Een pH-geïnduceerd omkeerbaar assemblagesysteem met resveratrol-controleerbare lading en afgifte voor verbeterde tumorgerichte chemotherapie

Resultaten en discussie

Synthese en karakteriseringen van RV@Ft-RGD

RV-belading en afgifte van RV@Ft-RGD werd uitgevoerd via de pH-geïnduceerde omkeerbare demontage en hermontage van Ft (Fig. 1). Ten eerste werd ferritine geconjugeerd met het tumorgerichte peptide RGD om Ft-RGD te vormen. Dit werd vervolgens opnieuw opgelost in een acetaatbuffer (pH =5) om de polypeptidesubeenheden te demonteren en een bol met holle poriën te vormen. RV-moleculen werden vervolgens toegevoegd en mochten de holte binnendringen, waarna de oplossing langzaam werd aangepast tot pH ≈ 7,4 om Ft opnieuw samen te stellen, waarbij de RV-moleculen in de afgesloten Ft-holte werden gevangen. Toen de pH van de buffer vervolgens werd verlaagd tot ~ -5, openden de poriën van de nanodeeltjes omkeerbaar en lieten hun RV-moleculen vrij. Afbeelding 2a en aanvullend bestand 1:Afbeelding S1 tonen de SEM- en TEM-afbeeldingen van de geassembleerde RV@Ft-RGD, die een bolvormige structuur vertoonde. Volgens DLS-analyse hadden RV@Ft-RGD-deeltjes grotere diameters (~ -22,5 nm) in vergelijking met onbewerkte Ft-nanodeeltjes (~ -11,8 nm) (Fig. 2b) en hadden ze vergelijkbare zeta-potentialen als onbewerkte Ft-nanodeeltjes (-29,6 mV) (Fig. 2c). Na 20 dagen vertoonde de polydispersiteitsindex (PDI) van RV@Ft-RGD in water, FBS, celmedia en PBS geen significante verandering (Fig. 2d), wat aangeeft dat RV@Ft-RGD opmerkelijke colloïdale stabiliteit had. Figuur 2e toont de absorptiespectra van vrije RV, Ft-RGD en RV@Ft-RGD. Zoals te zien is, vertoonde het absorptiespectrum van RV@Ft-RGD, vergeleken met dat van RV en Ft-RGD, een nieuwe piek bij 306 nm (afkomstig van RV), wat wijst op de succesvolle belading van RV. Bovendien vertoonde RV@Ft-RGD een vergelijkbare significante emissiefluorescentie als vrije RV bij 400 nm, wanneer geëxciteerd door een laser van 325 nm (Fig. 2f).

Een schematische illustratie van RV@Ft-RGD-voorbereiding en tumorgerichte chemotherapie

een Het TEM-beeld van RV@Ft-RGD. b , c De grootteverdeling en zeta-potentiaalverdeling van Ft-RGD en RV@Ft-RGD. d De PDI-verandering van de RV@Ft-RGD in water, FBS, celmedium en PBS gedurende 20 dagen. e De absorptiespectra van vrije RV, Ft-RGD en RV@Ft-RGD. v De absorptiespectra van vrije RV en RV@Ft-RGD

Drugs laden en vrijgeven

Het maximale laadvermogen van Ft-RGD bleek 252,6% te zijn, waarschijnlijk vanwege de grote holte in de holle Ft-RGD. Omdat Ft pH-gevoelig is, konden we de RV-laadcapaciteit onder verschillende pH-omstandigheden karakteriseren. Zoals getoond in Fig. 3a, nam de efficiëntie van de RV-belading dramatisch af met de toename van de pH van 5,0 naar 8,5. RV-afgifte uit het complex werd ook gekarakteriseerd onder verschillende pH-waarden van 5,0 tot 8,5. Op basis van deze gegevens werd een pH-waarde- en tijdsafhankelijk RV-afgifteprofiel geconstrueerd dat wordt weergegeven in Fig. 3b. De maximale geneesmiddelafgifteverhouding (51,6%) vond plaats in pH =5,0 gedurende 24 uur, wat hoger was dan die in pH =6,5, 7,4 en 8,5. Volgens gerelateerde rapporten zijn pH-waarden van 5,0, 6,5 en 7,4 die typisch gevonden worden in respectievelijk cellysosomen, tumorweefsels, bloed en de normale fysiologische omgeving [31]. Onder fysiologische omstandigheden (pH 7, 4) bleef het RV-geneesmiddelgehalte van RV@Ft-RGD hoog, zelfs na 50 uur (Fig. 3c), wat suggereert dat de RV in RV@Ft-RGD stabiel is en niet gemakkelijk weglekt. Daarnaast hebben we de verandering in diameter van RV @ Ft-RGD onder verschillende pH-omstandigheden onderzocht. Na 12 uur incubatie bij 37 °C toonde DLS-analyse aan dat de diameter van RV@Ft-RGD bijna constant was, rond 23 nm bij pH 8,5 en 7,4. Toen de pH-waarde werd verlaagd tot 6,5 en 5,0, nam de diameter van RV @ Ft-RGD toe tot respectievelijk 25 nm en 28,6 nm (Fig. 3d). Deze resultaten bevestigen het gedrag van pH-geïnduceerde omkeerbare demontage en hermontage van RV@Ft-RGD, wat gunstig is voor de controleerbare medicijnbelading in vitro en medicijnafgifte in tumorweefsel.

een Laadefficiëntie van Ft-RGD in verschillende pH-omstandigheden. b RV-afgifteprofiel van RV@Ft-RGD in verschillende pH-omstandigheden van 5,0 tot 8,5. c De permanente RV in RV@Ft-RGD in fysiologische toestand. d De gemiddelde grootteverandering van RV@Ft-RGD in verschillende pH-omstandigheden van 5,0 tot 8,5

In vitro cellulaire opname en lokalisatie

In vitro cellulaire opname en lokalisatie van RV@Ft-RGD werd vervolgens geëvalueerd. Ten eerste werden RV@Ft en RV@Ft-RGD gelabeld door FITC via waterstofbruginteractie en fysieke absorptie. Zoals getoond in Fig. 4a vertoonden vrije FITC-behandelde cellen verwaarloosbare cytoplasmatische fluorescentiesignalen. Met RV@Ft-RGD behandelde cellen vertoonden daarentegen intense FITC-groene fluorescentie, die hoger was dan die van met RV@Ft behandelde cellen. Met name vertoonden met RV@Ft-RGD behandelde en met RGD voorbehandelde cellen beide een lage groene fluorescentie. Uit deze resultaten kunnen we concluderen dat RV@Ft-RGD in grote hoeveelheden door cellen werd opgenomen, waarschijnlijk door een door RGD gemedieerd actief doelwiteffect. Deze behandelde cellen werden ook geanalyseerd door FCM, waarvan de resultaten worden getoond in Fig. 4b. Statistische resultaten van de cellulaire fluorescentie-intensiteit suggereren een vergelijkbare conclusie.

een Fluorescentiebeelden van A549-cellen na incubatie met respectievelijk vrij FITC en FITC met het label RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD en RV@Ft-RGD. Schaalbalk =60 m. b FCM-meting van cellulaire FITC-fluorescentie-intensiteiten in A549-cellen na incubatie met respectievelijk vrij FITC en FITC-gelabeld RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD en RV@Ft-RGD. c Co-lokalisatiecoëfficiënt van cellulaire fluorescentie van FITC en Lyso Tracker Red. **P <0,01, respectievelijk vergeleken met andere groepen

Om de organellokalisatie van RV@Ft-RGD te bestuderen, werd een lysosoom-specifieke kleurstof (Lyso Tracker Red) gebruikt om de cellen te kleuren die waren geïncubeerd met de nanodeeltjes. Zoals te zien is in Fig. 4a, vertoonde het cytoplasma in alle groepen een sterke rode fluorescentie. Na samenvoeging met FITC groene fluorescentie, vertoonde RV@Ft-RGD een zeer intense gele (groene + rode) fluorescentie in het cytoplasma van deze groepen. Op basis van statistische analyse had de met RV@Ft-RGD behandelde groep de hoogste co-lokalisatiecoëfficiënt tussen FITC en Lyso Tracker Red-fluorescentie (figuur 4c). Deze resultaten geven aan dat RV@Ft-RGD actief cellen kan binnendringen en vervolgens kan worden overgebracht naar de zure omgeving van het lysosoom (pH ≈ 5,0). Deze verdiensten, samen met de pH-responsieve medicijnafgifte, geven RV@Ft-RGD veel potentiële toepassingen voor in vivo tumortherapie.

In vitro biocompatibiliteit en tumortherapie

Voorafgaand aan het bestuderen van de antitumoreigenschappen van RV@Ft-RGD, werd de cytotoxiciteit van de Ft-RGD-drager onderzocht. Zoals getoond in Fig. 5a en Aanvullend bestand 1:Figuren S2 en S3, vertoonde Ft-RGD geen duidelijke onderdrukking van de levensvatbaarheid van longkanker A549-cellen en NCI-H358-cellen bij concentraties tot 1 mg/ml. Celmorfologie vertoonde ook geen significante verandering wanneer de met 1 mg / ml behandelde cellen werden vergeleken met de controlegroepen (Fig. 5b), wat duidelijk suggereert dat Ft-RGD als drager uitstekende biocompatibiliteit had. Zoals getoond in Fig. 6a, b, doden vrij RV, RV@Ft en RV@Ft-RGD alle cellen op een concentratieafhankelijke manier. Met RV@Ft-RGD behandelde cellen vertoonden meer afname van de levensvatbaarheid en hadden slechts 11,2% cellevensvatbaarheid in groepen van 40 g/ml, wat lager was dan met RV@Ft en RV@Ft-RGD + RGD voorbehandelde groepen. Een voorlopige studie met FCM onthulde verder dat met ofwel RV alleen, RV@Ft, of RV@Ft-RGD, de meerderheid van de celdood werd gemedieerd via apoptose (Fig. 6c). Deze resultaten tonen aan dat het tumorceldodende effect van RV sterk werd versterkt door lading in Ft-RGD, voornamelijk als gevolg van verhoogde accumulatie van RV@Ft-RGD in het lysosoom, waar zure pH-conditie een verhoogde afgifte van apoptose-bevorderende RV veroorzaakte. in het cytoplasma [32, 33].

een In vitro cytotoxiciteit tegen A549-cellen behandeld met verschillende concentraties Ft-RGD gedurende 24 uur. b Het microscoopbeeld van A549-cellen na een behandeling van 24 uur met 1 mg/ml Ft-RGD

een Levensvatbaarheid van de cellen van verschillende concentraties van met RV behandelde A549-cellen. b Levensvatbaarheid van cellen van cellen die zijn behandeld met RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD en RV@Ft-RGD met verschillende concentraties van RV. c Celapoptose van A549-cellen behandeld met PBS (controle), RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD en RV@Ft-RGD door middel van flowcytometrie. **P <0,01, respectievelijk vergeleken met andere groepen

Bloedhalfwaardetijd van RV@Ft-RGD

RV-concentratie in bloedplasma op verschillende tijdstippen na injectie werd onderzocht in respectievelijk vrije RV- en RV@Ft-RGD-behandelde groepen. Zoals getoond in Fig. 7a was de bloedhalfwaardetijd van RV@Ft-RGD 5,1 ± 0,23 uur. Vrije RV had een snellere uitspoeling uit de bloedsomloop, met een bloedhalfwaardetijd van slechts 0,43 ± 0,11 uur. De aanzienlijk verlengde halfwaardetijd van RV@Ft-RGD in het bloed is gunstig voor het verbeteren van de geneesmiddelretentie in de systemische circulatie en vergemakkelijkt de accumulatie van geneesmiddelen op tumorplaatsen.

een Omlooptijd van vrije RV en RV@Ft-RGD in bloed. b Het groeiprofiel van A549 xenografted tumoren na driemaal intraveneuze injectie van zoutoplossing (controle), RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD en RV@Ft-RGD. Rode pijl geeft het injectietijdstip aan. **P <0,01, vergeleken met respectievelijk andere groepen. c Lichaamsgewicht van tumordragende muizen na verschillende behandelingen. d Microfoto's van H &E-gekleurde tumorplakken verzameld uit verschillende groepen muizen na het einde van de behandeling. Schaalbalken zijn 50 m

In vivo antitumoreffect en systemische toxiciteit van RV@Ft-RGD

Figuur 7b toont het tumorgroeiprofiel van tumordragende muizen met verschillende behandeling, uitgedrukt als relatief tumorvolume. De tumorgroei werd tot op zekere hoogte geremd bij behandeling met RV@Ft, waarschijnlijk vanwege de lage opname van RV@Ft. In de met RV@Ft-RGD behandelde groep werd de tumorgroei echter significant onderdrukt in vergelijking met de andere groepen (controle, RV, RV@Ft en RV@Ft-RGD + RGD). Tijdens de behandeling was er geen merkbaar verlies van lichaamsgewicht in een experimentele groep (Fig. 7c), wat wijst op de hoge biologische veiligheid van RV@Ft-RGD. Na het einde van de behandelingskuur werd H&E-kleuring van tumorweefsel in deze groepen uitgevoerd om de chemotherapeutische effecten te onderzoeken. Zoals getoond in Fig. 7d, werd een groot gebied van apoptose waargenomen in tumoren die waren behandeld met RV@Ft-RGD, wat in significant contrast staat met slechts een klein gebied van apoptose in tumoren behandeld met vrij RV, RV@Ft en RV@ Voet-RGD + RGD. Bovendien werd de systemische toxiciteit van RV@Ft-RGD ook geëvalueerd bij normale muizen. Volbloedmonsters van met zoutoplossing en RV@Ft-RGD behandelde gezondheidsmuizen werden 0, 10 en 45 dagen na injectie verzameld voor bloedanalyse. Zoals getoond in Fig. 8a, b, vertoonden de volledige bloedtellingen (WBC, RBC, HGB, MPV, MCH, HCT, MCV, PLT en MCHC) van met RV@Ft-RGD geïnjecteerde muizen geen significante verschillen van 0 dag tot 45 dagen. De belangrijkste organen van gezonde muizen die met zoutoplossing en RV@Ft-RGD waren behandeld, werden ook na 45 dagen verzameld voor H&E-kleuring. Er werden geen duidelijke bijwerkingen gevonden in deze weefsels (Fig. 8c), wat wijst op verwaarloosbare nadelige toxiciteit op lange termijn. Al deze resultaten demonstreren het veelbelovende potentieel van RV@Ft-RGD voor verbeterde kankerchemotherapie in vivo.

een Bloedanalyse van gezonde muizen behandeld met RV@Ft-RGD gedurende 45 dagen. b Afbeeldingen van H&E-gekleurde belangrijke organen van gezonde muizen die gedurende 45 dagen met RV@Ft-RGD werden behandeld. c De HE-kleuring brengt belangrijke organen in controle en met RV@Ft-RGD behandelde groepen in beeld. Schaalbalken zijn 50 m