorbeeld, P_output = 2,8 mW, de energie (J pixel⁻¹) op monster = 2,8 mW*40%*88%*0,1 ms = 0,09856 μJ pixel⁻¹ = 98,56 nJ pixel⁻¹. De kracht na het objectief (op het monster) werd gebruikt en gemarkeerd door dit manuscript heen.

Meting van TPE Absolute Doorsnede

De absolute doorsnede van TPE werd gemeten via het luminescentiesignaal door middel van femtoseconde laser optisch systeem volgens eerdere studies. De TPL van fluoresceïne en rhodamine B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) moest geverifieerd worden. De resultaten zijn getoond in Fig. 1b en werden verkregen door de afhankelijkheid van de emissie-intensiteit te meten met een excitatievermogensbereik van 704 nJ pixel⁻¹ (7,04 mW) tot 2816 nJ pixel⁻¹ (28,16 mW). Kwadratische afhankelijkheid met exponenten van 2,03 voor fluoresceïne en 2,02 voor rhodamine B werd gemeten voor de toename van het excitatievermogen om de luminescentie van TPE te bepalen. Volgens eerdere studies zijn de actiedoorsnedes van TPE voor fluoresceïne en rhodamine B 36,4 en 68,0 GM (1 GM = 10⁻⁵⁰ cm⁴ s foton⁻¹), respectievelijk, voor 760 nm excitatie. We verwezen ook naar de gratis website https://www.drbio.cornell.edu/cross_sections.html, vriendelijk verstrekt door Prof. Chris Xu (Cornell University, NY, VS). De TPE-actiedoorsnedes voor fluoresceïne en rhodamine B werden berekend als 36,5 en 66,1 GM, respectievelijk (Tabel 1), wat een fout van minder dan 5% aangeeft ten opzichte van die uit Prof. Xu's laboratorium. In deze studie werd rhodamine B gekozen als de standaardreferentie voor het bepalen van de doorsnede, en de berekende absolute doorsnedes van TPE voor de wateroplosbare C₆₀(OH)₂₁ en C₆₀(OH)₄₆ fullerenolen waren ongeveer 1230,51 GM en 1037,21 GM, respectievelijk. De gemeten parameters voor het berekenen van de TPE absolute doorsnedes van monsters zijn getoond in Tabel 3. Geen batch-naar-batch variatie werd waargenomen voor de materialen in tweefotoneigenschappen en tweefoton-fotodynamische capaciteit.

Femtoseconde Laser Optisch Systeem (voor Fluorescentie Levensduur Imaging Microscopie, FLIM)

Een zelfgebouwd femtoseconde ti-sa laser optisch systeem (herhalingssnelheid van 80 MHz; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, VS) werd gebruikt volgens eerdere studies. De levensduurdata en parameter worden gegenereerd met behulp van de driedubbele-exponentiële vergelijkingsfitting terwijl de emissie onder TPE (Ex, 760 nm) wordt gemonitord.

Berekening van Radiatieve en Niet-radiatieve Valsnelheden

PL QY en levensduur zijn beide belangrijke parameters bij het onderzoeken van de emissiekarakteristieken van fluorescente kleurstoffen in diverse omgevingen. De QY (Q) kan als volgt worden uitgedrukt:
$$ Q=\frac{\varGamma }{\varGamma +k} $$ (2)
waarbij Γ de radiatieve valsnelheid is, en k de niet-radiatieve valsnelheid. Fluorescentie levensduur wordt meestal gedefinieerd als de gemiddelde tijd die vereist is voor een elektron in de geëxciteerde toestand om te vervallen naar de grondtoestand. De TPL levensduur τ kan ook gerelateerd zijn aan de valsnelheden en wordt als volgt beschreven:
$$ \tau =\frac{1}{\varGamma +k} $$ (3)
Volgens vergelijkingen (2) en (3) kunnen de radiatieve en niet-radiatieve valsnelheden worden berekend.

Bij de absorptie van een foton, wordt een van de zwak gebonden elektronen van het fluorescente molecuul—een fluorofor—gepromoveerd naar een hoger energieniveau. De fluorofor is dan in een geëxciteerde toestand, A*. Deze toestand is metastabiel; daarom zal de fluorofor terugkeren naar zijn stabiele grondtoestand, A. Dit kan het doen ofwel radiatief door een fluorescentie foton hν te emitteren
$$ A\ast \rightarrow A+ h\nu $$
of niet-radiatief door de geëxciteerde toestandsenergie als warmte te dissiperen:
$$ A\ast \rightarrow A+\mathrm{warmte} $$
De depopulatie van de geëxciteerde toestand hangt af van de beschikbare de-excitatiemogelijkheden. Fluorescentie is radiatieve deactivatie van het laagste vibrationele energieniveau van de eerste elektronisch geëxciteerde singulettoestand, S₁, terug naar de elektronische grondtoestand, S₀. De singulettoestanden zijn de energieniveaus die kunnen worden bevolkt door het zwak gebonden elektron zonder een spinkanteling. De absorptie- en emissieprocessen worden geïllustreerd door een energieniveaudiagram genaamd naar Aleksander Jablonski.

De fluorescentie levensduur, τ, is de gemiddelde tijd dat een fluorofor in de elektronisch geëxciteerde toestand S₁ blijft na excitatie. τ wordt gedefinieerd als de inverse van de som van de snelheidsparameters voor alle geëxciteerde toestand depopulatieprocessen: Verg. (3), waar de niet-radiatieve snelheidsconstante k de som is van de snelheidsconstante voor interne conversie k_ic en de snelheidsconstante voor intersystem crossing naar de triplettoestand k_isc zodanig dat k = k_ic + k_isc. Fluorescentie-emissie vindt altijd plaats vanuit het laagste vibrationele niveau van S₁, een regel bekend als de regel van Kasha, wat aangeeft dat de fluorofor geen geheugen heeft van zijn excitatiepad; bijvoorbeeld, OPE en TPE leveren hetzelfde fluorescentiespectrum, QY en levensduur op.

Bepaling van Bacteriële Levensvatbaarheidssnelheden na Laserblootstelling

CFU Telmethode

Bacteriën (OD₆₀₀ ~ 0,05) werden toegevoegd met materiaal (3 of 6 μg mL⁻¹) door te incuberen gedurende 3 uur bij 37 °C in duisternis. Na incubatie werd het mengsel gecentrifugeerd en de bacteriépellets gedilueerd (OD₆₀₀ ~ 0,05) en blootgesteld aan een TPE-vermogen van 211,2 nJ pixel⁻¹ met 800 scans (ongeveer 3,2621 s totale effectieve bloottijd; Ex, 760 nm). Vervolgens werd een verdunningsfactor van 10⁻⁵ tot 10⁻⁸ uitgevoerd in de geïncubeerde bacteriën en geplaat op agarplaten. De platen bleven in een incubator (bij 37 °C) over nacht. Het aantal overlevende bacteriën werd bepaald en uitgedrukt als een percentage (%) dat correspondeerde met de eenheid van CFU mL⁻¹ na incubatie. Data zijn gemiddeldes ± SD (n = 6).

LIVE/DEAD Kit

Bacteriën (OD₆₀₀ ~ 0,05) werden toegevoegd met materiaal (3 of 6 μg mL⁻¹) door te incuberen gedurende 3 uur bij 37 °C in duisternis. Na incubatie werd het mengsel gecentrifugeerd en de bacteriépellets gedilueerd (OD₆₀₀ ~ 0,05) en blootgesteld aan een TPE-vermogen van 211,2 nJ pixel⁻¹ met 800 scans (ongeveer 3,2621 s totale effectieve bloottijd; Ex, 760 nm). Vervolgens werden de pellets gekleurd met een LIVE (SYTO 9, weergegeven met groene fluorescentie)/DEAD (propidium iodide, PI, weergegeven met rode fluorescentie) kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) volgens de instructie. De levensvatbaarheid van bacteriën werd gekwantificeerd voor antimicrobiële tests, die lieten zien dat bijna alle nanomateriaal-behandelde bacteriën dood waren na behandeling. Vergelijkbare levensvatbaarheid werd gekwantificeerd door de CFU telmethode om de efficiënte antibacteriële effecten van materialen in PDT te bepalen. Data worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 6).

ROS Detectie

Enkeltzuurstof (¹O₂)

(a) Materiaal (3 of 6 μg mL⁻¹) werd behandeld met bacteriën (OD₆₀₀ ~ 0,05), waarna het 3 uur incubatie bij 37 °C in duisternis onderging. Vervolgens werd het mengsel blootgesteld aan TPE foto-excitatie (211,2 nJ pixel⁻¹, 800 scans; Ex, 760 nm) en tenslotte gemengd met Enkeltzuurstof Sensor Groen (SOSG) reagent (1 μM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) (Ex/Em: 488/525 nm). Een fluorescentiespectrometer werd gebruikt voor metingen. Voor ROS-neutralisatie werd het mengsel gemengd met 30 ppm antioxidant α-tocopherol/methyl linoleaat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) in duisternis en blootgesteld aan TPE foto-excitatie met dezelfde behandeling. (b) Materiaal (3 of 6 μg mL⁻¹) werd behandeld met bacteriën (OD₆₀₀ ~ 0,05), waarna het 3 uur incubatie bij 37 °C in duisternis onderging. Vervolgens werd het mengsel blootgesteld aan TPE foto-excitatie (211,2 nJ pixel⁻¹, 800 scans; Ex, 760 nm) en tenslotte gemengd met 10 μM van trans-1-(2′-methoxyvinyl)pyreen (t-MVP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS)/0,10 M SDS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) (Ex/Em: 352/465 nm). Voor ROS-neutralisatie werd het mengsel gemengd met 30 ppm antioxidant α-tocopherol/methyl linoleaat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) in duisternis. Reactie van t-MVP met ¹O₂ levert een dioxetaan-intermediair op dat fluorescentieert terwijl het ontbindt in 1-pyreencarboxaldehyde. Bovendien reageert deze hoogst selectieve fluorescente sonde niet met andere geactiveerde zuurstofsoorten zoals hydroxyradicalen, superoxide of waterstofperoxide. Een fluorescentiespectrometer werd gebruikt voor metingen. ROS-neutralisatie werd uitgevoerd met dezelfde als eerder beschreven behandeling.

Superoxide Radicaal Anion (O₂^·−)

(a) Materiaal (3 of 6 μg mL⁻¹) werd behandeld met bacteriën (OD₆₀₀ ~ 0,05), waarna het 3 uur incubatie bij 37 °C in duisternis onderging. Vervolgens werd het mengsel blootgesteld aan TPE foto-excitatie (211,2 nJ pixel⁻¹, 800 scans; Ex, 760 nm) en tenslotte gemengd met 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT, 0,45 mM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS). Het doel van dit materiaal was dat het interageerde met O₂^·− en XTT-formazan produceerde, wat resulteerde in sterke absorptie (470 nm in golflengte). UV-vis spectrometer werd gebruikt om deze absorptie te monitoren. Voor ROS-neutralisatie werd het mengsel gemengd met 30 ppm antioxidant α-tocopherol/methyl linoleaat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) in duisternis en blootgesteld aan TPE foto-excitatie met dezelfde behandeling. (b) Materiaal (3 of 6 μg mL⁻¹) werd behandeld met bacteriën (OD₆₀₀ ~ 0,05), waarna het 3 uur incubatie bij 37 °C in duisternis onderging. Vervolgens werd het mengsel blootgesteld aan TPE foto-excitatie (211,2 nJ pixel⁻¹, 800 scans; Ex, 760 nm) en tenslotte gemengd met 50 mM bicarbonaatbuffer (pH 8,60) en glutathion (γ-l-glutamyl-l-cysteinyl-glycine, GSH, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS)/0,80 mM bicarbonaatbuffer (de Ellman's assay voor O₂^·− detectie). Vervolgens werden de volgende experimenten uitgevoerd volgens de procedure in een eerdere studie. Verlies van GSH (%) werd berekend als het verschil in absorbantie tussen het monster en negatieve controle gedeeld door de absorbantie van de negatieve controle. Het signaal van de gegenereerde O₂^·− werd verkregen zoals beschreven in de vorige berekening. Data zijn gemiddeldes ± SD (n = 6).

Opname-assay

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) werden geïncubeerd met 3 μg mL⁻¹ materiaal. De absorbantie van een hoeveelheid van 3 μg mL⁻¹ materiaal werd vastgelegd door UV-vis spectroscopie (Abs, ongeveer 203 nm). De materialen werden gemengd met E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) bij 37 °C van het 1e uur tot het 10e uur, respectievelijk, en gecentrifugeerd (1200 toer/min) om overbodige materialen te verwijderen en het supernataant te behouden en de absorbantie te meten. Het verschil in absorbantie tussen het verzamelde supernataant en de oorspronkelijke materialen werd geschat, wat resulteerde in het percentage opname op elk tijdstip. Data zijn gemiddeldes ± SD (n = 6).

Statistische Analyse

De statistische significantie was door de variantieanalyse. De p-waarde werd beschouwd als statistisch significant voor alle behandelingen.

Resultaten en Discussie

Karakterisatie van Wateroplosbare Fullerenol

Wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆ (fullerenol), die bepaald werd als circulair en monodispers, werd gesynthetiseerd in overeenstemming met een eerdere studie. De gemiddelde laterale grootte van de fullerenol was ongeveer 1,13 ± 0,04 nm, bepaald met behulp van lage-vergrotings (Fig. 2a) en HR-TEM afbeeldingen (Fig. 2b). Verder werd vastgesteld dat de fullerenol gunstige kristalliniteit vertoonde samen met een goede roosterafstand, wat correspondeerde met de d-afstand van de fullerenol {1\( \overline{1} \)00} roostervlakken. Deze deeltjes konden echter aggregaten vormen door waterstofbindingen in een aqueous oplossing met een pH van 7,0. De gemiddelde grootte van de gevormde aggregaten was ongeveer 130 nm, onthuld door een DLS-analyse. Bovendien bleven de aggregaten hoogst stabiel gedurende 3 maanden in verschillende fysiologische omgevingen, zoals een pH 7,0 aqueous oplossing, 1× fosfaat-gebufferde zoutoplossing en kweekmedium. In het UV-vis absorptiespectrum van de fullerenol werden absorptiepieken waargenomen op ongeveer 216 en 309 nm, en deze pieken werden toegeschreven aan de π–π* overgang van aromatische C=C bindingen en de n–π* overgangen van de C=O schouder, respectievelijk. De π-electroonovergang in de fullerenol bevatte zuurstof (Fig. 2c), zoals typisch waargenomen voor aqueous dispersies, waardoor de aanwezigheid van de fullerenol bevestigd werd. Additionele karakterisaties werden uitgevoerd met FTIR, XPS en massaspectrometrie om de eigenschappen van de bereide materialen te bevestigen. FTIR werd gebruikt om de blootgestelde functionele groepen van de bereide materialen te analyseren. De analyseresultaten onthulden de volgende kenmerkende materiaalbanden: een C–O rekband op ongeveer 1109 cm⁻¹ (band 1), fenolische C–OH rekband op ongeveer 1271 cm⁻¹ (band 2), tertiaire alcoholische C=O rekband op ongeveer 1422 cm⁻¹ (band 3), C=C rekband op ongeveer 1674 cm⁻¹ (band 4), C=O rekband op ongeveer 1721 cm⁻¹ (band 5), en C–H intermoleculaire waterstofgebonden en carboxylaat O–H rekband op ongeveer 3318 cm⁻¹ (band 6). Verder werd een band van CO₂ interferentie waargenomen. Deze banden onthulden blootgestelde hydroxyle- en carbonylgroepen alsook aromatische C=C bindingen (Fig. 2d). XPS werd uitgevoerd om de oppervlaktechemie van de fullerenol te onderzoeken, die overwegend koolstofatomen bevat. De gedecolveerde C(1s) spectra van de fullerenol onthulden een niet-gezuurstofde ring (C–C/C=C, 286,1 eV), C–O binding (286,9 eV) en C=O binding (288,0 eV). Daarnaast was de O(1s)/C(1s) verhouding ongeveer 35,8% (Fig. 2e). Het molecuulgewicht van de fullerenol werd ook bepaald met behulp van FD massaspectrometrie; het aantal hydroxylegroepen (C–OH) werd bevestigd als 46, wat consistent was met de atomaire verhoudingen en bindingscomposities van de fullerenol samengevat in Fig. 2. Deze karakterisatieresultaten bevestigen de succesvolle synthese van fullerenol.

ROS Generatie van Wateroplosbare Fullerenol onder TPE

Een PS absorbeert en overdraagt lichtenergie aan andere niet-absorberende moleculen om ROS te genereren, die doelcellen doden, tumorvasculatuur schaden en een antitumor immuunrespons activeren. PS's hebben een specifieke rangschikking van elektronen in hun moleculaire orbitalen. Vergelijkbaar met bijna alle moleculen, hebben PS's in de grond (singulet) toestand paren elektronen met tegengestelde spinnen in lage-energie moleculaire orbitalen. De absorptie van licht bij een geschikte golflengte tillift een elektron naar een hoog-energie orbitaal zonder de spin te veranderen. Dit is een kortlevende (nanoseconden) geëxciteerde singulet (S₁) toestand, en de PS kan zijn energie verliezen en terugkeren naar de grondtoestand door licht te emitteren (fluorescentie) of warmte. Alternatief kan intersystem crossing, waarbij de spin van het geëxciteerde elektron wordt omgekeerd, optreden in de S₁ toestand. Deze elektronspininversie is verantwoordelijk voor de relatief lange levensduur (duurende microseconden) van de geëxciteerde triplettoestand (T₁). Radiatieve triplett-naar-singulet overgangen zijn geïnhibeerd omdat ze een verandering in elektronspin vereisen, wat een langzaam proces is. Vanaf de T₁ toestand kan de PS terugkeren naar de grondtoestand door licht te emitteren (fosforescentie) of energie over te dragen aan een ander molecuul. Het kan ook energie verliezen door interne conversie of stralingsloze overgangen bij botsing met andere moleculen. Hoe langer de levensduur van de PS in de T₁ toestand is, hoe groter de kans op botsing met een ander molecuul, wat resulteert in ROS-productie. De fotosensitisering van wateroplosbare fullerenolen resulteert in hun overgang naar een langlevende T₁ toestand en daaropvolgende energie- of elektronoverdracht aan moleculaire zuurstof, wat ROS oplevert zoals ¹O₂ en O₂^·−, die een grote rol spelen in PDT. Daarom moeten ¹O₂ en O₂^·− geproduceerd door wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆ direct worden gedetecteerd met laserbestraling. Om ¹O₂ en O₂^·− vorming tijdens PDT te detecteren, werd in deze studie PDT geïnitieerd door geëxciteerde triplette wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆, zuurstof en licht geconfigureerd op een geschikte golflengte en energie te combineren alsook door SOSG, t-MVP, XTT en GSH reagentia toe te voegen. Om het potentiële bactericide vermogen van de materialen te benutten, werd een golflengte van ongeveer 760 nm bepaald als het meest efficiënt voor het afleiden van de relatieve maximale TPA-verhouding van de wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆ onder TPE (Fig. 3a); dit is toe te schrijven aan de interbandovergangen betrokken. Deze golflengte werd gebruikt in volgende experimenten in deze studie. De wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆ werd gefoto-exciteerd via TPE bij een vermogen van 211,2 nJ pixel⁻¹ met 800 scans (Ex, 760 nm; totale effectieve bloottijd, ~ 3,2621 s) en een toegediende dosis van 3 of 6 μg mL⁻¹. Verder, om de betrokkenheid van ROS in de PDT-effecten van de wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆ te bevestigen, werd α-tocopherol gebruikt voor ROS-neutralisatie. De hoeveelheid gegenereerde ROS werd verminderd na toevoeging van α-tocopherol, maar de waargenomen bacteriële levensvatbaarheid nam toe zoals verwacht. Bovendien hing de hoeveelheid gegenereerde ROS af van de toegediende dosis. Om ¹O₂ en O₂^·− productie mogelijk veroorzaakt door onopzettelijke blootstelling van wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆ aan wit licht—wat de experimenten in deze studie had kunnen compromitteren—te voorkomen, werden volgende PDT-experimenten in het donker uitgevoerd. Deze studie richtte zich op de hoeveelheden gegenereerde ¹O₂ en O₂^·−. De wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆ vertoonde aanzienlijke antibacteriële effecten, wat haar potentieel voor toepassing in PDT aantoont. Opmerkelijk was dat na hetzelfde experiment de wateroplosbare C₆₀(OH)₂₁ minder effectief was in het vormen van ¹O₂ en O₂^·− vergeleken met de wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆. De wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆ genereerde meer ¹O₂ en O₂^·− dan de wateroplosbare C₆₀(OH)₂₁; daarnaast hadden de wateroplosbare C₆₀(OH)₄₆ en wateroplosbare C₆₀(OH)₂₁ Φ_Δ waarden van ongeveer 0,93 en 0,85, respectievelijk (voor referentie, Φ_Δ = 0,64 is de QY van TSPP opgelost in D₂O).