Nanodetectie van hoofd- en nekkanker op titaniumoxide-detectieoppervlak

Resultaten en discussie

Hoofd-halskanker is beschreven omdat zich verschillende tumoren ontwikkelen in of rond de neus, mond, strottenhoofd en sinussen [28]. Vroege diagnose en behandeling met een geschikte biomarker zijn noodzakelijk om de overlevingskans van patiënten te verbeteren. SCC-Ag werd gevonden als een geschikte serumbiomarker voor hoofd-halskanker; hierin werden de experimenten uitgevoerd om het niveau van SCC-Ag op TiO₂ te detecteren en te kwantificeren -gemodificeerde interdigitated electrode (IDE) sensor door zijn antilichaam. TiO₂ wordt hier gebruikt om de huidige respons tijdens de interactie van biomoleculen te verbeteren. In vergelijking met andere nanomaterialen is TiO₂ wordt als aantrekkelijk beschouwd in de elektrochemische sensor vanwege zijn actieve gedrag op het oppervlak langs elektroden en verbetering van de elektrokatalytische activiteit. Bovendien geeft het meer stabiliteit aan het oppervlak, wat de herhaalbaarheid van de respons door de elektrode oplevert en de detectielimiet verbetert door de piekstroom te verhogen [29,30,31]. Om deze positieve eigenschap te gebruiken, is in dit onderzoek gecoate TiO₂ op het IDE-oppervlak (IDE-TiO₂ ) verbetert de stroom. Een ander nanomateriaal GNS werd gebruikt om anti-SCC-Ag-antilichaam op de IDE-TiO₂ te immobiliseren oppervlak en om de verwijderingslimiet te vergroten. Omdat is bewezen dat een met goud geconjugeerd, met biomolecuul geïmmobiliseerd oppervlak de detectie van het doelwit verbetert [32, 33], werd hier SCC-Ag gedetecteerd en vergeleken met antilichaam en GNS-antilichaam gemodificeerde IDE-TiO₂ oppervlakken. Zoals elders gegeneraliseerd, zal er met een toename van het oppervlak van het nanodeeltje een verbetering zijn in de biomoleculaire hechting. In deze context heeft GNS een groter oppervlak in vergelijking met het bolvormige gouden nanodeeltje. Om dit idee te implementeren, is het huidige experiment uitgevoerd met GNS om de gevoeligheid te verbeteren.

Oppervlaktekarakterisering en GNS-antilichaamimmobilisatie

Afbeelding 1 toont de schematische weergave van het detecteren van SCC-Ag op IDE-TiO₂ voelend oppervlak. Zoals weergegeven in figuur 1a, was het IDE-detectieoppervlak aanvankelijk gecoat met TiO₂ en vervolgens werd antilichaam geïmmobiliseerd met of zonder GNS-conjugatie. Deze met antilichaam gemodificeerde oppervlakken werden gebruikt om het niveau van SCC-Ag te detecteren. Voordat de detectie werd uitgevoerd, werd de conjugatie van GNS met antilichaam bevestigd door UV-Vis-spectroscopie. De GNS-scanprofielen met het gewenste golflengtebereik voor en na conjugatie met antilichaam werden bepaald. Het was duidelijk te zien dat na immobilisatie de verschuiving werd verplaatst van 535 naar 545  nM (figuur 1b). Dit resultaat bevestigt de conjugatie van antilichamen op het oppervlak van het GNS. Aan de andere kant werd het gefabriceerde detectieoppervlak morfologisch waargenomen. Afbeelding 2a geeft het krachtige microscopiebeeld weer, terwijl Fig. 2b het beeld beschrijft dat is vastgelegd met 3D-nanoprofiler-beeldvorming. Beide beeldvormingsprofielen worden duidelijk weergegeven met spleet- en elektrodegebieden, die de vingers vormen. De opstelling van de openingen en vingers leek uniform en intact.

een Schematische weergave voor de detectie van SCC-Ag. IDE-TiO₂ oppervlak werd gemodificeerd tot amine door APTES gevolgd door de immobilisatie van antilichaam of GNS-antilichaam. De aminegroep van APTES reageert een carboxylgroep op het antilichaam. SCC-Ag werd gedetecteerd door de interactie in het antigene gebied en vergeleken. b UV-Vis-spectroscopiemetingen met GNS. Scannen was in het gebied tussen 480 en 560 nM, en de piekmaxima waren ~ 530 nM. GNS met en zonder antilichaam worden aangegeven door de pijlen

een High-power microscopie afbeelding op IDE-oppervlak. Afbeeldingen zijn gemaakt bij × 50. b 3D nanoprofiler-afbeelding op IDE-oppervlak. Afbeeldingen werden vastgelegd bij × 50. Elektrode- en spleetgebieden worden getoond. De gaten zijn aangegeven met sterren. Uniforme arrangementen geven de succesvolle fabricage aan. c Atoomkracht microscopie afbeelding. AFM toont een duidelijk onderscheid tussen TiO₂ en GNS door respectievelijk donkere en lichte vlekken. d Afbeelding van veldemissietransmissie-elektronenmicroscopie. e Energiedispersieve röntgenanalyse. Geeft de elementen aan die op het oppervlak worden gevonden

Vergelijking van antilichaam- en GNS-antilichaamimmobilisatie TiO₂ -IDE-detectieoppervlakken

SCC-Ag werd gedetecteerd op TiO₂ -IDE-oppervlak door antilichaam- of GNS-antilichaam-geïmmobiliseerde oppervlakken. De bevestiging van GNS op TiO₂ oppervlak werd bevestigd door AFM, SEM-waarnemingen en EDX-analyse (Fig. 2c). Onder observatie van de AFM is een duidelijke discriminatie geconstateerd tussen TiO₂ en GNS door respectievelijk donkere en lichte vlekken. Dit werd ondersteund door SEM- en EDX-analyses, waarbij prominente goud- en matige titaniumpieken werden waargenomen. Deze resultaten bewijzen het optreden van GNS op de TiO₂ oppervlakte. Afbeelding 3 toont de immobilisatieprocessen van antilichaam en GNS-antilichaam op de amine-gemodificeerde IDE-TiO₂ oppervlakken voelen. TiO₂ -gemodificeerd IDE-detectieoppervlak toont het huidige niveau als 4.65E−12 (Fig. 3a). Na toevoeging van APTES werd het huidige niveau verhoogd tot 5.37E−11; deze toename in stroom gaf aan dat het oppervlak door APTES in amine was gemodificeerd. Toen het antilichaam werd geïmmobiliseerd, werd het huidige niveau gewijzigd van 5,375E−11 naar 1,05E−9. Het verschil in de stroom werd opgemerkt als 1.04E−9 (Fig. 3a). Deze immobilisatie gebeurde door de chemische interactie van de aminegroep van de APTES- en COOH-groep in het antilichaam [18]. De veranderingen in de stroom bevestigden de binding van antilichaam op het APTES-gemodificeerde oppervlak. Daarna werd het resterende oppervlak bedekt met 1 M ethanolamine om het biofouling-effect van de niet-specifieke binding van biomoleculen op het sensoroppervlak te verminderen. Evenzo werd GNS-antilichaam geïmmobiliseerd op TiO₂ -IDE-oppervlak, en toen GNS-antilichaam werd geïmmobiliseerd op het APTES-gemodificeerde oppervlak, werd het huidige niveau verhoogd van 4.41E−12 naar 1.23E−9 (Fig. 3b). Er werd duidelijk gevonden dat wanneer het antilichaam op het GNS-oppervlak werd geïmmobiliseerd, het een hogere respons vertoonde op het met amine gemodificeerde oppervlak. Dit kan te wijten zijn aan het grotere aantal antilichamen dat bindt aan het oppervlak van enkelvoudig GNS en de sterke binding van dit complex aan het met amine gemodificeerde oppervlak. Deze binding gebeurde doordat de amino-terminale groep in de APTES de citraatgroepen op GNS verdringt en chemisch gefixeerd is op het APTES-gemodificeerde IDE-oppervlak [34]. Het is algemeen bekend dat de detectie van biomoleculen op de detectieoppervlakken hoofdzakelijk afhangt van twee factoren, namelijk de bindingsaffiniteit van interactieve moleculen en de juiste oppervlakte-immobilisatie van moleculen op het detectieoppervlak. Hogere biomoleculaire immobilisatie op het detectieoppervlak verbeterde drastisch de detectie van een doelwit op het lagere niveau. In dit onderzoek werd GNS gebruikt om anti-SCC-Ag-antilichaam op IDE-TiO₂ te immobiliseren oppervlak om de kans op hogere antilichaambinding te vergroten, wat leidt tot efficiënte SCC-Ag-detectie.

Immobilisatieprocessen op IDE-TiO₂ oppervlakken. een Met antilichaam. b Met GNS-antilichaam. Oppervlaktemodificaties werden gestart met 3% APTES, gevolgd door EDC- en NHS-activering om het antilichaam te immobiliseren; 1  M ethanolamine werd gebruikt om het niet-gehechte antilichaamgebied te blokkeren. Voor de metingen werd een lineaire zwaaispanning van 0 tot 2 V bij 0,01  V stapspanning gevolgd. Correcte veranderingen in stroom na elke immobilisatie werden bevestigd dat de binding van antilichaam en GNS-antilichaam op de detectieoppervlakken

Vergelijkende detectie van SCC-Ag op IDE-TiO₂ Oppervlakte door antilichaam of GNS-antilichaam

Aangezien antilichaam GNS de efficiënte immobilisatie op IDE-TiO₂ oppervlak, werd de vergelijkbare 1 nM-concentratie van SCC-Ag gedetecteerd op zowel antilichaam- als GNS-antilichaamoppervlakken en vergeleek de veranderingen in het huidige niveau. Figuur 4a toont 1 nM SCC-Ag-detectie op een met antilichaam gemodificeerd oppervlak. Voordat de detectie werd uitgevoerd, werd het met antilichaam gemodificeerde oppervlak bedekt met het blokkerende middel ethanolamine om niet-specifieke binding van biomoleculen te voorkomen. Ethanolamine toont de huidige verandering als 4.65E−12. Na toevoeging van 1 nM SCC-Ag werd het huidige niveau verhoogd tot 1,33E−09. Deze huidige veranderingen duidden duidelijk op de binding van SCC-Ag aan zijn antilichaam. In het geval van GNS-antilichaamoppervlak, toont de ethanolamine het huidige niveau als 1,33E−11; na toevoeging van 1 nM SCC-Ag werd het verhoogd tot 1,62E−09 (figuur 4b). De huidige veranderingen met GNS-antilichaam waren hoger in vergelijking met alleen met antilichaam gemodificeerd oppervlak voor een vergelijkbare concentratie SCC-Ag. Dit kan te wijten zijn aan het hogere aantal antilichamen dat is gebonden in IDE-TiO₂ oppervlak via GNS.

SCC-Ag-detectie met a antilichaam en b GNS antilichaam. Getest op IDE-TiO₂ oppervlakken met de bovenstaande stappen tot 1 M ethanolamineblokkering. Voor de metingen werd een lineaire zwaaispanning van 0 tot 2 V bij 0,01  V stapspanning gevolgd. Na interactie van 1 nM SCC-Ag werden de huidige niveaus in beide gevallen verhoogd; tegelijkertijd vertoont het een hogere stroomverandering met GNS-antilichaam

Detectielimiet van SCC-Ag op IDE-TiO₂ Oppervlakte door antilichaam of GNS-antilichaam

Met antilichaam of GNS-antilichaam gemodificeerde oppervlakken vertonen een duidelijke detectie van SCC-Ag en de detectielimiet werd ter vergelijking geschat op beide oppervlakken (Figuur 5a, b). Daarvoor werden de concentraties van 10 fM tot 1 nM SCC-Ag verdund en afzonderlijk op deze oppervlakken gedruppeld en de veranderingen in de stroom genoteerd. Figuur 5a toont de verschillende concentraties van SCC-Ag-binding op het met antilichaam gemodificeerde oppervlak. Na ethanolamine interageerde 10 fM SCC-Ag en er was geen huidige verandering opgemerkt. Toen de concentratie werd verhoogd tot 100 fM, was er een kleine verandering in de stroom van 4,65E−12 naar 6,54E−11. Verder werden de concentraties verhoogd tot 1 pM, 10 pM, 100 pM en 1 nM, en de huidige niveaus werden verhoogd als respectievelijk 4.69E−10, 7.91E−10, 8.78E−10 en 1.33E-09. Deze resultaten geven duidelijk aan dat met een verhoging van de concentraties ook de binding toeneemt. De detectielimiet is berekend op basis van 3σ , en het was op 100 fM (Fig. 6a).

Dosisafhankelijke interacties met a antilichaam en b GNS-antilichaam op IDE-TiO₂ oppervlakken. Het oppervlak is met de bovenstaande stappen tot 1 M ethanolamine blokkeert. Voor de metingen werd een lineaire zwaaispanning van 0 tot 2 V bij 0,01  V stapspanning gevolgd. SCC-Ag-concentraties van 10 fM tot 10  nM hadden interactie op beide oppervlakken en de huidige veranderingen werden opgemerkt. Wassen werd uitgevoerd met vijf reactievolumes bij elke stap met 10 mM PBS (pH 7,4). Bij een stijging van de SCC-Ag-concentraties werden in beide gevallen de huidige niveaus geleidelijk verhoogd. GNS-antilichaam toont de huidige veranderingen van 10 fM, terwijl veranderingen van 100 fM werden opgemerkt met alleen antilichaam. In beide gevallen (antilichaam en GNS-antilichaam) vertoonde 1 nM SCC-Ag de verzadiging. Wanneer de concentratie verder wordt verhoogd, konden geen significante veranderingen in de stroom worden waargenomen

Vergelijking van huidige veranderingen met verschillende concentraties SCC-Ag op antilichaam- en GNS-antilichaam-gemodificeerde oppervlakken. een Lineaire regressiegrafiek voor de detectielimiet van SCC-Ag. Met antilichaam (rode lijn) en met GNS antilichaam (blauwe lijn) worden weergegeven. De detectielimiet werd gevonden als 10 fM met GNS-antilichaam en 100 fM met alleen antilichaam. b Huidige veranderingen met SCC-Ag en antilichaaminteractie. Bij alle concentraties werd een hoger niveau van huidige veranderingen gevonden op het oppervlak van het GNS-antilichaam. Voor de metingen werd een lineaire zwaaispanning van 0 tot 2 V bij 0,01  V stapspanning gevolgd. Foutbalk geeft de gemiddelde waarden van drievoud aan (n = 3) met de standaarddeviaties in het bereik van ± 0,1 tot 0,15 × 10 ⁻⁹ A. De detectielimiet (LOD) werd beschouwd als de laagste concentratie van een analyt (van de kalibratielijn bij lage concentraties) tegen het achtergrondsignaal (S /N = 3:1), met andere woorden, LOD = standaarddeviatie van de basislijn + 3σ

Dezelfde concentraties SCC-Ag interageerden onafhankelijk op met GNS-antilichaam gemodificeerde oppervlakken. Toen 10 fM SCC-Ag op het oppervlak viel, veranderde de stroom duidelijk van 1,33E−11 in 3,74E−11. Dit resultaat laat zien dat zelfs 10 fM SCC-Ag duidelijk een interactie kan aangaan met een met GNS-antilichaam geïmmobiliseerd oppervlak, wat niet kan worden gedetecteerd in het geval met alleen antilichaam. Bovendien, toen de concentraties werden verhoogd tot 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM en 1 nM, werden de huidige niveaus verder verhoogd tot 4,69E−10, 9,23E−10, 1,41E−09, 1,48E−09 en respectievelijk 1.62E−09 (Fig. 5b). De statistische berekeningen met de standaarddeviaties liggen in het bereik van ± 0,1 tot 0,15 × 10 ⁻⁹ A. In vergelijking met de waarneming op de twee bovengenoemde oppervlakken, vertoont het met GNS-antilichaam gemodificeerde oppervlak de hogere veranderingen in de stroom met alle geteste concentraties van SCC-Ag (figuur 6b). Gebaseerd op 3σ , het zou de detectielimiet kunnen vinden als 10 fM (Fig. 6a), dit is 10 keer betere (lagere) detectie vergeleken met alleen het met antilichaam gemodificeerde oppervlak. De statistische berekening met de standaarddeviaties ligt in het bereik van ± 0,1 tot 0,15 × 10 ⁻⁹ A. Eerder is SCC-Ag geëvalueerd op verschillende nanomaterialen, zoals strontium-nanodeeltjes en grafeen; deze oppervlakken vertoonden echter een ~ 1000-voudig lagere gevoeligheid in vergelijking met de huidige studie [35].

Selectieve detectie van SCC-Ag op antilichaam/GNS-antilichaam-gemodificeerde oppervlakken

Selectieve detectie van SCC-Ag werd vergeleken met twee controle-eiwitten, namelijk serpine en albumine, die overvloedig in de bloedbaan voorkomen. Serpin is een proteaseremmer die verschillende menselijke fysiologische functies en biologische processen uitvoert, terwijl albumine verantwoordelijk is voor 45 mg mL ⁻¹ en draagt ​​50-70% bij aan het bloedserum. Zoals weergegeven in de figuur, werd 1 nM-concentratie van deze twee controle-eiwitten en SCC-Ag afzonderlijk op het oppervlak-antilichaam of GNS-antilichaam gedruppeld (Fig. 7a); het was duidelijk te zien dat de huidige veranderingen in beide gevallen alleen met SCC-Ag werden opgemerkt, wat aangeeft dat antilichaam alleen SCC-Ag kan herkennen. Er zijn geen significante veranderingen opgemerkt in de stroom met de interactie van controle-eiwitten. Dit experiment bevestigt dat de huidige experimentele opstelling specifiek SCC-Ag kan detecteren/diagnostiseren. Verdere ondersteuning werd geleverd door andere controle-experimenten door de interacties van SCC-Ag met alleen GNS en SCC-Ag met TiO₂ -IDE-oppervlak gecoat met niet-immuun antilichaam-gelabeld GNS. Er waren geen significante veranderingen in de stroom waargenomen in vergelijking met de specifieke interactie (Fig. 7b).

een Selectieve detectie van SCC-Ag op antilichaam- en GNS-antilichaam-gemodificeerde oppervlakken. Interacties met C1-serpin en C-2-albumine werden uitgevoerd. Het oppervlak is met de bovenstaande stappen tot 1 M ethanolamine blokkeert. De waarden werden gemiddeld in drievoud. In beide gevallen herkende het antilichaam alleen de SCC-Ag, wat wijst op de specifieke detectie. b Controle metingen. Specificiteitsinteracties worden vergeleken met niet-specifieke interacties. Er waren duidelijke discriminaties opgemerkt. Voor de metingen werd een lineaire zwaaispanning van 0 tot 2 V bij 0,01  V stapspanning gevolgd. Foutbalk geeft de gemiddelde waarden van drievoud aan (n = 3) met de standaarddeviaties in het bereik van ± 0,1 tot 0,15 × 10 ⁻⁹ EEN