Detectie van microRNA-335-5p op een interdigitated elektrode-oppervlak voor bepaling van de ernst van abdominale aorta-aneurysma's

Resultaten en discussie

Vervaardiging van de IDE-sensor en oppervlakteanalyse

De huidige studie gebruikte miRNA-335-5p als hulpmiddel om de ernst van AAA op te helderen door interactieve analyse op een interdigitated electrode (IDE) sensor (Fig. 1). Voor de interactieve analyse met de sonde en het doelwit ontworpen uit de volledige lengte van miRNA-335-5p, werd een IDE-oppervlak ontworpen en vervaardigd met behulp van conventionele fotolithografische technieken. Stapsgewijze oppervlaktemodificaties werden uitgevoerd en gemeten met een ampèremeter (Fig. 2b, c). De maskeruitlijning ontworpen voor de fabricage van IDE en de uniformiteit werden bevestigd door 3D-nanoprofilometrie-analyse met hoge resolutie. Deze waarneming bevestigde dat de fabricage en de afstand tussen elke vinger goed waren uitgelijnd (figuur 2d). IDE's hebben een elektrodegrootte van ~ 100 m met een tussenruimte van ~ 85 m, en er wordt een groot geïntercaleerd netwerk met miljoenen biomarkers in serie/parallel gevormd. Om het succes van de gefabriceerde IDE's te garanderen, hebben we verschillende kale apparaten gebruikt om de reproduceerbaarheid onder het diëlektrische systeem te bepalen. Dit systeem meet de moleculaire trillingen tussen de diëlektrische elektrodes veroorzaakt door het dipoolmoment (Fig. 2c). Deze diëlektrische IDE is een algemeen geaccepteerd systeem dat op grote schaal is gebruikt voor verschillende biomoleculaire en chemische analyses [15, 25,26,27,28]. In deze studie werden alle chemische oppervlaktemodificaties en interactieve analyses gemeten door de IV-stroommodus.

Vertegenwoordiging van de detectie van miRNA-335-5p op een IDE. De ontworpen sonde en het doel worden getoond samen met de duplex-formatie op het IDE-oppervlak

Oppervlaktemetingen op een IDE. een Meet stappen. b Meetmodus. Het IDE-patroon en het verbindingssysteem worden getoond. Er wordt ook een diëlektrische meting weergegeven. c Oppervlaktemechanisme tijdens meting. Er wordt een dipoolmoment weergegeven. d Het 3D-profiel van de profilometrie van de gefabriceerde IDE

High-Density Surface Molecular Assembly:Streptavidine-Biotine Strategy

Het is aangetoond dat moleculaire hechtingen met hoge dichtheid op het detectieoppervlak of biochips cruciaal zijn en in hoge mate afhankelijk zijn van oppervlaktefunctionalisering [29, 30]. Deze studie was gericht op het bepalen van het juiste oppervlak dat nodig is voor een groot aantal moleculaire accommodaties, wat verplicht is voor genexpressie, ontdekking en moleculaire analyse. Voor deze potentiële toepassingen vereist het genereren van analytische systeemoppervlakken de juiste koppeling van moleculen om ze in geschikte formaten te immobiliseren. Deze materiaaloppervlakken werden bestudeerd om het interactieve oppervlakmechanisme te onderzoeken, aangezien ze goedkoop zijn en verschillende mate van pakkingsdichtheid, morfologie en dikte bieden. Deze bevinding zal de juiste aanhechting van moleculen vergemakkelijken en het verlies van biomoleculaire activiteit voorkomen. Bovendien wordt de juiste oriëntatie van biomoleculaire immobilisatie behouden met de juiste secundaire structurele bevestiging.

Om moleculen met een hoge dichtheid op het oppervlak te krijgen, hebben we het oppervlak van silica aanvankelijk grondig gewassen met een alkalische oplossing en deze gemodificeerd met CDI. Om hoge niveaus van biotinyleringsprobes op het CDI-oppervlak te vangen, hebben we de probe geïmmobiliseerd met streptavidine. Streptavidine is een tetravalent eiwit met vier plaatsen om biotine te binden en wordt in de biologische wetenschappen beschouwd als een molecuul met hoge affiniteit [31, 32]. Het oppervlak van IDE had een huidig ​​niveau van 2,08E− 10 A en na de CDI-bijlage werd het verhoogd tot 9,2E− 06 A. Deze bevinding geeft duidelijk aan dat het oppervlak van de IDE gemodificeerd door CDI geschikt is voor onze analyses. Toen streptavidine werd toegevoegd, werd het huidige niveau verder verhoogd tot 2,36E− 05 A. Met behulp van deze strategie hebben we een groter aantal gebiotinyleerde probes geïmmobiliseerd die zijn ontworpen van miRNA-335-5p van volledige lengte op het IDE-oppervlak (Fig. 3a). Biotine-interacties werden uitgevoerd na de blokkeerstap op het IDE-oppervlak om de niet-gereageerde gebieden te maskeren. Bij elke oppervlaktemodificatie werden de veranderingen in de stroom bepaald (figuur 3b). Zoals getoond in figuur 3c, waren de huidige veranderingen na toevoeging van ethanolamine 2,53E− 05 A, en toen 1 nM gebiotinyleerde capture-sequentie werd toegevoegd, werd het niveau van de stroom verlaagd tot 1,29E− 08 A. de stroom bevestigde de immobilisatie van de capture-sonde op het IDE-detectieoppervlak. Over het algemeen draagt ​​een enkelstrengs oligonucleotide een meer negatieve lading met de blootgestelde 5-koolzuurhoudende fosfaatruggengraat (probe), terwijl de nettolading van ethanolamine neutraal is, zoals aangegeven door de leverancier. Dit grote verschil in lading resulteerde in een schijnbare variatie in de gemeten stroom, zoals weergegeven in Fig. 3c. Verder werd deze parameter weer teruggedraaid bij duplexvorming met de doelstreng. Deze bevinding is te wijten aan de vermindering van de blootstelling van de fosfaatruggengraat en de extra positieve ladingen zijn afkomstig van de nucleobasen in de miRNA-streng (Fig. 4a).

een Voorspelde secundaire structuur van miRNA-335-5p. De miRNA-335-5p van volledige lengte wordt weergegeven met de stengel- en lusregio's. Het geselecteerde doelgebied voor de interactieve analyse wordt aangegeven. b IV-metingen op de IDE voor de oppervlaktechemische en biologische modificaties (zwarte cirkel, kaal; rode cirkel, CDI; donkerblauwe cirkel, streptavidine; groene cirkel, ethanolamine). De inzet van de figuur is schematisch weergegeven. c IV-metingen op de IDE voor de sondebevestiging. (groene cirkel, ethanolamine; donkerrode cirkel, sonde). De afbeelding voor de AAA-complicatie wordt weergegeven als de inzet van de figuur

Interactieve analyse van de sonde en het doelwit. een Hogere dosisinteractie van de sonde en miRNA-335-5p (doelwit). (donkerrode cirkel, sonde; zwarte cirkel, doel). b Dosisafhankelijke analyse van miRNA-335-5p. Testen van het lagere femtomolaire tot het lagere nanomolaire bereik. (donkerrode cirkel, sonde; oranje cirkel, 1 fM; blauwe cirkel, 10 fM; groene cirkel, 100 fM; paarse cirkel, 1 pM; roze cirkel, 10 pM; lichtblauwe cirkel, 100 pM; zwarte cirkel, 1 nM)

Dosisafhankelijke interactieve analyse op de IDE

Na bevestiging van de gebiotinyleerde sonde op het detectieoppervlak, werd de interactieve doelanalyse uitgevoerd met verschillende doses. Deze validatie werd uitgevoerd van het lage-femtomolaire tot het lage-nanomolaire bereik. Om dit bereik te garanderen, hebben we de voorlopige analyse uitgevoerd met 1 nM doel-miRNA-335-5p-sequenties. Na toevoeging van 1 nM van de miRNA-335-5p-doelsequentie op het vangsonde-gemodificeerde oppervlak, werd het huidige niveau veranderd van 1,29 E− 08 A in 1,29E− 07 A (Fig. 4a); dit resultaat gaf aan dat hybridisatie optrad tussen de invangprobe en de doelsequentie. Na deze bevestiging hebben we, om de detectielimiet te bepalen, de doelsequentie getitreerd van 1 fM tot 1 nM, die onafhankelijk viel op de vangsonde-gemodificeerde oppervlakken. De huidige veranderingen werden gedetecteerd voor en na immobilisatie. De verschillen in stroom voor de hybridisaties van 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM en 1 nM waren respectievelijk 2,87, 3,87, 5,04, 6,88, 8,59, 11,21 en 11,61E− 08 A. Op basis van de verkregen resultaten werden duidelijke dosisafhankelijke stroomveranderingen gedetecteerd in alle geteste concentraties van de doelsequentie (Fig. 4b).

Hoge analytische prestaties:gevoeligheid, specificiteit en reproduceerbaarheid

Op basis van de bovenstaande resultaten met concentratieafhankelijke stappen werd lineaire regressieanalyse uitgevoerd. De gevoeligheid van de detectie werd geschat met behulp van de 3σ-berekening en deze viel bij 1 fM (Fig. 5a, b). De concentratie was minder dan 1 fM, wat het achtergrondsignaal en lagere waarden liet zien. Verder werd specificiteitsanalyse uitgevoerd om de doelsequenties te onderscheiden van de niet-complementaire en enkelvoudig en drievoudig niet-overeenkomende sequenties. Het was duidelijk dat de ontworpen probe een sterkere reactie vertoonde met de perfecte complementaire miRNA-335-5p-sequenties dan de andere sequenties (Fig. 6a). Een enkelvoudig niet-overeenkomende sequentie resulteerde in een hogere stroomrespons dan de niet-complementaire en drievoudig niet-overeenkomende sequenties vanwege de gedeeltelijke duplexvorming door de enkelvoudig niet-overeenkomende sequentie op de probesequentie. Reproduceerbaarheidsanalyses werden uitgevoerd met alle chemische en biologische modificaties op het IDE-oppervlak in drievoud, en de gegevens werden gemiddeld. De gemiddelde gegevens geven aan dat er geen significante veranderingen waren toen de verschillende experimenten werden uitgevoerd (figuur 6b). Verder werden, om de prestaties van de IDE te ondersteunen, de kenmerken van de momenteel beschikbare methoden vergeleken (tabel 1).

Dosisafhankelijkheid. een Dosisafhankelijke interactie van miRNA-335-5p met de probe. b Lineaire regressieanalyse met verschillende concentraties miRNA-335-5p. LOD werd beschouwd als de laagste concentratie van een analyt tegen het achtergrondsignaal (S/N =3:1)

Hoogwaardige analyse. een Specificiteitsanalyse. Doelsequenties werden onderscheiden van de niet-complementaire en enkelvoudig en drievoudig niet-overeenkomende sequenties. b Reproduceerbaarheidstest. Gemiddelde waarden worden weergegeven met experimenten in drievoud